本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及圓紅冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)的啟動子終止子及其用途，包括基因工程菌株構(gòu)建所必需的轉(zhuǎn)化方法等。

背景技術(shù)：

微生物是自然界中分布最廣泛的物種之一，具有卓越的生物合成能力，幾乎能合成地球上所有的有機化學(xué)品。與多細胞生物相比，微生物的代謝途徑雖然相對簡單，但其化合物的生產(chǎn)高效、快捷，具有反應(yīng)條件溫和、可控性強、易于大規(guī)模生產(chǎn)等特點，可作為一個優(yōu)良的細胞工廠。

自然界中一部分微生物在特定條件下(如氮源缺乏)能在胞內(nèi)貯存超過其細胞干重20％的油脂，其中以甘油三酯為主，具有這種表型的微生物稱為產(chǎn)油微生物，包括細菌、酵母、霉菌、藻類等(Ratledge,C.and Wynn,J.P.Adv Appl Microbiol,2002,51,1-51.)。利用微生物轉(zhuǎn)化生物質(zhì)資源生產(chǎn)油脂，可發(fā)展成基本不依賴耕地、可連續(xù)生產(chǎn)、降低農(nóng)業(yè)污染、資源綜合利用的新技術(shù)，是形成化學(xué)品的石化資源替代品新的生產(chǎn)途徑(趙宗保.中國生物工程雜志,2005,25,8-11.)。做為某一化學(xué)品的天然生產(chǎn)菌株或環(huán)境治理應(yīng)用菌株，其特定的生產(chǎn)性能往往并非最優(yōu)化。如何優(yōu)化或改變工業(yè)菌株的代謝網(wǎng)絡(luò)和表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以提高生物基產(chǎn)品的積累速度或定向控制靶產(chǎn)品的質(zhì)量，是當今生物技術(shù)領(lǐng)域基因工程改造的熱點和難點。雖然對于一些常規(guī)酵母的基因工程改造已經(jīng)較為成熟(Alper H,Stephanopoulos G.Nat Rev Microbiol,2009,7,715-723.)，但是對于這些非常規(guī)產(chǎn)油酵母的遺傳操作尚處于起步階段，許多非常規(guī)產(chǎn)油酵母沒有合適的基因操作平臺。開發(fā)合適的基因操作方法，對于這些非常規(guī)微生物的應(yīng)用意義重大。

圓紅冬孢酵母屬于擔(dān)子菌門異宗配合型真菌，是發(fā)酵工業(yè)中一種極為重要的微生物，可利用源于生物質(zhì)的己糖和戊糖為原料生產(chǎn)重要的生物基產(chǎn)品：微生物油脂，胞內(nèi)油脂可達細胞干重的60％以上(Ratledge C,Wynn J P.Adv.Appl.Microbiol.2002,51:1-51；Li Y,Zhao Z,Bai F.Enzyme Microb.Technol.2007,41(3):312-317)；工業(yè)用酶或藥物合成用酶如磷酸二酯酶、苯丙氨酸解氨酶(Hodgins D S.J Biol.Chem.1971,246(9):2977-2985；Gilbert H J,Clarke I N,Gibson R K,et al.J Bacteriol.1985,161(1):314-320)、D氨基酸氧化酶(Gadda G,Negri A,Pilone M S.J Biol.Chem.1994,269(27):17809-17814；Liao G J,Lee Y J,Lee Y H,et al.Biotechnol.Appl.Biochem.1998,27(Pt1):55-61)等以及β-胡蘿卜素和胞外多糖；并在污水處理和生物制藥中有較廣泛的應(yīng)用。實驗結(jié)果表明，該菌可同時利用五碳糖和六碳糖為底物，抗逆性好，能直接以玉米秸稈酸水解液為碳源積累油脂，可實現(xiàn)生物質(zhì)到生物基產(chǎn)品的高效轉(zhuǎn)化(李永紅,劉波,孫艷,等.中國生物工程雜志,2005,25(12):39-44)。目前R.toruloides功能基因的研究主要通過基因克隆、異源表達和釀酒酵母功能互補分析來進行(Gilbert H J,Clarke I N,Gibson R K,et al.J Bacteriol.1985,161(1):314-320；Liao G J,Lee Y J,Lee Y H,et al.Biotechnol.Appl.Biochem.1998,27(Pt1):55-61)。但要從分子水平上進行R.toruloides油脂積累機制、遺傳發(fā)育、生長代謝和菌株遺傳改造研究，必須具備相應(yīng)的遺傳操作系統(tǒng)。然而對于廣泛分布、工業(yè)應(yīng)用前景良好的R.toruloides而言，由于其特殊分類地位和生化特性以及遺傳操作系統(tǒng)的缺乏，使得其遺傳改良和分子機制研究進展緩慢，目前有效的遺傳操作系統(tǒng)是基于其自身3-磷酸甘油酸激酶啟動子pPGK和甘油醛-3-磷酸脫氫酶GPD啟動子的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化體系(Lin XP,Wang YN,Zhang SF,et al.Fems Yeast Res.2014,14:547–555)。但使用的組成型啟動子無法選擇性調(diào)控某一基因轉(zhuǎn)錄，不適合細胞毒性基因的過表達；同時，代謝工程也需要更多的啟動子和終止子元件可供選擇，以實現(xiàn)某一代謝途徑各基因表達水平的精確調(diào)控。

誘導(dǎo)型啟動子在特定的物理或化學(xué)信號的刺激下，調(diào)控下游基因轉(zhuǎn)錄的啟動和關(guān)閉，對一些細胞毒性基因的遺傳操作尤為重要。葡萄糖去阻遏誘導(dǎo)乙醇脫氫酶Adh2，是糖酵解和乙醛酸循環(huán)中的關(guān)鍵酶，它的合成受到葡萄糖阻遏和去阻遏的調(diào)控，并被證明這種調(diào)控是轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控。ADH2啟動子的誘導(dǎo)無需加入誘導(dǎo)劑或改變培養(yǎng)基，發(fā)酵早中期葡萄糖存在時被抑制，發(fā)酵末期培養(yǎng)液中葡萄糖被耗盡時被誘導(dǎo)，產(chǎn)生大量重組蛋白，非常適合于細胞壁裂解酶等細胞毒性蛋白的生產(chǎn)，有助于胞內(nèi)油脂 綠色抽取工藝的發(fā)展。雖然曾有眾多研究者分離釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或其它子囊酵母的ADH2啟動子、或其它葡萄糖去阻遏誘導(dǎo)啟動子用于其自身的基因工程操作(Hintz WE1,Lagosky PA.Biotechnology(N Y).1993,11(7):815-818.；Weinhandl K,Winkler M,Glieder A,et al.Microb Cell Fact.2014,13:5.；Shen MW,Fang F,Sandmeyer S,et al.Yeast.2012,29(12):495-503.；Lee KM,DaSilva NA.Yeast.2005,22(6):431-440.；李蔚，李育陽.遺傳學(xué)報,1997,24(6):561-568.；喬雪鋒,陸俊杰,肖慈英,等.華東理工大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2013,39(5):559-564)，但該類啟動子無法應(yīng)用于紅冬孢酵母屬(Rhodosoporidium)、鎖擲酵母屬(Sporidiobolus)、擲孢酵母屬(Sporobolomyces)和紅酵母屬(Rhodotorula)中基因表達、遺傳工程操作和菌株改良的基因工程操作。同時，本領(lǐng)域技術(shù)人員周知“不同的微生物在遺傳背景、基因表達模式、生理生化特征方面存在大的差異，即使同為酵母，不同的種屬間也存在很大的差異，例如，同屬子囊菌門的釀酒酵母、畢赤酵母、耶氏解脂酵母，必須分別構(gòu)建其遺傳體系，選擇自身來源啟動子”。然而，啟動子對于遺傳操作系統(tǒng)來說必不可少。因此，分離能夠在這些紅酵母中啟動報告基因表達的半乳糖激酶啟動子成為目前研究的焦點。

終止子序列，是給予RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄終止信號的DNA序列，同時也決定mRNA的穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)錄效率和mRNA從轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的釋放。商業(yè)化酵母表達載體和報道的合成生物學(xué)文獻中，多選擇高表達基因的終止子做為轉(zhuǎn)錄終止元件。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)瓶頸，本發(fā)明的主要目的是提供可通用于紅冬孢酵母屬(Rhodosoporidium)、鎖擲酵母屬(Sporidiobolus)、擲孢酵母屬(Sporobolomyces)和紅酵母屬(Rhodotorula)中基因表達、遺傳工程操作和菌株改良的中外源基因表達的啟動子和終止子，及采用合適的轉(zhuǎn)化技術(shù)對這些紅酵母菌株進行改良的方法。

為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明通過對圓紅冬孢酵母的基因組序列進行分析，獲得響應(yīng)葡萄糖去阻礙誘導(dǎo)的乙醇脫氫酶Adh2啟動子(ADH2p)序列，并進一步通過PCR技術(shù)從圓紅冬孢酵母染色體DNA中成功分離了包含有效啟動子的DNA片段，采用合適的轉(zhuǎn)化方法將含有圓紅冬孢酵母乙醇脫氫酶Adh2啟動子(ADH2p)的外源DNA片段分別導(dǎo)入紅冬孢酵母屬、鎖擲酵母屬、擲孢酵母屬和紅酵母屬中，成功實現(xiàn)了外源基因的表達，完成了本發(fā)明。

本發(fā)明成功分離了能夠在紅冬孢酵母屬、鎖擲酵母屬、擲孢酵母屬和紅酵母屬酵母中啟動報告基因表達的圓紅冬孢酵母半乳糖激酶啟動子(ADH2p)啟動子，并構(gòu)建了其表達載體。

具體講，本發(fā)明包含下述技術(shù)方案(A)到(H)：

(A)本發(fā)明涉及一種具有紅冬孢酵母屬、鎖擲酵母屬、擲孢酵母屬和紅酵母屬轉(zhuǎn)錄啟動子活性的DNA片段，所述DNA片段：

(1)具有如SEQ ID NO：1所示DNA序列的全部序列或包含該DNA序列自3’-末端起500bp以內(nèi)的部分序列，

(2)具有可與如SEQ ID NO：1所示序列的全部或其DNA序列3’-末端起500bp以內(nèi)的部分序列雜交的、且保持轉(zhuǎn)錄啟動子活性的序列，或

(3)對SEQ ID NO：1所示的脫氧核苷酸序列進行一個或或50個堿基以內(nèi)的取代、缺失、插入或添加所獲得的，與SEQ ID NO：1所示序列具有70％以上同源性、且具有啟動子活性的序列。

(B)一種來自圓紅冬孢酵母的DNA片段，所述DNA片段可作為終止子，并且：(1)具有如SEQ ID NO：2所示的DNA序列的全部或包含該DNA序列5’-末端的部分序列；或(2)具有可與如(1)所示序列雜交的、且保持如(1)所述序列活性的序列。

(C)一種可完成靶基因在紅冬孢酵母屬、鎖擲酵母屬、擲孢酵母屬和紅酵母屬酵母中轉(zhuǎn)錄起始和轉(zhuǎn)錄終止的DNA分子，它具有上述(A)所述的具有紅冬孢酵母屬、鎖擲酵母屬、擲孢酵母屬和紅酵母屬酵母轉(zhuǎn)錄啟動子活性的DNA序列，或同時具有上述(A)所述的具有紅冬孢酵母屬、鎖擲酵母屬、擲孢酵母屬和紅酵母屬酵母轉(zhuǎn)錄啟動子活性的DNA序列，和(B)所述的DNA片段，且(B)所述的DNA片段位于(A)所述的DNA序列的下游，與其相鄰1-10000個核苷酸的DNA片段。

(D)一種可將靶基因與(A)-(C)任一種所述的DNA分子連接的DNA表達盒，以便于所述靶基因能夠在紅冬孢酵母屬、鎖擲酵母屬、擲孢酵母屬和紅酵母屬酵母中表達重組的DNA。所述靶基因為蛋白編碼核酸或反義核酸編碼核酸。優(yōu)選地，所述目的基因的cDNA序列具有如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列(半乳糖激酶cDNA)。

(E)一種攜帶(A)-(D)所述的的DNA分子中的任意一個的重組載體。所述載體可以是游離型載體或整合型載體，所述游離型載體例如，但不限于，pMD18-T、pUC18、pYES2c/t或pYX212等，所述整合型載體為農(nóng)桿菌介導(dǎo)的雙元表達載體，例如，但不限于，PZPK或pZP2000等。

(F)一種將如(D)所述的DNA分子或如(E)所述的載體的轉(zhuǎn)入紅冬孢酵母屬、鎖擲酵母屬、擲孢酵母屬和紅酵母屬菌株的轉(zhuǎn)化方法。

(G)一種轉(zhuǎn)入了如(D)所述的DNA表達盒或如(E)所述的重組載體的紅冬孢酵母屬、鎖擲酵母屬、擲孢酵母屬和紅酵母屬的基因工程菌株。

(H)半乳糖激酶(ADH2)啟動子，其特征在于：其來源為圓紅冬孢酵母，可啟動目的基因在紅冬孢酵母屬、鎖擲酵母屬、擲孢酵母屬和紅酵母屬酵母中的轉(zhuǎn)錄和表達，所述啟動子：(1)具有如SEQ ID NO：1所示DNA序列的全部序列或包含該DNA序列自3’-末端起1500bp以內(nèi)的部分序列，(2)具有可與如SEQ ID NO：1所示序列的全部或其DNA序列3’-末端起1500bp以內(nèi)的部分序列雜交的、且保持轉(zhuǎn)錄啟動子活性的序列，或(3)對SEQ ID NO：1所示的脫氧核苷酸序列進行一個或或50個堿基以內(nèi)的取代、缺失、插入或添加所獲得的，與SEQ ID NO：1所示序列具有70％以上同源性、且具有啟動子活性的序列；

本發(fā)明所述的半乳糖激酶終止子，其特征在于：其來源為圓紅冬孢酵母，可終止目的基因在紅冬孢酵母屬、鎖擲酵母屬、擲孢酵母屬和紅酵母屬酵母中的轉(zhuǎn)錄和表達，所述終止子：(1)具有如SEQ ID NO：2所示的DNA序列的全部或包含該DNA序列5’-末端的部分序列，(2)具有可與如SEQ ID NO：2所示序列的全部或其DNA序列5’-末端的部分序列雜交的、且保持轉(zhuǎn)錄終止子活性的序列，或(3)對SEQ ID NO：2所示的脫氧核苷酸序列進行一個或多個堿基的取代、缺失、插入或添加所獲得的，與SEQ ID NO：2所示序列具有70％以上同源性、且具有終止子活性的序列。

使用本發(fā)明的具有啟動子活性的DNA分子和具有轉(zhuǎn)錄終止子活性的DNA，可實現(xiàn)外源基因或內(nèi)源基因在紅冬孢酵母屬、鎖擲酵母屬、擲孢酵母屬和紅酵母屬酵母中的表達。

本發(fā)明提供了用于紅冬孢酵母屬、鎖擲酵母屬、擲孢酵母屬和紅酵母屬酵母菌株遺傳工程改造的啟動子、終止子和載體。為紅冬孢酵母屬、鎖擲酵母屬、擲孢酵母屬和紅酵母屬酵母菌株開啟了一條育種新途徑，并因此可以提供具有工業(yè)用途的新型酵母菌株。

綜上所述，本發(fā)明提供下述技術(shù)方案：

1.葡萄糖去阻礙誘導(dǎo)乙醇脫氫酶Adh2啟動子，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.第1項所述的乙醇脫氫酶Adh2啟動子用于構(gòu)建能夠在c(Rhodosoporidium)、鎖擲酵母屬(Sporidiobolus)、擲孢酵母屬(Sporobolomyces)和紅酵母屬(Rhodotorula)的酵母菌株中表達的重組表達載體應(yīng)用，其中克隆了包含所述乙醇脫氫酶Adh2啟動子的重組表達載體的紅冬孢酵母屬、鎖擲酵母屬和紅酵母屬酵母菌株構(gòu)成紅冬孢酵母屬、鎖擲酵母屬、擲孢酵母屬和紅酵母屬遺傳操作系統(tǒng)。

3.一種DNA表達盒，其含有SEQ ID NO：1所示的乙醇脫氫酶Adh2啟動子的核苷酸序列。

4.第3項所述的表達盒，其還含有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列作為終止子，其中SEQ ID NO：1所示的序列位于SEQ ID NO：2所示的序列的上游，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2之間為編碼目的基因的開放閱讀框架。

5.第4項所述的DNA表達盒，其特征在于：所述編碼目的基因的開放閱讀框架的cDNA序列具有如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。

6.一種包含第3-5項中任一項所述的DNA表達盒的重組載體。

7.第6項所述的重組載體，其特征在于：所述載體為游離型或者整合型載體。

8.第7項所述的重組載體，所述整合型載體為農(nóng)桿菌介導(dǎo)的雙元表達載體，例如PZPK或pZP2000，或者為攜帶有靶基因翼側(cè)1500-4000堿基同源重組臂的同源重組載體，所述同源重組載體骨架或所述游離型載體選自大腸桿菌克隆載體或酵母穿梭載體，優(yōu)選pMD18-T、pUC18、pYES2c/t或pYX212。

9.包含第6-8項中任一項所述的重組載體的宿主細胞為大腸桿菌細胞或酵母細胞。

10.一種用于產(chǎn)油酵母遺傳表達的表達系統(tǒng)，所述表達系統(tǒng)包含：

(1)能夠在紅冬孢酵母屬、鎖擲酵母屬、擲孢酵母屬和紅酵母屬屬菌株中表達的改良載體，所述改良載體通過在能夠在紅冬孢酵母屬、鎖擲酵母屬、擲孢酵母屬和紅酵母屬中整合表達或游離表達的質(zhì)粒中插入SEQ ID NO：1所示的啟動子序列和SEQ ID NO：2所示的終止子序列構(gòu)建獲得，其中SEQ ID NO：1所示的啟動子序列位于SEQ ID NO：2所示的終止子序列的上游，SEQ ID NO：1所示的序 列與SEQ ID NO：2所示的序列之間為多克隆位點，并且所述載體還包含選擇性標記基因；

(2)目的基因開放閱讀框序列，其能夠可操作性地插入到(1)所述的改良載體中，并使所述目的基因與(1)所述的改良載體中的啟動子和終止子符合閱讀框的連接，和

(3)紅冬孢酵母屬、鎖擲酵母屬、擲孢酵母屬和紅酵母屬菌株。

11.第10項的用于產(chǎn)油酵母遺傳表達的表達系統(tǒng)，其中(1)所述的改良載體通過在能夠在紅冬孢酵母屬、鎖擲酵母屬、擲孢酵母屬和紅酵母屬中表達的質(zhì)粒中插入SEQ ID NO：1所示的啟動子序列和SEQ ID NO：2所示的終止子序列構(gòu)建獲得。

12.第11項的用于產(chǎn)油酵母遺傳表達的表達系統(tǒng)，其中(1)所述質(zhì)粒為游離型或者整合型質(zhì)粒，并且，其中所述整合型質(zhì)粒為農(nóng)桿菌介導(dǎo)的雙元表達質(zhì)粒，例如PZPK或pZP2000，并且，所述游離型質(zhì)粒選自pMD18-T、pUC18、pYES2c/t或pYX212。

13.第10項的用于產(chǎn)油酵母遺傳表達的表達系統(tǒng)，其中(3)所述的圓紅冬孢酵母菌株選自圓紅冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)、貝吉維紅冬孢酵母(Rhodosporidium babjevae)，所述鎖擲酵母屬(Sporidiobolus)菌株選自擬粉紅鎖擲孢酵母(Sporidiobolus pararoseus)，所述擲孢酵母屬(Sporobolomyces)菌株選自粉紅擲孢酵母(Sporobolomyces roseus)，所述紅酵母屬(Rhodotorula)菌株選自深紅酵母(Rhodotorula rubra)、膠紅酵母(Rhodotorula mucilaqinosa)、海濱紅酵母(Rhodotorula marina)、禾本紅酵母(Rhodotorula graminis)和粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)。

14.第10項的用于產(chǎn)油酵母遺傳表達的表達系統(tǒng)，其中(2)所述的目的基因開放閱讀框序列具有如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。

本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，術(shù)語“表達系統(tǒng)”是指包括重組載體、待表達的目標蛋白的編碼核苷酸序列、適合的宿主細胞或宿主菌株等的組合物體系，用來在所述宿主細胞或宿主菌株中表達所述目標蛋白。

本發(fā)明的有益效果是：

為紅冬孢酵母屬、鎖擲酵母屬和紅酵母屬的酵母菌提供了啟動子、終止子遺傳轉(zhuǎn)化方法，將有力促進今后的紅冬孢酵母屬、鎖擲酵母屬、擲孢酵母屬和紅酵母屬酵母菌的菌株改良和代謝工程研究。

附圖說明

圖1、ADH2簡并PCR產(chǎn)物(泳道1)的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果圖，泳道M為分子量標準。

圖2、PZPK-ADH2p-hyg-ADH2t載體的結(jié)構(gòu)示意圖，LB，T-DNA左邊界；RB，T-DNA右邊界。

圖3、使用HYG基因轉(zhuǎn)化R.babjevae NCYC 2630獲得重組子的PCR鑒定結(jié)果圖，泳道M為分子量標準，泳道1-6分別表示不同的Hyg抗性轉(zhuǎn)化子，7為野生型對照。

圖4、表示HYG的表達檢測——Western blot分析結(jié)果圖，泳道1-3為R.babjevae NCYC 2630潮霉素轉(zhuǎn)化子1-3號總蛋白；泳道4(WT)為作為陰性對照的出發(fā)菌株R.babjevae NCYC 2630總蛋白樣品。

圖5、BLE抗性Ura3營養(yǎng)缺陷圓紅冬孢酵母重組菌株的轉(zhuǎn)錄水平表達分析——RT-PCR結(jié)果圖，泳道1-7為BLE抗性Ura3營養(yǎng)缺陷圓紅冬孢酵母ATCC 10788重組菌株1-7，泳道8為對照菌株圓紅冬孢酵母ATCC 10788。

圖6、PZPK-ADH2p-hyg-Thsp載體的結(jié)構(gòu)示意圖，LB，T-DNA左邊界；RB，T-DNA右邊界。

圖7、pZPK-ADH2p-MCS-Thsp載體的結(jié)構(gòu)示意圖，LB，T-DNA左邊界；RB，T-DNA右邊界。

圖8、PZPK-HYG-ADH2p-MCS-Thsp載體的結(jié)構(gòu)示意圖，LB，T-DNA左邊界；RB，T-DNA右邊界。

圖9、pZPK-HYG-ADH2p-CpFAH-Thsp載體的結(jié)構(gòu)示意圖，LB，T-DNA左邊界；RB，T-DNA右邊界。

圖10、表示CpFAH的表達檢測——Western blot分析結(jié)果圖，泳道1-3為擬粉紅鎖擲孢酵母JCM 3765潮霉素轉(zhuǎn)化子1-3號總蛋白；泳道4為作為陰性對照的出發(fā)菌株擬粉紅鎖擲孢酵母JCM 3765總蛋白樣品。

圖11、pZPK-HYG-ADH2p-ME-Thsp載體的結(jié)構(gòu)示意圖，LB，T-DNA左邊界；RB，T-DNA右邊界。

圖12、表示RtME的表達檢測——Western blot分析結(jié)果圖，泳道1-3為粉紅擲孢酵母S.roseus JCM 8242潮霉素轉(zhuǎn)化子1-3號總蛋白；泳道4為作為陰性對照的出發(fā)菌株粉紅擲孢酵母S.roseus JCM 8242總蛋白樣品。

圖13、pZPK-HYG-ADH2p-GFP-Thsp載體的結(jié)構(gòu)示意圖，LB，T-DNA左邊界；RB，T-DNA右邊界。

圖14、表示GFP的表達檢測——Western blot分析結(jié)果圖，泳道1-3為重組深紅酵母CGMCC 2.279潮霉素轉(zhuǎn)化子1-3號總蛋白；泳道4為作為陰性對照的出發(fā)菌株重組深紅酵母CGMCC 2.279總蛋白樣品。

圖15、表示GFP的表達檢測——Western blot分析結(jié)果圖，泳道1-3為重組膠紅酵母CGMCC 2.22潮霉素轉(zhuǎn)化子1-3號總蛋白；泳道4為作為陰性對照的出發(fā)菌株重組膠紅酵母CGMCC 2.22總蛋白樣品。

圖16、pZPK-HYG-ADH2p-INU-Thsp載體的結(jié)構(gòu)示意圖，LB，T-DNA左邊界；RB，T-DNA右邊界。

序列表說明

SEQ ID NO：1 RtADH2啟動子，來源于圓紅冬孢酵母

SEQ ID NO：2 RtADH2終止子，來源于圓紅冬孢酵母

SEQ ID NO：3 RtADH2編碼區(qū)

SEQ ID NO：4 RtADH2cDNA

SEQ ID NO：5 RtADH2氨基酸序列

SEQ ID NO：6 HYG

SEQ ID NO：7 ADH2p-hyg-ADH2t

SEQ ID NO：8 Ura3p-ORF-URA3t

SEQ ID NO：9 BLE

SEQ ID NO：10 Ura3p-ADH2p-ble-URA3t

SEQ ID NO：11 Thsp

SEQ ID NO：12 CpFAH

SEQ ID NO：13 RtME

SEQ ID NO：14 LB序列

SEQ ID NO：15 RB序列

SEQ ID NO：16 GFP

SEQ ID NO：17 INU

具體實施方式

在本文中，“啟動子”是指能夠被RNA聚合酶識別、結(jié)合并能啟動基因轉(zhuǎn)錄的DNA序列。術(shù)語“啟動子”還可理解為：包括5’非編碼區(qū)、順式作用元件(如增強子)以及其它能與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的核苷酸序列。

啟動子的存在或強度通常是通過啟動子活性表示，其測定方法：將報告基因(如抗性基因)連接于所述啟動子的下游，并將該DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化相應(yīng)宿主細胞，檢測報告基因是否表達。如果人們觀察到連接于所述啟動子下游報告基因的表達，就可以認為所述啟動子在它所轉(zhuǎn)化的宿主細胞內(nèi)有活性。

在本文中，“終止子”是指染色體上提供終止信號使RNA聚合酶與DNA模板分離而使轉(zhuǎn)錄終止的一段DNA序列?？梢酝ㄟ^“啟動子-報告基因-終止子”構(gòu)建體使報告基因有效表達而確定終止子的活性。

本發(fā)明中的“圓紅冬孢酵母”，包括屬于該“物種”的任何二倍體和單倍體，野生型菌株和營養(yǎng)缺陷型菌株。本發(fā)明中的“紅冬孢酵母屬、鎖擲酵母屬、擲孢酵母屬和紅酵母屬”，沒有具體限制，其實例包括圓紅冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)、貝吉維紅冬孢酵母(Rhodosporidium babjevae)，粉紅鎖擲孢酵母(Sporidiobolus pararoseus)，粉紅擲孢酵母(Sporobolomyces roseus)，深紅酵母(Rhodotorula rubra)，膠紅酵母(Rhodotorula mucilaqinosa)，海濱紅酵母(Rhodotorula marina)，禾本紅酵母(Rhodotorula graminis)和粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)。

本發(fā)明的“目的基因”，包括能夠在紅冬孢酵母屬、鎖擲酵母屬、擲孢酵母屬和紅酵母屬屬菌株中表達的蛋白編碼序列、反義RNA編碼序列和核酸酶編碼序列。能夠在紅冬孢酵母屬、鎖擲酵母屬、擲孢酵母屬和紅酵母屬菌株中表達的蛋白編碼序列的例子包括源于這兩類菌屬中的蛋白或者核酸序列，且并不局限于此，還包括來源于其它微生物、植物和動物的蛋白或者核酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)任意應(yīng)該理解，當使用來源于其它微生物、植物和動物的蛋白編碼序列作為目的基因(即，外源目的基因)時，為優(yōu)化在紅冬孢酵母屬、鎖擲酵母屬、擲孢酵母屬和紅酵母屬菌株中的表達，通常需要針對紅冬孢酵母屬、鎖擲酵母屬、擲孢酵母屬和紅酵母屬菌株的密碼子優(yōu)先性對所述目的基因進行密碼子優(yōu)化。而密碼子優(yōu)化屬于本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)手段。

本發(fā)明中的啟動子：(1)具有如SEQ ID NO：1所示DNA序列的全部序列或包含該DNA序列自3’-末端起500bp以內(nèi)的部分序列，(2)具有可與如SEQ ID NO：1所示序列的全部或其DNA序列3’-末端起500bp以內(nèi)的部分序列雜交的、且保持轉(zhuǎn)錄啟動子活性的序列，或(3)對SEQ ID NO：1所示的脫氧核苷酸序列進行一個或50個堿基以內(nèi)的取代、缺失、插入或添加所獲得的，與SEQ ID NO：1所示序列具有70％以上同源性、且具有啟動子活性的序列。

本發(fā)明中的終止子：(1)具有如SEQ ID NO：2所示的DNA序列的全部或包含該DNA序列5’-末端的部分序列，(2)具有可與如SEQ ID NO：2所示序列的全部或其DNA序列5’-末端的部分序列雜交的、且保持轉(zhuǎn)錄終止子活性的序列，或(3)對SEQ ID NO：2所示的脫氧核苷酸序列進行一個或50個堿基以內(nèi)的取代、缺失、插入或添加所獲得的，與SEQ ID NO：2所示序列具有70％以上同源性、且具有終止子活性的序列。

本發(fā)明中的啟動子-目的基因的構(gòu)建體、目的基因-終止子的構(gòu)建體或啟動子-目的基因-終止子的構(gòu)建體，可以直接或經(jīng)載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)化紅冬孢酵母屬、鎖擲酵母屬、擲孢酵母屬和紅酵母屬菌株，以便于目的基因表達，可以優(yōu)選質(zhì)粒載體作為介導(dǎo)載體。

下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明作進一步說明，將有助于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。下述實施例中所有引物合成及測序工作，如無特別說明則均由大連TakaRa公司完成。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的實驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑公司購買得到的。

R.toruloides CGMCC 2.1389：中國普通微生物菌種保藏中心(CGMCC)，源自東京大學(xué)應(yīng)用微生物研究所(IFO 8766)，由IFO 0559和IFO 0880經(jīng)配合而成的二倍體，等同于CBS 6016或NBRC 8766或NRRL Y-6987。

R.toruloides ATCC 10788：美國標準生物品收藏中心(ATCC)，源自CBS-KNAW fungal biodiversity centre，等同于IFO 0559或JCM 3792或CCRC 20306或DBVPG 6740或IAM 13469或IGC 4416或MUCL 30249或NCYC 921或NRRL Y-1091或VKM Y-334或PYCC 4416。

Rhodosporidium babjevae NCYC 2630購自英國國家酵母菌種保藏中心(National Collection of Yeast Cultures，NCYC)。

擬粉紅鎖擲孢酵母(Sporidiobolus pararoseus)JCM 3765購自于購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)。

粉紅擲孢酵母(Sporobolomyces roseus)JCM 8242購自于日本微生物菌種保藏中心(JCM)。

深紅酵母(Rhodotorula rubra)CGMCC 2.279購自于酵母菌種保藏中心(購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)。

膠紅酵母CGMCC 2.22購自于酵母菌種保藏中心(購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)。

海濱紅酵母(Rhodotorula marina)CGMCC 2.4203購自于酵母菌種保藏中心(購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)。

粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)NCYC 2666購自于英國國家酵母菌種保藏中心(National Collection of Yeast Cultures，NCYC)。

實施例1:圓紅冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)CGMCC 2.1389總RNA的提取

將圓紅冬孢酵母(R.toruloides)CGMCC 2.1389(購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC))由斜面接種到10mL YEPD液體培養(yǎng)基(葡萄糖20.0g/L，酵母提取物10.0g/L，蛋白胨20.0g/L，pH 6.0)中，于30℃搖床培養(yǎng)24h，再以1:50的體積比例將菌液分別轉(zhuǎn)接到100mL YEPD液體培養(yǎng)基中，于30℃搖床培養(yǎng)14h達對數(shù)生長期。在4℃下，5000rpm離心4min，收集菌體，用液氮迅速冷凍菌體，研磨破壁(Yang F,Tan HD,Zhou YJ,et al.Mol.Biotechnol.2010,47(2):144–151.)。使用TakaRa公司RNAiso試劑盒，并按照其標準步驟提取總RNA。

RNA進行1.5％(質(zhì)量/體積濃度)瓊脂糖凝膠電泳，使用熒光-紫外分析儀觀察鑒定，可見清晰的兩條帶。用紫外/可見光光譜儀分析總RNA樣品，測得OD₂₆₀/OD₂₈₀＝1.99，表明總RNA質(zhì)量很好?？俁NA樣品凍存于-80℃，備用。

實施例2:圓紅冬孢酵母CGMCC 2.1389cDNA第一鏈合成和ADH2簡并PCR

以圓紅冬孢酵母CGMCC 2.1389總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。首先，將1.0μL總RNA(約2μg)，1.0μL引物SMART IV：5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCGGG-3′和1.0μL oligo dT-接頭引物CDSⅢ/3'：5′-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)_30N-1N-3′，2.0μL DEPC處理水(焦碳酸二乙酯處理水，購自大連TakaRa公司)，加入到PCR管中混勻，于72℃保溫2min，立即置于冰上冷卻2min，將2.0μL5×第一鏈緩沖液(Clontech公司)，1.0μL DTT(20mM)，1.0μL dNTP(10mM)，1.0μL powerscript反轉(zhuǎn)錄酶(Clontech公司)加入到體系中，混勻。于42℃延伸反應(yīng)60min，最后4℃結(jié)束反應(yīng)，存于-20℃，備用。

設(shè)計合成兩條簡并引物ADH2-sense:5′-ATGAG(AGCT)AA(CT)CC(AGCT)CAGATCCC(AGCT)AAg-3′(括號內(nèi)堿基在此位置隨機出現(xiàn)，為簡并堿基)和ADH2-anti:5′-TTAGAA(AG)TT(CT)TT(AGCT)AG(AGCT)ACGAT(AGCT)CG-3′(括號內(nèi)堿基在此位置隨機出現(xiàn)，為簡并堿基)，以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA第一鏈為模板，進行ADH2基因的簡并PCR擴增，5×PCR緩沖液10.0μL，dNTPs(10mM)1.0μL，上游引物(50mmol/l)1.0μL，下游引物(50mmol/l)1.0ul，PrimeSTAR DNA聚合酶(大連TakaRa)0.5μL，合成的cDNA第一鏈模板1.0μL，ddH₂O補加至50μL，于94℃保溫3min，然后于98℃保溫10s，62℃10s，72℃1min，35個循環(huán)，72℃10min，4℃結(jié)束反應(yīng)。擴增產(chǎn)物進行1％(質(zhì)量/體積濃度)瓊脂糖凝膠電泳，觀察到1.1kb左右的條帶(圖1)，利用DNA回收試劑盒(購自上海生工)，按照供應(yīng)商建議步驟純化PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物參照大連TakaRa公司提供的方法克隆到pMD18-T載體(購自大連TakaRa)，轉(zhuǎn)化入E.coli DH5α感受態(tài)細胞，其中感受態(tài)細胞按氯化鈣法(分子克隆實驗指南第三版，薩姆布魯克著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社出版)制備。挑選Amp抗性轉(zhuǎn)化子進行增菌培養(yǎng)、質(zhì)粒提取。重組質(zhì)粒樣品送至大連TakaRa公司測序，序列結(jié)果推測出的氨基酸序列經(jīng)Blastp分析，證實為半乳糖激酶序列(RtADH2氨基酸序列)，如SEQ ID NO：5所示。葡萄糖去阻礙誘導(dǎo)乙醇脫氫酶cDNA序列(RtADH2cDNA)如SEQ ID NO：4序列所示。

實施例3：圓紅冬孢酵母CGMCC 2.1389RtADH2CDS的擴增

圓紅冬孢酵母CGMCC 2.1389的基因組DNA提取采用玻璃珠破壁法(精編分子生物學(xué)實驗指南第三版第13章，奧斯伯等著，顏子穎等譯，科學(xué)出版社出版)。制備好的基因組DNA，利用Nanodrop ND-1000測定，測得OD₂₆₀/OD₂₈₀＝1.85，表明基因組DNA質(zhì)量很好。濃度為280ng/μL，共500μL，基因組DNA樣品凍存于-20℃，備用。

根據(jù)實施例2中獲得的葡萄糖去阻礙誘導(dǎo)的乙醇脫氫酶(RtADH2)cDNA序列，設(shè)計1對基因特異性引物，ADH2-p1:5’-atgagcaaccctcaaatccccaaggaaggc-3’和ADH2-p2:5’-ttagaagttcttgaggacgatgcggcc-3’，以圓紅冬孢酵母CGMCC 2.1389的基因組DNA為模板，按照常規(guī)方法進行PCR擴增，得到約1.5kb的PCR產(chǎn)物(未顯示)。PCR擴增產(chǎn)物按照實施例2的操作步驟回收、克隆到pMD18-T載體，并進行測序，得到如序列表SEQ ID NO：3所示的DNA序列(RtADH2CDS)。經(jīng)與實施例2中獲得的半乳糖激酶cDNA序列比對，證實該基因片段為其半乳糖激酶編碼區(qū)序列，其中含有6個內(nèi)含子和7個外顯子。

實施例4：染色體步移獲得RtADH2基因5’翼側(cè)序列(啟動子)

本實施例利用Genome Walking Kit(購自大連TakaRa)完成。

根據(jù)實施例3中得到的RtADH2CDS序列，設(shè)計3條Specific Primer(基因特異性引物)，分別為ADH2-SP1：5’-gtcttgggcgcagcgggccagtcgccctt-3’，ADH2-SP2:5’-ctcttctcctcgcccttgcattcttgcgt-3’和ADH2-SP3:5’-gtcgactcggatgggtccgttgcactt-3’，做為下游引物，按照試劑盒說明書進行以下操作。

1.1^st PCR反應(yīng)

以實施例3中精制的基因組DNA為模板，進行第一輪擴增。反應(yīng)體系50μL：10×LA PCR buffer II(Mg²⁺plus,大連TakaRa)5.0μL，dNTPs(2.5mmol/l)8.0μL，LA Taq DNA聚合酶(5U/μL,大連TakaRa)1.0μL，AP1Primer(100μmol/l，大連TakaRa)1.0μL，ADH2-SP1(10μmol/l)1.0μL，圓紅冬孢酵母CGMCC 2.1389基因組DNA模板(120ng/μL)1.0μL，ddH₂O加至50μL。反應(yīng)條件：先進行5個高溫退火溫度的高特異性反應(yīng)，然后進行1個極低退火溫度的低特異性反應(yīng)；然后進行熱不對稱 PCR：2個高退火溫度(65℃)的高特異性反應(yīng)和1個低退火溫度(44℃)的低特異性反應(yīng)交替循環(huán)，共15次。具體參數(shù)如下：94℃1min，98℃1min；94℃30s，65℃1min,72℃2min,共5個循環(huán)；94℃30s，25℃3min，72℃2min；94℃30s,65℃1min,72℃2min,94℃30s,65℃1min,72℃2min,94℃30s,44℃1min,72℃2min,共15個循環(huán)；72℃10min,結(jié)束反應(yīng)。

2.2^nd巢式PCR反應(yīng)

反應(yīng)體系50μL：10×LA PCR buffer II(Mg²⁺plus,大連TakaRa)5.0μL，dNTPs(2.5mmol/l)8.0μL，LA Taq DNA聚合酶(5U/μL,大連TakaRa)1.0μL，AP1Primer(100μmol/l，大連TakaRa)1.0μL，1^stPCR反應(yīng)產(chǎn)物1.0μL，ADH2-SP2(10μmol/l)1.0μL，ddH₂O加至50μL。反應(yīng)條件：94℃30s,65℃1min,72℃2min,94℃30s,65℃1min,72℃2min,94℃30s,44℃1min,72℃2min,共15個循環(huán)；72℃10min,結(jié)束反應(yīng)。

3.3^rd巢式PCR反應(yīng)

反應(yīng)體系50μL：10×LA PCR buffer II(Mg²⁺plus,大連TakaRa)5.0μL，dNTPs(2.5mmol/l)8.0μL，LA Taq DNA聚合酶(5U/μL,大連TakaRa)1.0μL，AP1Primer(100μmol/l，大連TakaRa)1.0μL，2^nd巢式PCR反應(yīng)產(chǎn)物1.0μL，ADH2-SP3(10μmol/l)1.0μL，ddH₂O加至50μL。反應(yīng)條件：94℃30s,65℃1min,72℃2min,94℃30s,65℃1min,72℃2min,94℃30s,44℃1min,72℃2min,共15個循環(huán)；72℃10min,結(jié)束反應(yīng)。

3^rd巢式PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1％(質(zhì)量/體積濃度)瓊脂糖凝膠電泳后切割目的條帶，利用DNA片段凝膠純化試劑盒(購自碧云天)進行純化。純化后的DNA片段經(jīng)TA克隆插入pMD18-T載體(購自大連TakaRa公司)，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞；其中感受態(tài)細胞按氯化鈣法(分子克隆實驗指南第三版，薩姆布魯克著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社出版)制備。挑選Amp抗性轉(zhuǎn)化子進行增菌培養(yǎng)、質(zhì)粒提取。重組質(zhì)粒樣品送至大連TakaRa公司測序，得到如SEQ ID NO：1所示的DNA序列，證實為預(yù)期的RtADH2啟動子序列(ADH2p)。

實施例5：染色體步移獲得RtADH2基因3’翼側(cè)序列(終止子)

本實施例也是利用Genome Walking Kit(購自大連TakaRa)完成。

根據(jù)實施例3中得到的ADH2DNA序列，設(shè)計3條Specific Primer(基因特異性引物)分別為ADH2-SP11：5’-ccaggatgcgattgaggcgcttgattt-3’，ADH2-SP22:5’-gcggcgcacttcgactccttcacctct-3’和ADH2-SP33:5’-ccaccgcatggagcaaggcgccgtccc-3’，做為上游引物，按照試劑盒說明書進行3’翼側(cè)染色體步移操作，除Specific Primer分別由ADH2-SP1，ADH2-SP2，ADH2-SP3依次更換為ADH2-SP11，ADH2-SP22，ADH2-SP33外，其它同實施例4。

3^rd巢式PCR反應(yīng)產(chǎn)物(未顯示)利用DNA片段凝膠純化試劑盒(購自碧云天)進行純化，經(jīng)TA克隆插入pMD18-T載體(購自大連TakaRa公司)，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞；其中感受態(tài)細胞按氯化鈣法(分子克隆實驗指南第三版，薩姆布魯克著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社出版)制備。挑選Amp抗性轉(zhuǎn)化子進行增菌培養(yǎng)、質(zhì)粒提取。重組質(zhì)粒樣品送至大連TakaRa公司測序，得到如SEQ ID NO：2所示的DNA序列，證實為預(yù)期的葡萄糖去阻礙誘導(dǎo)乙醇脫氫酶基因的終止子序列。

實施例6：RtADH2啟動子-開放閱讀框架-終止子全長基因獲得

根據(jù)實施例4和實施例5中獲得的啟動子和終止子序列，重新設(shè)計一對引物進行RtGAL“啟動子-開放閱讀框架-終止子”全長基因的擴增。PADH2-p1:5’-ggctgaggctttcccgacgcccctcct-3’，ADH2t-p2:5’-cgagcagtttgctgtgcgcaggaggcg-3’。以實施例3中制備的圓紅冬孢酵母CGMCC 2.1389基因組DNA為模板進行PCR擴增。PCR體系(50μL)：10×Speed buffer(大連TakaRa)5.0μL，dNTPs(10mmol/l)1.0μL，上游引物(10μmol/l)2.0μL，下游引物(10μmol/l)2.0μL，SpeedSTAR^TM HS DNA聚合酶(擴增速度快，1kb/10s，購自大連TakaRa公司)0.5μL，基因組DNA模板(120ng/μL)2μL，ddH₂O加至50μL。反應(yīng)條件：98℃1min，98℃10s，65℃1.0min，35個循環(huán)，72℃10min，4℃結(jié)束反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1％(質(zhì)量/體積濃度)瓊脂糖凝膠電泳分析后利用PCR片段純化試劑盒(購自碧云天)進行純化。片段經(jīng)TA克隆插入pMD18-T載體(購自大連TakaRa公司)，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞；其中感受態(tài)細胞按氯化鈣法(分子克隆實驗指南第三版，薩姆布魯克著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社出版)制備。挑選Amp抗性轉(zhuǎn)化子進行增菌培養(yǎng)、質(zhì)粒提取。重組質(zhì)粒樣品送至大連TakaRa公司測序，證實為預(yù)期的葡萄糖去阻礙誘導(dǎo)乙醇脫氫酶基因全長序列pADH2t，該重組載體命名為 T-pADH2t。

實施例7：RF克隆法構(gòu)建潮霉素蛋白表達盒ADH2p-hyg-ADH2t

根據(jù)NCBI報道的HYG蛋白質(zhì)序列委托上海生工公司全基因合成HYG基因(如SEQ ID NO：6所示)。以合成的基因為模板，參照文獻方法(van den Ent F,Lowe J J.Biochem Biophys Methods,2006,67,67-74.)，設(shè)計RF克隆引物：HYG-RF-p1：5’-GATCACTGCTACGTCGCCCGTAGACACAatgccggagctcacggcgacgtcggtc-3′和HYG-RF-p2:5’-AGCGGAGACGCGAGCGAGAAGGGACGActattctttcgcccgcgggcgcgtcga-3’為引物，進行PCR擴增。進行RF第一輪擴增。體系(50μL)：5×Prime buffer(大連TakaRa)10.0μL，dNTPs(2.5mmol/l)4.0μL，上游引物(10μmol/l)2.0μL，下游引物(10μmol/l)2.0μL，PrimeSTAR HS DNA聚合酶(大連TakaRa)1.0μL，T-GFPuv質(zhì)粒(100ng/μL)1μL，ddH₂O加至50μL。反應(yīng)條件：95℃3min，98℃8s，49℃15s，72℃1min，35個循環(huán)，72℃10min，4℃結(jié)束反應(yīng)。RF I反應(yīng)產(chǎn)物利用DNA片段膠回收純化試劑盒純化，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

RF II反應(yīng)：5×Prime buffer(大連TakaRa)10.0μL，dNTPs(2.5mmol/l)4.0μL，實施例6中構(gòu)建的T-pADH2t質(zhì)粒(100ng/μL)1.0μL，本實施例前述步驟中RF I反應(yīng)產(chǎn)物(200ng/μL)5.0μL，PrimeSTAR HS DNA聚合酶(大連TakaRa)1.0μL，ddH₂O加至50μL。反應(yīng)條件：95℃3min，68℃12min，之后95℃30s，65℃45s(-1℃/cyc)，68℃12min，15個循環(huán)，接下來再進行一輪：95℃30s，55℃45s，68℃12min，20個循環(huán)，72℃10min，4℃結(jié)束反應(yīng)。

DpnI消化和電擊轉(zhuǎn)化：取8μL RF II反應(yīng)產(chǎn)物加入1μL DpnI(購自TaKaRa)和1μL DpnI buffer，混勻后在37℃作用120min去除原T-pADH2t質(zhì)粒后，取2μL電擊轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，感受態(tài)細胞按標準方法制備(分子克隆實驗指南第三版，薩姆布魯克著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社出版)，電擊轉(zhuǎn)化參數(shù)：2200-2500V，400Ω，25μF，0℃，4-8ms。挑選Amp抗性轉(zhuǎn)化子進行增菌培養(yǎng)、質(zhì)粒提取，并利用RF I反應(yīng)所用引物HYG-RF-p1和HYG-RF-p2進行菌落PCR鑒定，鑒定陽性的重組載體送大連TakaRa進行測序，得到5’端和3’端分別為ADH2啟動子和ADH2終止子的“ADH2p-hyg-ADH2t”表達盒，同時，該重組載體命名為T-ADH2p-hyg-ADH2t。完整的“ADH2p-hyg-ADH2t”表達盒如SEQ ID NO：7所示。

實施例8：hyg在貝吉維紅冬孢酵母(Rhodosporidium babjevae)NCYC 2630中的誘導(dǎo)表達

根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)在自然條件下可以通過病斑或傷口進入寄主組織，將其體內(nèi)的一段DNA轉(zhuǎn)入植物基因組中，最終刺激寄主在侵染部位形成冠癭瘤。農(nóng)桿菌這種特性最早被應(yīng)用于植物基因組的改造，稱為ATMT技術(shù)。隨后ATMT技術(shù)廣泛應(yīng)用于多種真菌和酵母遺傳改造和T-DNA插入突變文庫構(gòu)建。

ATMT轉(zhuǎn)化過程大致可以分為載體構(gòu)建、農(nóng)桿菌活化、宿主材料制備、共轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化子篩選這五個步驟。首先在雙元載體的T-DNA區(qū)域間插入合適的選擇標記，并轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌；含有雙元載體的農(nóng)桿菌工程菌株活化后用乙酰丁香酮(AS)誘導(dǎo)；宿主菌株經(jīng)過活化后稀釋到一定的濃度；將活化并誘導(dǎo)后的農(nóng)桿菌與宿主材料混合，涂布于鋪有載體介質(zhì)的共培養(yǎng)平板上，在適宜的溫度下進行共轉(zhuǎn)化；將共培養(yǎng)的混菌轉(zhuǎn)移到篩選平板上，置于宿主菌最適宜的溫度下培養(yǎng)，至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。

1.雙元載體PZPK-ADH2p-hyg-ADH2t的構(gòu)建

PZPK骨架載體來源于中科院大連化學(xué)物理研究所趙宗保研究員實驗室(Lin XP,Wang YN,Zhang SF,et al.Fems Yeast Res.2014,14:547–555)，PZPK-ADH2p-hyg-ADH2t載體的構(gòu)建則采用ADH2-HYG-RF-p1：5’-CCGAATTGAATTCGAGCTCGCTCGGTACCCGGggctgaggctttcccgacgcccctcct-3′和ADH2-HYG-RF-p2：5’-GCTTGCATGCTGCAGGTCGACTCTAGA cgagcagtttgctgtgcgcaggaggcg-3′為引物，以實施例7構(gòu)建的T-ADH2p-hyg-ADH2t為模板擴增獲得“ADH2p-hyg-ADH2t”片段，PCR膠回收后采用RF克隆方法(如實施例7中所示)將“ADH2p-hyg-ADH2t”片段插入PZPK雙元載體的LB和RB之間。所獲得的載體命名為PZPK-ADH2p-hyg-ADH2t，結(jié)構(gòu)如圖2所示。

2.含有PZPK-ADH2p-hyg-ADH2t質(zhì)粒的農(nóng)桿菌工程菌株的構(gòu)建

所獲得的PZPK-ADH2p-hyg-ADH2t雙元載體采用電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciems)AGL1(購自美國標準生物品收藏中心(ATCC))中，于含有50ng/μL卡那霉素的LB 平板上挑取轉(zhuǎn)化子。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子首先采用菌落PCR的方法進行驗證。驗證正確的轉(zhuǎn)化子，提取其中的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中。雙元載體通過大腸桿菌大量富集后送測序驗證。含有測序正確質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌株為工程菌株，保存?zhèn)溆谩?/p>

3.HYG基因在Rhodosporidium babjevae NCYC 2630中的誘導(dǎo)表達

R.babjevae NCYC 2630購自英國國家酵母菌種保藏中心(National Collection of Yeast Cultures，NCYC)。取一環(huán)活化后的R.babjevae NCYC 2630，接于5mL YEPD(葡萄糖20.0g/L，酵母提取物10.0g/L，蛋白胨20.0g/L，pH 6.0)培養(yǎng)液中，30℃，200r/min培養(yǎng)12h。用無菌水洗滌一遍后，調(diào)節(jié)至OD₆₀₀＝0.1-0.8，備用。含有PZPK-ADH2p-hyg-ADH2t質(zhì)粒的農(nóng)桿菌活化后，接于5mL含有卡那霉素(50ng/μL)和利福平(50ng/μL)的LB液體中，30℃，200r/min培養(yǎng)8h。用無菌水洗滌一遍，調(diào)節(jié)至OD₆₀₀＝0.1-1.6，備用。

取上述酵母及農(nóng)桿菌稀釋液各400μL，混勻，直接滴于誘導(dǎo)平板(5mmol/l葡萄糖，0.5％甘油，1.45g/L磷酸二氫鉀，2.05g/L磷酸氫二鉀，0.15g/L氯化鈉，0.5g/L七水硫酸鎂，66mg/L二水氯化鈣，2.48g/L七水硫酸鐵，0.5g/L硫酸銨，40mmol/l MES(2-(N-嗎啡啉)乙磺酸)，2％瓊脂粉，200μmol/L乙酰丁香酮)上(Bundock P,den Dulk-Ras A,Beijersbergen A,et al.EMBO J,1995,14,3206-3214.)，24-25℃，培養(yǎng)4天。用10mL左右的無菌水將混合菌苔洗下，3000r/min離心5min，棄去上層主要含有農(nóng)桿菌的液體，剩余的細胞用800μL無菌水重懸，取50-200μL涂布于半乳糖替代葡萄糖為碳源的YPGR培養(yǎng)基(50ng/μL潮霉素、300μg/mL頭孢菌素、1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％棉籽糖，2％半乳糖，瓊脂粉1.5g/L，PH6.0)上，于30℃進行培養(yǎng)，直至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。

4.R.babjevae NCYC 2630潮霉素轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定

隨機挑取6個潮霉素抗性R.babjevae轉(zhuǎn)化子，接入含有50ng/μL潮霉素的YPGR液體培養(yǎng)基(50ng/μL潮霉素、300μg/mL頭孢菌素、1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％棉籽糖，2％半乳糖，PH6.0)中，于30℃搖床培養(yǎng)36h。參考實施例3中所述玻璃珠破壁法提取重組R.babjevae菌株基因組DNA，采用HYG-RF-p1和HYG-RF-p2為引物，進行PCR鑒定。PCR體系(50μL)：10×PCR buffer(大連TakaRa)5.0μL，dNTPs(2.5mmol/l)4.0μL，上游引物(10μmol/l)2.0μL，下游引物(10μmol/l)2.0μL，rTaq DNA聚合酶(大連TakaRa)1.0μL，基因組DNA(30ng/μL)1μL，ddH₂O加至50μL。反應(yīng)條件：95℃3min，98℃10s，55℃15s，72℃1min，35個循環(huán)，72℃10min，4℃結(jié)束反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1％(質(zhì)量/體積濃度)瓊脂糖凝膠電泳分析。結(jié)果如圖3所示。可見，外源HYG片段成功整合進入R.babjevae NCYC 2630基因組中。

5.R.babjevae NCYC 2630潮霉素轉(zhuǎn)化子的Western blot分析

除了直接利用潮霉素抗性表型來確定圓紅冬孢酵母ADH2啟動子可以啟動潮霉素抗性基因在R.babjevae NCYC 2630的表達外，由于潮霉素抗性基因表達產(chǎn)物的C-端攜帶6×His Tag，還可利用抗His Tag抗體通過Western blot分析確定相應(yīng)蛋白的表達。上述PCR鑒定正確的6個轉(zhuǎn)化子，隨機挑取3個轉(zhuǎn)化子，接入10mL含有50ng/μL潮霉素的YPGR液體培養(yǎng)基中，于30℃搖床培養(yǎng)48h，4000r/min離心10min收集菌株。獲得的菌體用無菌水洗滌一遍后，加入400μL的蛋白提取緩沖液(8M尿素,65mM DTT,0.1％Triton X-100,100mM NaCl,50mM Tris-Cl,1mM PMSF,1mM EGTA,1mM EDTA，pH為7.4)重懸，再加入同等體積的酸洗玻璃珠。采用玻璃珠破壁法破碎細胞提取細胞總蛋白(精編分子生物學(xué)實驗指南第三版第13章，奧斯伯等著，顏子穎等譯，科學(xué)出版社出版)。細胞總蛋白在12％SDS-PAGE膠上進行分離后，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上(Solarbio,Beijing,China)，采用小鼠抗His-tag抗體(購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司)和辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG(購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司)作為一抗和二抗，DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒(購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司)進行顯色，均可觀察到潮霉素基因的表達(圖4)。

實施例9：利用ADH2p-hyg-ADH2t表達盒進行圓紅冬孢酵母ATCC 10788的URA3基因敲除兼BLE的誘導(dǎo)表達

在此利用圓紅冬孢酵母URA3基因作為整合位點，通過RF克隆方法，使得“ADH2p-hyg-ADH2t”表達盒的5’和3’末端攜帶有約1500bp的圓紅冬孢酵母URA3基因同源重組臂，利用BLE抗性篩選標記進行轉(zhuǎn)化子的篩選。

1.圓紅冬孢酵母URA3基因的獲得

根據(jù)圓紅冬孢酵母URA3(orotidine-5'-phosphate decarboxylase)基因序列(NCBI登錄號： KB722658.1,EU693529.1)，設(shè)計特異引物：URA3-P1：5’-TGGCTCCAATGAGTCGTTGCTTCCAGCGC-3′和URA3-P2:5’-CAAGGAGAGAGGCGTTAAGCCTAAAG-3’，以圓紅冬孢酵母ATCC 10788基因組為模板，擴增獲得含有URA3啟動子、閱讀框架和終止子的全長基因組序列。利用DNA回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物后，克隆到pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌(E.coli)DH5α感受態(tài)細胞。挑選Amp抗性轉(zhuǎn)化子進行增菌培養(yǎng)、質(zhì)粒提取。重組質(zhì)粒樣品送至大連TakaRa公司測序，序列結(jié)果與基因組測序結(jié)果比對，證實包含URA3啟動子，終止子和閱讀框架的DNA序列(如SEQ ID NO：8所示，URA3p-URA3-URA3t)。該質(zhì)粒命名為T-URA3。

2.RF克隆方法構(gòu)建ADH2p-BLE-ADH2t表達盒

以pPICZαA(購自Invitrogen)為模板，利用一對引物BLE-RF-p1：5’-GATCACTGCTACGTCGCCCGTAGACACAatggccaagttgaccagtgccgttccg-3′和BLE-RF-p2:5’-GAAGCGGAGACGCGAGCGAGAAGGGACGAtcagtcctgctcctcggccacgaagtg-3’，進行PCR擴增。依照實施例7中所述的RF克隆方法，以T-ADH2p-hyg-ADH2t為骨架，將BLE(SEQ ID NO：9)插入ADH2p和ADH2t之間，構(gòu)建成的質(zhì)粒命名為T-ADH2p-BLE-ADH2t。

3.URA3-BLE敲除盒的構(gòu)建

采用引物URA3-ADH2-BLE-RF-P1：5’-CTTGTCTTCTACAGTATATCCCTAAATTggctgaggctttcccgacgcccctcct-3′和URA3-ADH2-BLE-RF-P2:5’-CTGCCCTTCACTCATCAATTACCA cgagcagtttgctgtgcgcaggaggcg-3’為引物，進行PCR擴增。依照實施例3中所述的RF克隆方法，以T-URA3為骨架，將“ADH2p-BLE-ADH2t”表達盒插入RtURA3中，所得的序列經(jīng)過Takara測序后如SEQ ID NO：10所示(pURA3-ADH2p-BLE-URA3t)，構(gòu)建成的質(zhì)粒命名為T-URA3-ADH2-BLE，結(jié)構(gòu)如圖7所示。重組質(zhì)粒樣品送至大連TakaRa公司測序，序列結(jié)果與基因組測序結(jié)果比對，證實該基因片段為兩端帶有1500bp URA3重組臂的“URA3-ADH2-BLE-URA3”敲除盒。

4.URA3-ADH2-BLE-URA3敲除盒的大量制備

以T-URA3-ADH2-BLE質(zhì)粒為模板，以URA3-P1和URA3-P2為引物，進行“URA3-ADH2-BLE-URA3”敲除盒的大量制備。PCR體系(500μL)：10×Speed buffer(大連TakaRa)50.0μL，dNTPs(10mmol/l)10.0μL，上游引物(10μmol/l)20.0μL，下游引物(10μmol/l)20.0μL，SpeedSTAR HS DNA聚合酶(擴增速度快，1kb/10s，購自大連TakaRa公司)5.0μL，基因組DNA模板(120ng/μL)15.0μL，ddH₂O加至500μL，混勻后分裝。反應(yīng)條件：98℃1min，98℃10s，65℃60s，35個循環(huán)，72℃10min，4℃結(jié)束反應(yīng)。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1％(質(zhì)量/體積濃度)瓊脂糖凝膠電泳分析后利用PCR片段純化試劑盒(購自生工)進行純化。純化后的DNA片段濃度為500ng/μL，共60μL，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

5.圓紅冬孢酵母ATCC 10788感受態(tài)細胞制備

圓紅冬孢酵母ATCC 10788感受態(tài)細胞的制備：圓紅冬孢酵母ATCC 10788挑菌落接種10mL YEPD培養(yǎng)基(葡萄糖20.0g/L，酵母提取物10.0g/L，蛋白胨20.0g/L，pH 6.0)，30℃，200rpm，培養(yǎng)20h；培養(yǎng)物1:50比例轉(zhuǎn)接新鮮YEPD培養(yǎng)基，100mL(500mL錐形瓶，裝液量100mL)，30℃，200rpm，培養(yǎng)6-9h，OD值達到0.6-1.2；培養(yǎng)物冰浴10-30min，4℃，4000r/min離心5min，棄上清；0℃無菌Milli-Q水洗1次；0℃1mol/l山梨醇洗滌2次；冰浴，備用。取100μL圓紅冬孢酵母ATCC 10788感受態(tài)細胞，加入“URA3-ADH2-BLE-URA3”敲除盒10μL(總共5μg)，混勻后移入預(yù)冷至0℃的電擊杯中，參數(shù)：電壓0.8-2.0千伏，電阻200Ω，電容25μF，時間4-8ms；電擊后立即加入1mL含1M山梨醇的YEPD，30℃溫育1-2h；涂布含1M山梨醇的YPGR培養(yǎng)基(50ng/μL博來霉素、1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％棉籽糖，2％半乳糖，1.5瓊脂粉，PH6.0)，30℃培養(yǎng)5天以上，待轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。

6.轉(zhuǎn)化子的菌落PCR鑒定

博來霉素抗性轉(zhuǎn)化子接種10mL YPGR液體培養(yǎng)基(50ng/μL博來霉素、1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％棉籽糖，2％半乳糖，PH 6.0)。參照實施例3中玻璃珠破壁法提取基因組DNA，采用BLE-RF-p1和BLE-RF-p2進行PCR鑒定。PCR體系(25μL)：10×PCR buffer(大連TakaRa)2.5μL，dNTPs(2.5mmol/l)2.0μL，上游引物(10μmol/l)1.0μL，下游引物(10μmol/l)21.0μL，rTaq DNA聚合酶(大連TakaRa)0.5μL，基因組DNA(20ng/μL)1μL，ddH₂O加至25μL。反應(yīng)條件：95℃3min，95℃ 30s，55℃30s，72℃1min，35個循環(huán)，72℃10min，4℃結(jié)束反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1％(質(zhì)量/體積濃度)瓊脂糖凝膠電泳分析。結(jié)果顯示，所有圓紅冬孢酵母ATCC 10788重組菌株均可擴增出外源BLE基因片段，而對照菌株圓紅冬孢酵母ATCC 10788則無相應(yīng)PCR產(chǎn)物(未顯示)。

進一步對上述鑒定正確的轉(zhuǎn)化子進行表型驗證。5’-FOA抗性表型分析結(jié)果顯示，此尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型圓紅冬孢酵母工程菌株在含有5’-FOA的半乳糖SD培養(yǎng)基(0.1％5’-FOA，半乳糖20g/L，(NH₄)₂SO₄ 0.1g/L，酵母粉0.75g/L，KH₂PO₄ 0.06g/L，MgSO₄·7H₂O 1.5g/L，pH6.0)上能夠正常生長，而野生型的R.toruloides ATCC 10788則在含有5’-FOA的培養(yǎng)基中無法生長。

因此，從基因型到表型，均驗證圓紅冬孢酵母ATCC 10788重組菌株URA3基因的缺失。

7.Ble基因的表達分析(轉(zhuǎn)錄水平表達分析，RT-PCR)

除了直接利用博萊霉素抗性表型來確定圓紅冬孢酵母FBA啟動子可以啟動博萊霉素抗性基因在圓紅冬孢酵母的表達(博萊霉素抗性表型決定于萊霉素抗性基因的表達)外，還利用RT-PCR方法檢測了博萊霉素抗性基因ble的轉(zhuǎn)錄水平的表達。

隨機挑取7株博來霉素抗性轉(zhuǎn)化子接種10mL YPGR液體培養(yǎng)基(50ng/μL博來霉素、1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％棉籽糖，2％半乳糖，PH 6.0)，誘導(dǎo)培養(yǎng)48h。參照實施例1方法提取細胞總RNA，參照實施例2方法進行反轉(zhuǎn)錄(RT)，以所合成的cDNA第一鏈為模板，利用BLE-p1:ATGGCCAAGTTGACCAGTGCCG和BLE-p2:TCAGTCCTGCTCCTCGGC CACG為引物進行PCR擴增。PCR體系(25μL)：10×Ex Taq buffer(大連TakaRa)2.5μL，dNTPs(10mmol/l)0.5μL，上游引物BLE-p1(10μmol/l)1.0μL，下游引物BLE-p2(10μmol/l)1.0μL，Ex Taq DNA聚合酶0.25μL，cDNA第一鏈模板1.0μL，ddH₂O加至25μL。反應(yīng)條件：98℃1min，98℃10s，65℃60s，35個循環(huán)，72℃10min，4℃結(jié)束反應(yīng)。結(jié)果顯示，所有圓紅冬孢酵母ATCC 10788重組菌株均可擴增出0.3kb BLE基因片段，而對照菌株圓紅冬孢酵母ATCC 10788則無相應(yīng)PCR產(chǎn)物(圖5)。

實施例10：雙表達盒ADH2啟動子載體的構(gòu)建

1.pZPK-ADH2p-hyg-Thsp單表達盒載體的構(gòu)建

以實施例3中制備的R.toruloides CGMCC2.1389基因組DNA為模板，利用引物HSPt-H1：CGAAAGAACACCACCATCACCATCACTAGacgattccgcccc gtctcacctcgcat和HSPt-H2：GCATGCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCC cgcgcacttctctgcactgcatctttg，擴增獲得Thsp終止子序列(SEQ ID NO：11)，PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA膠回收試劑盒(購自生工)純化后采用RF克隆方法(如實施例7中所示)將Thsp終止子片段置換PZPK-ADH2p-hyg-ADH2t載體的ADH2終止子，所獲得的載體命名為PZPK-ADH2p-hyg-Thsp，結(jié)構(gòu)如圖6所示。

2.多克隆位點的引入和pZPK-ADH2p-MCS-Thsp單表達盒載體的構(gòu)建

選擇pZPK-pPGK-hyg-Tnos載體(Lin XP,Wang YN,Zhang SF,et al.Fems Yeast Res.2014,14:547–555)和上一步驟構(gòu)建的PZPK-ADH2p-HYG-Thsp載體中均不含有的3個酶切位點EcoR V、Nco I、Spe I設(shè)計多克隆位點MCS(Multiple Cloning Site)。參考RF克隆原理，直接設(shè)計兩條完全反向互補且含EcoR V、Nco I、Spe I酶切位點的長鏈引物ADH2-HSPt-H1：5’-tacgtcgcccgtagacacaGATATCCCATGGACTAGTacgattccgccccgtctca-3’和ADH2-HSPt-H1：5’-tgagacggggcggaatcgtACTAGTCCATGGGATATC tgtgtctacgggcgacgta-3’作為大引物(mega-primer)，等摩爾比加入RFII反應(yīng)體系，以PZPK-ADH2p-HYG-Thsp載體為出發(fā)載體，直接進行RF II克隆(如實施例7中所示)將MCS片段置換上一步驟構(gòu)建的PZPK-ADH2p-HYG-Thsp載體的hyg ORF，所構(gòu)建的載體命名為pZPK-ADH2p-MCS-Thsp。結(jié)構(gòu)如圖7所示。

3.基于ADH2啟動子的雙表達盒誘導(dǎo)表達載體的構(gòu)建

以pZPK-ADH2p-MCS-Thsp載體為模板，利用引物ADH2-HSPt-p1：5’-agcttgagcttggatcagattgtcgtTTCGGCTGAGGCTTCCCCGACGCCCC-3’和ADH2-HSPt-p1：5’-caaacactgatagtttaaactgaaggcggCGCGCACTTCTCTGCAC TGCATC-3’進行“ADH2p-MCS-Thsp”表達盒的擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA膠回收純化試劑盒(購自生工)純化后采用RF克隆方法(如實施例7中所示)將“ADH2p-MCS-Thsp”表達盒同方向插入在pZPK-pPGK-hyg-Tnos載體(Lin XP,Wang YN,Zhang SF,et al.Fems Yeast Res.2014,14:547–555)的“pPGK-hyg-Tnos”表達盒與RB之間，“pPGK-hyg-Tnos”表達盒(簡稱HYG)和“ADH2p-MCS-Thsp”之間有100bp左右的間隔序列，所獲得的載體命名為PZPK-HYG-ADH2p-MCS-Thsp，結(jié)構(gòu)如圖8所示。該載體的“pPGK-hyg-Tnos”表達盒用于篩選重組 子，“ADH2p-MCS-Thsp”則用于目的基因的插入克隆和誘導(dǎo)表達。

實施例11：脂肪酸羥化酶在鎖擲孢酵母屬S.pararoseus JCM 3765中的表達

蓖麻油酸(12-hydroxy-octadeca-cis-9-enoic acid:C18:1-OH)是一類十分有價值的重要工業(yè)原料?，F(xiàn)有來源主要為植物榨取，但是資源受到限制。來源于病原性真菌——麥角菌(Claviceps purpurea)油酸羥化酶基因(CpFAH，Genbank登記號:EU661785)在微生物中的表達可為蓖麻油酸的供應(yīng)提供一條新的途徑。利用PADH2啟動子進行油酸羥化酶基因CpFAH的誘導(dǎo)表達，以實現(xiàn)在圓紅冬孢酵母中合成蓖麻油酸的目的。

1.CpFAH葡萄糖去阻礙誘導(dǎo)表達載體的構(gòu)建

依據(jù)NCBI上報道的CpFAH(EU661785)基因委托上海生工全基因合成此基因，序列如SEQ ID NO：12所示(CpFAH)。引物CpFAH-NcoI-E1：5’-cggCCATGGACatggcttccgctactcctgcaatg-3′和CpFAH-NcoI-E2:5’-CCGACTAGTctaGTGGTGGTGGTGGTGGTGctgagtcttcattgaaat-3’為引物，進行PCR擴增。PCR擴增產(chǎn)物利用DNA膠回收純化試劑盒(購自生工)進行純化，并利用Nco I、Spe I進行雙酶切，并連接入同樣Nco I、Spe I處理的pZPK-HYG-ADH2p-MCS-Thsp，插入在啟動子ADH2p和終止子Thsp之間，成功構(gòu)建脂肪酸羥化酶的葡萄糖去阻礙誘導(dǎo)表達載體pZPK-HYG-ADH2p-CpFAH-Thsp，結(jié)構(gòu)如圖9所示。重組表達脂肪酸羥化酶的C端引入6×His Tag，可用于Western blot操作。

2.含有pZPK-HYG-ADH2p-CpFAH-Thsp載體的農(nóng)桿菌工程菌株的構(gòu)建

所構(gòu)建的pZPK-HYG-ADH2p-CpFAH-Thsp載體采用電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌AGL1中，于含有50ng/μL卡那霉素的LB平板上挑取轉(zhuǎn)化子?？敲顾乜剐赞r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子首先采用菌落PCR的方法進行驗證。驗證正確的轉(zhuǎn)化子，命名為AGL1/ZPK-HYG-ADH2p-CpFAH-Thsp，保存?zhèn)溆谩?/p>

3.CpFAH經(jīng)ATMT整合入鎖擲孢酵母屬S.pararoseus JCM 3765染色體

擬粉紅鎖擲孢酵母(S.pararoseus)JCM 3765購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)。取一環(huán)活化后的S.pararoseus JCM 3765，接種于5mL YEPD(葡萄糖20.0g/L，酵母提取物10.0g/L，蛋白胨20.0g/L，pH6.0)中，25℃，200r/min過夜培養(yǎng)。用無菌水洗滌一遍后，調(diào)節(jié)至OD₆₀₀＝1-2，備用。

步驟2獲得的重組農(nóng)桿菌AGL1/ZPK-HYG-ADH2p-CpFAH-Thsp接種于5mL含有卡那霉素(100ng/μL)和利福平(80ng/μL)的LB液體中，250℃，200r/min培養(yǎng)過夜。用無菌水洗滌一遍，調(diào)節(jié)至OD₆₀₀＝1-3，備用。

取上述擬粉紅鎖擲孢酵母JCM 3765及農(nóng)桿菌稀釋液各200μL，混勻，直接滴于誘導(dǎo)平板(5mmol/l葡萄糖，0.5％甘油，1.45g/L磷酸二氫鉀，2.05g/L磷酸氫二鉀，0.15g/L氯化鈉，0.5g/L七水硫酸鎂，66mg/L二水氯化鈣，2.48g/L七水硫酸鐵，0.5g/L硫酸銨，40mmol/l MES(2-(N-嗎啡啉)乙磺酸)，2％瓊脂粉，200μmol/L乙酰丁香酮)表面的濾膜上，25℃，培養(yǎng)2天。無菌鑷子將濾膜從IM誘導(dǎo)平板上轉(zhuǎn)移到半乳糖誘導(dǎo)篩選平板(50ng/μL潮霉素、300μg/mL頭孢菌素、1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％棉籽糖，2％半乳糖，1.5瓊脂粉，PH 6.0)上，30℃倒置培養(yǎng)48h，直至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。

4.擬粉紅鎖擲孢酵母JCM3765潮霉素抗性轉(zhuǎn)化子的菌落PCR鑒定

隨機挑取6個遺傳霉素抗性S.pararoseus JCM 3765轉(zhuǎn)化子接入50mL含有50μg/mL潮霉素的半乳糖培養(yǎng)基(50μg/mL潮霉素、300μg/mL頭孢菌素、1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％棉籽糖，2％半乳糖，PH 6.0)中，參考實施例3中所述玻璃珠破壁法提取基因組DNA，采用CpFAH-NcoI-E1和CpFAH-NcoI-E2為引物，進行PCR鑒定。結(jié)果證明，CpFAH成功整合進入S.pararoseus JCM 3765基因組(未顯示)。

5.重組擬粉紅鎖擲孢酵母JCM 3765生產(chǎn)蓖麻油酸的發(fā)酵實驗

挑取3個菌落PCR鑒定正確的擬粉紅鎖擲孢酵母JCM 3765轉(zhuǎn)化子單菌落接于5mL YEPD培養(yǎng)基(葡萄糖20.0g/L，酵母提取物10.0g/L，蛋白胨20.0g/L，pH 6.0)中。培養(yǎng)24h，以1:50的接種量接于50mL含有50μg/mL潮霉素的半乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基(50μg/mL潮霉素、300μg/mL頭孢菌素、1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％棉籽糖，2％半乳糖，PH 6.0)中，作為二級種子。二級種子培養(yǎng)24h后，取5mL加入45mL的半乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。培養(yǎng)96h后結(jié)束發(fā)酵。取40mL發(fā)酵菌液置于50mL圓底離心管，8000r/min室溫離心5min收集菌體，用去離子水洗滌2次，105℃烘24h至恒重。取出后于干燥器中冷卻，然后稱量記錄，稱量后按1g干菌體加入6mL4mol/l鹽酸的比例，每管加入4mL4 mol/l鹽酸，78℃水浴消化1h，冷卻后加入2倍體積的氯仿/甲醇(1:1，v/v)，充分振蕩混勻，萃取1h后離心，取氯仿層放入一個新的離心管中。水相以等體積氯仿再次萃取一次，充分振蕩后離心，取氯仿層放入上述新的離心管中合并，并加入等體積0.1％氯化鈉溶液，振蕩混勻后離心。用注射器將下層有機相小心抽取并注入事先準備好的玻璃漏斗中(漏斗預(yù)先塞入脫脂棉花，并加入適量無水硫酸鈉)，待漏斗中有機溶液基本流入下方的玻璃油瓶中，加入適量的氯仿沖洗漏斗4遍，一并流入下方油瓶中，萃取有油脂的氯仿采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行油脂收集，將收集了油脂的油瓶放入烘箱烘干24h。

對菌油進行甲酯化：稱取70.0mg的待測油脂，加入含5％KOH的CH₃OH溶液0.5mL，加熱回流50min，然后加入BF₃的甲醇溶液(V_{BF3乙醚溶液}：V_CH3OH＝4:10)0.7mL，繼續(xù)回流10min。冷卻后加入1mL去離子水和0.7mL正己烷，混勻后吸出有機相，經(jīng)去離子水洗滌兩遍后用于氣相色譜分析。

6.重組擬粉紅鎖擲孢酵母JCM 3765生產(chǎn)蓖麻油酸的檢測

將步驟5轉(zhuǎn)酯化得到的樣品溶解于正己烷中，采用文獻(Meesapyodsuk,D.,and Qiu,X.Plant Physiol.,2008,147,1325-1333.)中的方法進行檢測，標準品為蓖麻油酸甲酯(CAS:141-24-2)，負對照為野生型擬粉紅鎖擲孢酵母JCM 3765的油脂轉(zhuǎn)酯化產(chǎn)物。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)入CpFAH基因的擬粉紅鎖擲孢酵母JCM3765中確有蓖麻油酸產(chǎn)生，含量為280μg/mL，總量占總體游離脂肪酸含量的62％以上。

7.重組擬粉紅鎖擲孢酵母JCM 3765中CpFAH表達分析——Western blot

除了直接通過蓖麻油酸生產(chǎn)表型來確定圓紅冬孢酵母ADH2p啟動子可以啟動油酸羥化酶基因在鎖擲孢酵母屬的表達外，由于油酸羥化酶基因表達產(chǎn)物的C-端攜帶6×His Tag，還可利用抗His Tag抗體通過免疫印跡分析油酸羥化酶基因的表達。上述步驟4中PCR鑒定正確的6個轉(zhuǎn)化子，隨機挑取3個，接入10mL的半乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基(50μg/mL潮霉素、300μg/mL頭孢菌素、1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％棉籽糖，2％半乳糖，PH 6.0)中，于30℃搖床培養(yǎng)48h，4000r/min離心10min收集菌株。菌體用無菌水洗滌一遍后，加入400μL的蛋白提取緩沖液(8M尿素,65mM DTT,0.1％Triton X-100,100mM NaCl,50mM Tris-Cl,1mM PMSF,1mM EGTA,1mM EDTA，pH為7.4)重懸，按實施例8的步驟5進行SDS-PAGE和Western blot分析，均可觀察到油酸羥化酶的表達(圖10)。

實施例12：蘋果酸酶在擲孢酵母屬Sporobolomyces roseus中的表達

蘋果酸酶(Malic enzyme,ME)是NADPH的主要產(chǎn)生酶，為油脂合成提供還原力。如果在油脂積累期時過表達蘋果酸酶增加NADPH的供應(yīng)，理論上可提高菌株的胞內(nèi)油脂含量。

1.圓紅冬孢酵母蘋果酸酶RtME的半乳糖誘導(dǎo)表達載體的構(gòu)建

根據(jù)圓紅冬孢酵母ME基因所在Scaffold序列(NCBI登錄號：KB722664.1)，設(shè)計特異引物：ME-P1：5’-atgcccgcacactttgccccctcccagc-3′和ME-P2:5’-atgcccgcacactttgccccctcccagccc-3’，以實施例1獲得的圓紅冬孢酵母CGMCC 2.1389總RNA為模板，按實施例2所示方法進行RT-PCR，擴增獲得含有ME的全長cDNA序列。利用DNA回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物后，克隆到pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌(E.coli)DH5α感受態(tài)細胞。挑選Amp抗性轉(zhuǎn)化子進行增菌培養(yǎng)、質(zhì)粒提取。重組質(zhì)粒樣品送至大連TakaRa公司測序，序列結(jié)果與基因組測序結(jié)果比對，證實包含ME編碼基因全長，其序列如SEQ ID NO：13所示，(RtME)。該質(zhì)粒命名為T-ME。

設(shè)計引物ME-NcoI-E1：5’-cggCCATGGACatgcccgcacactttgccccctccca gcccctcca-3′和ME-NcoI-E2:5’-CCGACTAGTctaGTGATGGTGATGGTGGTG ctgcgcctgctgct-3’，以T-ME為模板，進行PCR擴增。PCR擴增產(chǎn)物利用DNA膠回收純化試劑盒(購自生工)進行純化，并利用Nco I、Spe I進行雙酶切，并連接入同樣Nco I、Spe I處理的pZPK-HYG-ADH2-MCS-Thsp，插入在啟動子ADH2p和終止子Thsp之間，成功構(gòu)建蘋果酸酶的葡萄糖去阻礙誘導(dǎo)表達載體pZPK-HYG-ADH2p-ME-Thsp，所示(pZPK-HYG-ADH2p-ME-Thsp)，結(jié)構(gòu)如圖11所示。重組表達脂肪酸羥化酶的C端引入6×His Tag，可用于Western blot操作。

2.含有pZPK-HYG-ADH2p-ME-Thsp載體的農(nóng)桿菌工程菌株的構(gòu)建

所構(gòu)建的pZPK-HYG-ADH2p-ME-Thsp載體采用電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌AGL1中，于含有50ng/μL卡那霉素的LB平板上挑取轉(zhuǎn)化子?？敲顾乜剐赞r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子首先采用菌落PCR的方法進行驗證。驗證正確的轉(zhuǎn)化子，命名為AGL1/ZPK-HYG-ADH2p-ME-Thsp，保存?zhèn)溆谩?/p>

3.ME經(jīng)ATMT整合入擲孢酵母屬粉紅擲孢酵母JCM 8242染色體

粉紅擲孢酵母(Sporobolomyces roseus)JCM 8242購自于日本微生物菌種保藏中心(JCM)。取一環(huán)活化后的S.roseus JCM 8242，接種于5mL YEPD(葡萄糖20.0g/L，酵母提取物10.0g/L，蛋白胨 20.0g/L，pH 6.0)中，25℃，200r/min過夜培養(yǎng)。用無菌水洗滌一遍后，調(diào)節(jié)至OD₆₀₀＝1-2，備用。

步驟2獲得的重組農(nóng)桿菌AGL1/ZPK-HYG-ADH2p-ME-Thsp接種于5mL含有卡那霉素(100ng/μL)和利福平(80ng/μL)的LB液體中，250℃，200r/min培養(yǎng)過夜。用無菌水洗滌一遍，調(diào)節(jié)至OD₆₀₀＝1-3，備用。

取上述粉紅擲孢酵母JCM 8242及農(nóng)桿菌稀釋液各200μL，混勻，按實施例13步驟3進行ATMT操作，直至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。

4.粉紅擲孢酵母JCM 8242潮霉素抗性轉(zhuǎn)化子的菌落PCR鑒定

隨機挑取6個遺傳霉素抗性S.roseus JCM 8242轉(zhuǎn)化子接入50mL含有50ng/μL遺傳霉素的半乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基(50μg/mL潮霉素、300μg/mL頭孢菌素、1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％棉籽糖，2％半乳糖，PH 6.0)，參考實施例3中所述玻璃珠破壁法提取基因組DNA，采用ME-NcoI-E1和ME-NcoI-E2為引物，進行PCR鑒定。結(jié)果證明，ME編碼基因成功整合進入S.roseus JCM 8242基因組(未顯示)。

5.重組粉紅擲孢酵母S.roseus JCM 8242油脂發(fā)酵

挑取3個菌落PCR鑒定正確的粉紅擲孢酵母JCM 8242轉(zhuǎn)化子單菌落，按實施例11步驟5所示方法進行發(fā)酵、胞內(nèi)油脂提取和分析。結(jié)果顯示，較之野生菌株S.roseus JCM 8242，過表達了圓紅冬孢酵母蘋果酸酶的重組S.roseus JCM 8242胞內(nèi)油脂含量由25％提高到了45％，增加了80％。

6.重組S.roseus JCM 8242中ME表達分析——Western blot

除了直接通過油脂積累增加性能來確定圓紅冬孢酵母ADH2p啟動子可以啟動圓紅冬孢酵母蘋果酸酶(RtME)基因在鎖擲孢酵母屬的表達外，由于RtME表達產(chǎn)物的C-端攜帶6×His Tag，還可利用抗His Tag抗體通過免疫印跡分析ME的表達。上述步驟4中PCR鑒定正確的6個轉(zhuǎn)化子，隨機挑取3個，接入10mL的半乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基(50μg/mL潮霉素、300μg/mL頭孢菌素、1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％棉籽糖，2％半乳糖，PH 6.0)，于30℃搖床培養(yǎng)48h，4000r/min離心10min收集菌株。菌體用無菌水洗滌一遍后，加入400μL的蛋白提取緩沖液(8M尿素,65mM DTT,0.1％Triton X-100,100mM NaCl,50mM Tris-Cl,1mM PMSF,1mM EGTA,1mM EDTA，pH為7.4)重懸，按實施例8的步驟5進行SDS-PAGE和Western blot分析，均可觀察到RtME的表達(圖12)。

實施例13：GFP在紅酵母屬深紅酵母CGMCC 2.279中的誘導(dǎo)表達

鑒于深紅酵母遺傳背景不清晰，無法分離自身啟動子和終止子元件進行目的基因的表達，本技術(shù)發(fā)明利用圓紅冬孢酵母ADH2啟動子和Thsp終止子，建立了深紅酵母遺傳操作體系，實現(xiàn)了GFP在深紅酵母CGMCC 2.279中的誘導(dǎo)表達。

1.GFP葡萄糖去阻礙誘導(dǎo)表達載體的構(gòu)建

依據(jù)NCBI上報道的GFP的氨基酸序列(AFA52654.1)，按圓紅冬孢酵母密碼子偏好性進行優(yōu)化，委托上海生工全基因合成其基因，序列如SEQ ID NO：16所示(GFP)。引物GFP-NcoI-E1：5’-cggCCATGGACatgtcgaagggtgaggagcttttc-3′和GFP-NcoI-E2:5’-CCGACTAGTctaGTGGTGGTGGTGGTGGTGcttgtagagttcgtccatgccgtg-3’為引物，進行PCR擴增。PCR擴增產(chǎn)物利用DNA膠回收純化試劑盒(購自生工)進行純化，并利用Nco I、Spe I進行雙酶切，并連接入同樣Nco I、Spe I處理的pZPK-HYG-ADH2p-MCS-Thsp，插入在啟動子ADH2p和終止子Thsp之間，成功構(gòu)建綠色熒光蛋白的葡萄糖去阻礙誘導(dǎo)表達載體pZPK-HYG-ADH2p-GFP-Thsp，結(jié)構(gòu)如圖13所示。重組表達綠色熒光蛋白的C端引入6×His Tag，可用于Western blot操作。

2.含有pZPK-HYG-ADH2p-GFP-Thsp載體的農(nóng)桿菌工程菌株的構(gòu)建

所構(gòu)建的pZPK-HYG-ADH2p-GFP-Thsp載體采用電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌AGL1中，于含有50ng/μL卡那霉素的LB平板上挑取轉(zhuǎn)化子?？敲顾乜剐赞r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子首先采用菌落PCR的方法進行驗證。驗證正確的轉(zhuǎn)化子，命名為AGL1/ZPK-HYG-ADH2p-GFP-Thsp，保存?zhèn)溆谩?/p>

3.GFP經(jīng)ATMT整合入深紅酵母CGMCC 2.279染色體

深紅酵母(Rhodotorula rubra)CGMCC 2.279購自于酵母菌種保藏中心(購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)。取一環(huán)活化后的深紅酵母CGMCC 2.279，接種于5mL YEPD(葡萄糖20.0g/L，酵母提取物10.0g/L，蛋白胨20.0g/L，pH 6.0)中，25℃，200r/min過夜培養(yǎng)。用無菌水洗滌一遍后，調(diào)節(jié)至OD₆₀₀＝1-2，備用。

步驟2獲得的重組農(nóng)桿菌AGL1/ZPK-HYG-ADH2p-GFP-Thsp接種于5mL含有卡那霉素(100ng/μL)和利福平(80ng/μL)的LB液體中，250℃，200r/min培養(yǎng)過夜。用無菌水洗滌一遍，調(diào)節(jié)至 OD₆₀₀＝1-3，備用。

取上述深紅酵母CGMCC 2.279及農(nóng)桿菌稀釋液各200μL，混勻，按實施例13步驟3進行ATMT操作，直至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。

4.深紅酵母CGMCC 2.279潮霉素抗性轉(zhuǎn)化子的菌落PCR鑒定

隨機挑取6個遺傳霉素抗性深紅酵母CGMCC 2.279轉(zhuǎn)化子接入50mL含有50ng/μL遺傳霉素的半乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基(50μg/mL潮霉素、300μg/mL頭孢菌素、1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％棉籽糖，2％半乳糖，PH 6.0)，參考實施例3中所述玻璃珠破壁法提取基因組DNA，采用GFP-NcoI-E1和GFP-NcoI-E2為引物，進行PCR鑒定。結(jié)果證明，GFP基因成功整合進入深紅酵母CGMCC 2.279基因組(未顯示)。

5.深紅酵母CGMCC 2.279潮霉素抗性轉(zhuǎn)化子的熒光觀察

挑取3個菌落PCR鑒定正確的深紅酵母CGMCC 2.279潮霉素抗性轉(zhuǎn)化子單菌落接于5mL YEPD培養(yǎng)基(葡萄糖20.0g/L，酵母提取物10.0g/L，蛋白胨20.0g/L，pH6.0)中。培養(yǎng)24h，以1:50的接種量接于50mL含有50ng/μL潮霉素的半乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基(50μg/mL潮霉素、300μg/mL頭孢菌素、1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％棉籽糖，2％半乳糖，PH 6.0)，作為二級種子。二級種子培養(yǎng)24h后，取5mL加入45mL的半乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。培養(yǎng)48h后結(jié)束發(fā)酵。取菌液10μL點于載玻片，蓋上蓋玻片后置于熒光顯微鏡進行綠色熒光觀察，激發(fā)波長498nm，發(fā)射波長516，GFP重組深紅酵母可觀察到綠色熒光，而對照野生型深紅酵母CGMCC 2.279則無熒光出現(xiàn)(未顯示)。

6.重組深紅酵母CGMCC 2.279中GFP表達分析——Western blot

除了直接通過綠色熒光表型來確定圓紅冬孢酵母ADH2p啟動子可以啟動GFP在紅酵母屬深紅酵母的表達外，由于重組GFP的C-端攜帶6×His Tag，還可利用抗His Tag抗體通過免疫印跡分析GFP的表達。上述步驟4中PCR鑒定正確的6個轉(zhuǎn)化子，隨機挑取3個，接入10mL的半乳糖培養(yǎng)基(50μg/mL潮霉素、300μg/mL頭孢菌素、1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％棉籽糖，2％半乳糖，PH6.0)，于30℃搖床培養(yǎng)48h，4000r/min離心10min收集菌株。菌體用無菌水洗滌一遍后，加入400μL的蛋白提取緩沖液(8M尿素,65mM DTT,0.1％Triton X-100,100mM NaCl,50mM Tris-Cl,1mM PMSF,1mM EGTA,1mM EDTA，pH為7.4)重懸，按實施例8的步驟5進行SDS-PAGE和Western blot分析，均可觀察到GFP的表達(圖14)。

實施例14：GFP在紅酵母屬膠紅酵母CGMCC 2.22中的半乳糖誘導(dǎo)表達

鑒于膠紅酵母(Rhodotorula mucilaqinosa)遺傳背景不清晰，無法分離自身啟動子和終止子元件進行目的基因的表達，本技術(shù)發(fā)明利用圓紅冬孢酵母ADH2p啟動子和Thsp終止子，建立了深紅酵母遺傳操作體系，實現(xiàn)了GFP在膠紅酵母CGMCC 2.22中的誘導(dǎo)表達。

1.GFP經(jīng)ATMT整合入膠紅酵母CGMCC 2.22染色體

實施例13步驟2獲得的重組農(nóng)桿AGL1/ZPK-HYG-ADH2p-GFP-Thsp接種于5mL含有卡那霉素(100ng/μL)和利福平(80ng/μL)的LB液體中，250℃，200r/min培養(yǎng)過夜。用無菌水洗滌一遍，調(diào)節(jié)至OD₆₀₀＝1-3，備用。

膠紅酵母CGMCC 2.22購自于酵母菌種保藏中心(購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)。取一環(huán)活化后的膠紅酵母CGMCC 2.22，接種于5mL YEPD(葡萄糖20.0g/L，酵母提取物10.0g/L，蛋白胨20.0g/L，pH 6.0)中，25℃，200r/min過夜培養(yǎng)。用無菌水洗滌一遍后，調(diào)節(jié)至OD₆₀₀＝1-2，備用。

取上述膠紅酵母CGMCC 2.22及農(nóng)桿菌稀釋液各200μL，混勻，按實施例13步驟3進行ATMT操作，直至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。

2.膠紅酵母CGMCC 2.22潮霉素抗性轉(zhuǎn)化子的菌落PCR鑒定

隨機挑取6個遺傳霉素抗性深紅酵母CGMCC 2.279轉(zhuǎn)化子接入50mL含有50ng/μL遺傳霉素的半乳糖培養(yǎng)基(50μg/mL潮霉素、300μg/mL頭孢菌素、1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％棉籽糖，2％半乳糖，PH 6.0)，參考實施例3中所述玻璃珠破壁法提取基因組DNA，采用GFP-NcoI-E1和GFP-NcoI-E2為引物，進行PCR鑒定。結(jié)果證明，GFP基因成功整合進入膠紅酵母CGMCC 2.22基因組(未顯示)。

3.膠紅酵母CGMCC 2.22潮霉素抗性轉(zhuǎn)化子的熒光觀察

挑取3個菌落PCR鑒定正確的膠紅酵母CGMCC 2.22潮霉素抗性轉(zhuǎn)化子單菌落按實施例13步驟 5進行菌株培養(yǎng)和顯微鏡觀察，GFP重組膠紅酵母可觀察到綠色熒光，而對照野生型膠紅酵母CGMCC2.22則無熒光出現(xiàn)(未顯示)。

4.重組膠紅酵母CGMCC 2.22中GFP表達分析——Western blot

除了直接通過綠色熒光表型來確定圓紅冬孢酵母PADH2啟動子可以啟動GFP在紅酵母屬膠紅酵母CGMCC 2.22的表達外，由于重組GFP的C-端攜帶6×His Tag，還可利用抗His Tag抗體通過免疫印跡分析GFP的表達。上述步驟3中PCR鑒定正確的6個轉(zhuǎn)化子，隨機挑取3個，接入10mL的半乳糖培養(yǎng)基(50μg/mL潮霉素、300μg/mL頭孢菌素、1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％棉籽糖，2％半乳糖，PH 6.0)，于30℃搖床培養(yǎng)48h，4000r/min離心10min收集菌株。菌體用無菌水洗滌一遍后，加入400μL的蛋白提取緩沖液(8M尿素,65mM DTT,0.1％Triton X-100,100mM NaCl,50mM Tris-Cl,1mM PMSF,1mM EGTA,1mM EDTA，pH為7.4)重懸，按實施例8的步驟5進行SDS-PAGE和Western blot分析，均可觀察到GFP的表達(圖15)。

實施例15：脂肪酸羥化酶在紅酵母屬海濱紅酵母中的表達

來源于麥角菌的油酸羥化酶基因(CpFAH，Genbank登記號:EU661785)在PADH2啟動子啟動下實現(xiàn)了蓖麻油酸在海濱紅酵母中的合成。

1.CpFAH經(jīng)ATMT整合入海濱紅酵母CGMCC 2.4203染色體

實施例11步驟2獲得的AGL1/ZPK-HYG-ADH2p-CpFAH-Thsp重組農(nóng)桿菌，接種于5mL含有卡那霉素(100ng/μL)和利福平(80ng/μL)的LB液體中，250℃，200r/min培養(yǎng)過夜。用無菌水洗滌一遍，調(diào)節(jié)至OD₆₀₀＝1-3，備用。

海濱紅酵母(Rhodotorula marina)CGMCC 2.4203購自于酵母菌種保藏中心(購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)。取一環(huán)活化后的海濱紅酵母CGMCC 2.4203，接種于5mL YEPD(葡萄糖20.0g/L，酵母提取物10.0g/L，蛋白胨20.0g/L，pH 6.0)中，25℃，200r/min過夜培養(yǎng)。用無菌水洗滌一遍后，調(diào)節(jié)至OD₆₀₀＝1-2，備用。

取上述擬海濱紅酵母CGMCC 2.4203及農(nóng)桿菌稀釋液各200μL，按實施例13步驟3進行ATMT操作，直至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。

2.海濱紅酵母CGMCC 2.4203潮霉素抗性轉(zhuǎn)化子的菌落PCR鑒定

隨機挑取6個遺傳霉素抗性海濱紅酵母CGMCC 2.4203轉(zhuǎn)化子接入50mL含有50ng/μL潮霉素的半乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基(50μg/mL潮霉素、300μg/mL頭孢菌素、1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％棉籽糖，2％半乳糖，PH 6.0)，參考實施例3中所述玻璃珠破壁法提取基因組DNA，采用CpFAH-NcoI-E1和CpFAH-NcoI-E2為引物，進行PCR鑒定。結(jié)果證明，CpFAH成功整合進入海濱紅酵母CGMCC 2.4203基因組(未顯示)。

3.重組海濱紅酵母CGMCC 2.4203生產(chǎn)蓖麻油酸的發(fā)酵實驗

挑取3個菌落PCR鑒定正確的海濱紅酵母CGMCC 2.4203轉(zhuǎn)化子單菌落接于5mL YEPD培養(yǎng)基(葡萄糖20.0g/L，酵母提取物10.0g/L，蛋白胨20.0g/L，pH6.0)中。培養(yǎng)24h，以1:50的接種量接于50mL含有50ng/μL潮霉素的YEPD培養(yǎng)基，作為二級種子。二級種子培養(yǎng)24h后，離心收集菌體，重新接種于新鮮的50mL含有50ng/μL潮霉素的YEPD培養(yǎng)基，葡萄糖濃度降低至2g/L后，ADH2啟動子受葡萄糖去阻遏誘導(dǎo)啟動CpFAH的表達，然后繼續(xù)培養(yǎng)24h結(jié)束發(fā)酵。取40mL發(fā)酵菌液置于50mL圓底離心管，8000r/min室溫離心5min收集菌體，用去離子水洗滌2次，105℃烘24h至恒重。取出后按實施例11所示方法進行油脂提取和菌油轉(zhuǎn)酯化。

4.重組海濱紅酵母CGMCC 2.4203生產(chǎn)蓖麻油酸的檢測

將步驟7轉(zhuǎn)酯化得到的樣品溶解于正己烷中，采用文獻(Meesapyodsuk,D.,and Qiu,X.Plant Physiol.,2008,147,1325-1333.)中的方法進行檢測，標準品為蓖麻油酸甲酯(CAS:141-24-2)，負對照為野生型海濱紅酵母CGMCC 2.4203的油脂轉(zhuǎn)酯化產(chǎn)物。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)入CpFAH基因的海濱紅酵母中確有蓖麻油酸產(chǎn)生，含量為282μg/mL，總量占總體游離脂肪酸含量的60％以上。

5.重組海濱紅酵母CGMCC 2.4203中CpFAH表達分析——Western blot

除了直接通過蓖麻油酸生產(chǎn)表型來確定圓紅冬孢酵母ADH2p啟動子可以啟動油酸羥化酶基因在海濱紅酵母CGMCC 2.4203的表達外，由于油酸羥化酶基因表達產(chǎn)物的C-端攜帶6×His Tag，還可利用抗His Tag抗體通過免疫印跡分析油酸羥化酶基因的表達。上述步驟4中PCR鑒定正確的6個轉(zhuǎn)化子，隨機挑取3個，接入10mL的半乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基(50μg/mL潮霉素、300μg/mL頭孢菌素、1％酵 母提取物，2％蛋白胨，1％棉籽糖，2％半乳糖，PH 6.0)，于30℃搖床培養(yǎng)48h，4000r/min離心10min收集菌株。菌體用無菌水洗滌一遍后，加入400μL的蛋白提取緩沖液(8M尿素,65mM DTT,0.1％Triton X-100,100mM NaCl,50mM Tris-Cl,1mM PMSF,1mM EGTA,1mM EDTA，pH為7.4)重懸，按實施例8的步驟5進行SDS-PAGE和Western blot分析，均可觀察到油酸羥化酶的表達(未顯示)。

實施例16：菊粉酶在紅酵母屬禾本紅酵母CGMCC 2.4202中的表達

菊粉為多聚果糖，自然界中約有30000多種植物均含有菊粉多糖，菊粉的世界年產(chǎn)量可達350000噸，是僅次于淀粉的第二大植物碳水化合物。在工業(yè)中以及做為生物質(zhì)原料應(yīng)用較多的產(chǎn)菊粉植物為菊苣和菊芋。這些生物質(zhì)經(jīng)過外切菊粉酶處理生成可被多種微生物利用的果糖和少量的葡萄糖。本技術(shù)發(fā)明利用圓紅冬孢酵母ADH2p啟動子和Thsp終止子，建立了禾本紅酵母遺傳操作體系，實現(xiàn)了外切菊粉酶在禾本紅酵母(Rhodotorula graminis)CGMCC 2.4202中的誘導(dǎo)表達。

1.菊粉酶葡萄糖去阻礙誘導(dǎo)表達載體的構(gòu)建

根據(jù)ZL 2007100159198.8專利中馬克斯克魯維酵母外切菊粉酶氨基酸序列，按照圓紅冬孢酵母密碼子偏好性進行優(yōu)化，委托上海生工進行全基因合成，序列如SEQ ID NO：17所示(INU)。設(shè)計引物INU-NcoI-E1：5’-cggCCATGGACatgcgcttcgcgtactccctcttgctc-3′和INU-NcoI-E2:5’-CCGACTAGTctaGTGATGGTGATGGTGGTGgaggttgaactgggtgacgttg-3’，以全合成INU基因為模板，進行PCR擴增。PCR擴增產(chǎn)物利用DNA膠回收純化試劑盒(購自生工)進行純化，并利用Nco I、Spe I進行雙酶切，并連接入同樣Nco I、Spe I處理的pZPK-HYG-ADH2p-MCS-Thsp，插入在啟動子ADH2p和終止子Thsp之間，成功構(gòu)建菊粉酶的葡萄糖去阻礙誘導(dǎo)表達載體pZPK-HYG-ADH2p-INU-Thsp，結(jié)構(gòu)如圖16所示。重組表達脂肪酸羥化酶的C端引入6×His Tag，可用于Western blot操作。

2.含有pZPK-HYG-ADH2p-INU-Thsp載體的農(nóng)桿菌工程菌株的構(gòu)建

所構(gòu)建的pZPK-HYG-ADH2p-INU-Thsp載體采用電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌AGL1中，于含有50ng/μL卡那霉素的LB平板上挑取轉(zhuǎn)化子。卡那霉素抗性農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子首先采用菌落PCR的方法進行驗證。驗證正確的轉(zhuǎn)化子，命名為AGL1/ZPK-HYG-ADH2p-INU-Thsp，保存?zhèn)溆谩?/p>

3.INU經(jīng)ATMT整合入禾本紅酵母CGMCC 2.4202染色體

禾本紅酵母CGMCC 2.4202購自于日本微生物菌種保藏中心(JCM)。取一環(huán)活化后的禾本紅酵母CGMCC 2.4202，接種于5mL YEPD(葡萄糖20.0g/L，酵母提取物10.0g/L，蛋白胨20.0g/L，pH 6.0)中，25℃，200r/min過夜培養(yǎng)。用無菌水洗滌一遍后，調(diào)節(jié)至OD₆₀₀＝1-2，備用。

步驟2獲得的重組農(nóng)桿菌AGL1/ZPK-HYG-PADH2-INU-Thsp接種于5mL含有卡那霉素(100ng/μL)和利福平(80ng/μL)的LB液體中，250℃，200r/min培養(yǎng)過夜。用無菌水洗滌一遍，調(diào)節(jié)至OD₆₀₀＝1-3，備用。

取上述禾本紅酵母CGMCC 2.4202及農(nóng)桿菌稀釋液各200μL，混勻，按實施例13步驟3進行ATMT操作，直至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。

4.禾本紅酵母CGMCC 2.4202潮霉素抗性轉(zhuǎn)化子的菌落PCR鑒定

隨機挑取6個遺傳霉素抗性禾本紅酵母CGMCC 2.4202轉(zhuǎn)化子接入50mL含有50ng/μL潮霉素的半乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基(50μg/mL潮霉素、300μg/mL頭孢菌素、1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％棉籽糖，2％半乳糖，PH 6.0)，參考實施例3中所述玻璃珠破壁法提取基因組DNA，采用INU-NcoI-E1和INU-NcoI-E2為引物，進行PCR鑒定。結(jié)果證明，ME編碼基因成功整合進入禾本紅酵母CGMCC 2.4202基因組(未顯示)。

5.以菊粉為碳源進行重組禾本紅酵母油脂發(fā)酵

挑取3個菌落PCR鑒定正確的禾本紅酵母CGMCC 2.4202轉(zhuǎn)化子單菌落接于5mL YEPD培養(yǎng)基(葡萄糖20.0g/L，酵母提取物10.0g/L，蛋白胨20.0g/L，pH6.0)中。培養(yǎng)24h，以1:50的接種量接于50mL含有50ng/μL潮霉素的半乳糖培養(yǎng)基(50μg/mL潮霉素、300μg/mL頭孢菌素、1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％棉籽糖，2％半乳糖，PH6.0)，作為二級種子。離心收集菌體重新接種于50mL的菊粉培養(yǎng)基(5g/L硫酸銨、0.64g/L硫酸鉀、0.08g/L十二水合磷酸氫二鈉、0.94g/L硫酸鈉、1.5g/L七水硫酸鎂，5％菊粉，2％半乳糖，PH 6.0)中。培養(yǎng)96h后結(jié)束發(fā)酵。取40mL發(fā)酵菌液置于50mL圓底離心管，8000r/min室溫離心5min收集菌體，用去離子水洗滌2次，105℃烘24h至恒重。之后按實施例11的步驟5進行油脂提取。結(jié)果顯示，野生菌株禾本紅酵母CGMCC 2.4202在利用菊粉為唯 一碳源進行發(fā)酵96h時可積累18％的胞內(nèi)油脂；而過表達了外切菊粉酶的重組禾本紅酵母利用菊粉為唯一碳源進行發(fā)酵96h時胞內(nèi)油脂含量則為52％，可直接轉(zhuǎn)換菊粉為胞內(nèi)油脂。

6.重組禾本紅酵母CGMCC 2.4202中INU表達分析——Western blot

除了直接通過菊粉利用表型來確定圓紅冬孢酵母PADH2啟動子可以啟動外切菊粉酶在紅酵母屬的表達外，由于重組INU表達產(chǎn)物的C-端攜帶6×His Tag，還可利用抗His Tag抗體通過免疫印跡分析ME的表達。上述步驟4中PCR鑒定正確的6個轉(zhuǎn)化子，隨機挑取3個，接入10mL的半乳糖培養(yǎng)基(50μg/mL潮霉素、300μg/mL頭孢菌素、1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％棉籽糖，2％半乳糖，PH6.0)，于30℃搖床培養(yǎng)48h，4000r/min離心10min收集菌株。菌體用無菌水洗滌一遍后，加入400μL的蛋白提取緩沖液(8M尿素,65mM DTT,0.1％Triton X-100,100mM NaCl,50mM Tris-Cl,1mM PMSF,1mM EGTA,1mM EDTA，pH為7.4)重懸，按實施例8的步驟5進行SDS-PAGE和Western blot分析，均可觀察到INU的表達(未顯示)。

實施例17：GFP在紅酵母屬粘紅酵母中的半乳糖誘導(dǎo)表達

本技術(shù)發(fā)明利用圓紅冬孢酵母ADH2p啟動子和Thsp終止子，建立了粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)遺傳操作體系，實現(xiàn)了GFP在粘紅酵母NCYC 2666中的誘導(dǎo)表達。

1.GFP經(jīng)ATMT整合入粘紅酵母NCYC 2666染色體

實施例13步驟2獲得的重組農(nóng)桿AGL1/ZPK-HYG-ADH2p-GFP-Thsp接種于5mL含有卡那霉素(100ng/μL)和利福平(80ng/μL)的LB液體中，250℃，200r/min培養(yǎng)過夜。用無菌水洗滌一遍，調(diào)節(jié)至OD₆₀₀＝1-3，備用。

粘紅酵母NCYC 2666購自于英國國家酵母菌種保藏中心(National Collection of Yeast Cultures，NCYC)。取一環(huán)活化后的粘紅酵母NCYC 2666，接種于5mL YEPD(葡萄糖20.0g/L，酵母提取物10.0g/L，蛋白胨20.0g/L，pH 6.0)中，25℃，200r/min過夜培養(yǎng)。用無菌水洗滌一遍后，調(diào)節(jié)至OD₆₀₀＝1-2，備用。

取上述粘紅酵母NCYC 2666及農(nóng)桿菌稀釋液各200μL，混勻，按實施例13步驟3進行ATMT操作，直至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。

2.粘紅酵母NCYC 2666潮霉素抗性轉(zhuǎn)化子的菌落PCR鑒定

隨機挑取6個遺傳霉素抗性粘紅酵母NCYC 2666轉(zhuǎn)化子接入50mL含有50ng/μL潮霉素的半乳糖培養(yǎng)基(50μg/mL潮霉素、300μg/mL頭孢菌素、1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％棉籽糖，2％半乳糖，PH 6.0)，參考實施例3中所述玻璃珠破壁法提取基因組DNA，采用GFP-NcoI-E1和GFP-NcoI-E2為引物，進行PCR鑒定。結(jié)果證明，GFP基因成功整合進入粘紅酵母NCYC 2666基因組(未顯示)。

3.粘紅酵母NCYC 2666潮霉素抗性轉(zhuǎn)化子的熒光觀察

挑取3個菌落PCR鑒定正確的粘紅酵母NCYC 2666潮霉素抗性轉(zhuǎn)化子單菌落接于5mL YEPD培養(yǎng)基(葡萄糖20.0g/L，酵母提取物10.0g/L，蛋白胨20.0g/L，pH 6.0)中。培養(yǎng)24h，以1:50的接種量接于50mL含有50ng/μL潮霉素的半乳糖培養(yǎng)基(50μg/mL潮霉素、300μg/mL頭孢菌素、1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％棉籽糖，2％半乳糖，PH6.0)，作為二級種子。二級種子培養(yǎng)24h后，取5mL加入45mL的半乳糖培養(yǎng)基中。培養(yǎng)48h后結(jié)束發(fā)酵。取菌液10μL點于載玻片，蓋上蓋玻片后置于熒光顯微鏡進行綠色熒光觀察，激發(fā)波長498nm，發(fā)射波長516，GFP重組粘紅酵母NCYC 2666可觀察到綠色熒光，而對照野生型粘紅酵母NCYC 2666則無熒光出現(xiàn)(未顯示)。

4.重組膠紅酵母CGMCC 2.22中GFP表達分析——Western blot

除了直接通過綠色熒光表型來確定圓紅冬孢酵母ADH2p啟動子可以啟動GFP在紅酵母屬膠紅酵母CGMCC 2.22的表達外，由于重組GFP的C-端攜帶6×His Tag，還可利用抗His Tag抗體通過免疫印跡分析GFP的表達。上述步驟4中PCR鑒定正確的6個轉(zhuǎn)化子，隨機挑取3個，接入10mL的半乳糖培養(yǎng)基(50μg/mL潮霉素、300μg/mL頭孢菌素、1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％棉籽糖，2％半乳糖，PH 6.0)，于30℃搖床培養(yǎng)48h，4000r/min離心10min收集菌株。菌體用無菌水洗滌一遍后，加入400μL的蛋白提取緩沖液(8M尿素,65mM DTT,0.1％Triton X-100,100mM NaCl,50mM Tris-Cl,1mM PMSF,1mM EGTA,1mM EDTA，pH為7.4)重懸，按實施例8的步驟5進行SDS-PAGE和Western blot分析，均可觀察到GFP的表達(未顯示)。