本發(fā)明涉及基因工程制藥領(lǐng)域，尤其是涉及一種耐高溫SOD蛋白及其克隆和純化方法。

背景技術(shù)：

超氧化物歧化酶SOD，是英文Superoxide Dismutase的縮寫，是體內(nèi)對抗自由基的第一道防線。當(dāng)我們身體吸入氧氣進(jìn)行新陳代謝，就會產(chǎn)生超氧陰離子自由基，若不予以消除，會在體內(nèi)產(chǎn)生連鎖反應(yīng)破壞細(xì)胞。正常情況下，體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡。SOD在年輕人的血液中很多，人們過了30歲以后，人體內(nèi)的SOD隨著人體組織的老化而產(chǎn)生率逐漸降低。由于體內(nèi)的SOD隨著年齡的增加而漸減，再加上環(huán)境的惡化，大量的自由基超過身體所能應(yīng)付的程度，因此借助外來的補(bǔ)充是必需的。

SOD的來源極為廣泛，目前已從細(xì)菌、真菌、藻類、魚類、昆蟲、植物和哺乳類動物等各種生物體分離得到。國內(nèi)已開發(fā)的SOD資源有：動物血液（牛、豬等），菌類發(fā)酵（酵母菌、大腸桿菌等），高等植物（藻類、刺梨等）等。動物提取SOD 的主要原料可以是各種哺乳動物血液、肝臟、腦等，然而一些人畜共患病的原因使得許多國家禁止在食品、化妝品、醫(yī)療等領(lǐng)域使用動物來源的SOD。

相對于植物來源的SOD，微生物來源的SOD具有比活力高，含量高的優(yōu)點(diǎn)，微生物的生長也遠(yuǎn)遠(yuǎn)快于植物，此外，各種微生物技術(shù)屬國家重點(diǎn)支持行業(yè)，目前也發(fā)展迅速，這些因素都對微生物來源的SOD實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化具有重大的推動作用。例如，專利號為2011100503115報道了一種用大腸桿菌生產(chǎn)重組人源SOD的方法，但是這個專利集中在重組大腸桿菌的構(gòu)建，并未公開SOD純化方法，而從細(xì)胞內(nèi)獲取SOD時更是采用超聲法，不適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。目前，可以通過在重組蛋白上加上標(biāo)簽，例如His標(biāo)簽或GST標(biāo)簽，在微生物發(fā)酵、細(xì)胞裂解后，通過親和層析得到較高純度的蛋白。然而，這種帶標(biāo)簽的蛋白存在純化成本高、純化結(jié)束后標(biāo)簽的切除等后續(xù)工藝，使得純化過程變得昂貴，工藝也變得復(fù)雜。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種操作簡單、可實(shí)現(xiàn)工業(yè)化大生產(chǎn)的SOD耐高溫具體的構(gòu)建及純化方法，以解決上述問題。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：一種從藍(lán)藻獲取的耐高溫SOD蛋白，該蛋白的cDNA含有600個核苷酸堿基，所述耐高溫SOD蛋白的cDNA具有連同編碼前序列和編碼后序列的完整編碼序列，氨基酸具體基因序列見序列表中的SEQ ID NO.1。

本發(fā)明還提供一對用于擴(kuò)增從藍(lán)藻獲取的耐高溫SOD蛋白的編碼cDNA的引物，其中：

FW為：5’-GGGTTTCATATGATGGCGTTTGTGCAGGAAC-3’，含NdeI酶切位點(diǎn)；

Rev為：5’-CCCAAGCTTCGCCGCTGCTAAGTTTTTC-3’，含HindIII酶切位點(diǎn)。

本發(fā)明還提供一種從藍(lán)藻獲取的耐高溫SOD蛋白的克隆方法，包括以下步驟：

（1）對從藍(lán)藻獲取的耐高溫SOD蛋白的編碼cDNA進(jìn)行大腸桿菌密碼子優(yōu)化編輯進(jìn)行基因合成Fe-SOD全基因序列，具體基因序列見序列表中的SEQ ID NO.1。

（2）以合成的Fe-SOD全基因序列為模板，使用以下引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增30個循環(huán)反應(yīng)，得到預(yù)期基因片段，其中PCR所用的兩種引物為：

FW：5’-GGGTTTCATATGATGGCGTTTGTGCAGGAAC-3’，含NdeI酶切位點(diǎn)；

Rev：5’-CCCAAGCTTCGCCGCTGCTAAGTTTTTC-3’，含HindIII酶切位點(diǎn)。PCR程序如下：第一階段：95℃ 2min；第二階段：95℃ 30s；55℃ 30s；72℃ 20s。第二階段循環(huán)30次，最后一個循環(huán)的最后一步保持72℃ 5min。

（3）將所述預(yù)期基因片段連接到載體上，然后將所述載體轉(zhuǎn)化到重組用大腸桿菌中，并涂布于含有100ug/mL Amp的LB固體培養(yǎng)基平板上，在37℃條件下培養(yǎng)16h～18h進(jìn)行克隆，挑去單克隆菌落進(jìn)行鑒定，鑒定為陽性的所述重組用大腸桿菌再經(jīng)DNA測序驗證基因序列正確，得到重組Fe-SOD的質(zhì)粒。

（4）將所述重組Fe-SOD質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到培育用大腸桿菌中，從而完成菌體的構(gòu)建。

基于上述，所述重組用大腸桿菌為DH5a菌株、JM109菌株或Top10菌株。

基于上述，所述培育用大腸桿菌為BL21菌株或Rosetta（DE3）Plys菌株。

本發(fā)明還提供一種從藍(lán)藻獲取的耐高溫SOD蛋白純化方法，包括以下步驟：

菌體培育：將轉(zhuǎn)化有重組Fe-SOD質(zhì)粒的培育用大腸桿菌置于含有100 mmoL/L的 Amp核苷酸的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12h～16小時后，將培養(yǎng)物按照1：（100～200）的比例接種到500mL 含有100ug/mL Amp新鮮TB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)4h至OD600達(dá)到0.8～1時，向其中加入IPTG終濃度至0.2 mmoL/L，在20℃下誘導(dǎo)12h～16h，從而完成菌體的培育。

菌體收集勻化：離心并收集所述培育菌體，然后將其重新懸浮于由20 mmoL/L的Tris、100 mmoL /L的 NaCL溶液、1 mmoL/L的EDTA、0.5 mmoL/L的PMSF組成的培育緩沖液中進(jìn)行勻化處理。

粗酶提取液制備：向所述培育緩沖液加入T4溶菌酶進(jìn)行孕育20 min～40 min，然后向其中加入Tween20至最終濃度為0.5%并在40℃～60℃溫度下進(jìn)行水浴處理15 min～25 min，經(jīng)離心過濾處理所得上清液即為粗酶提取液。

層析純化：對所述上清液依次進(jìn)行過濾、層析柱層析純化處理，然后對層析后的所述層析柱依次進(jìn)行沖洗、洗雜和洗脫處理，得到富含F(xiàn)e-SOD的洗脫液。

基于上述，所述層析柱為金屬層析柱、陽離子層析柱或陰離子層析柱。

基于上述，所述層析純化的步驟還包括：首先對層析后的所述層析柱依次采用質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.1%的Triton X-114與10 mmoL/L咪唑混合組成的沖洗液沖洗、采用20 mmoL/L咪唑洗雜和采用300 mmoL/L的咪唑洗脫處理；然后收集富含F(xiàn)e-SOD的洗脫液并進(jìn)行超濾、濃縮處理，從而得到高純度的富含F(xiàn)e-SOD的洗脫液。

基于上述，所述層析純化的步驟還包括：按照質(zhì)量比為1：（1～3）向所述高純度的富含F(xiàn)e-SOD的洗脫液中加入含糖物質(zhì)進(jìn)行凍干，并進(jìn)行無菌冷凍、干燥從而制得Fe-SOD凍干粉。

基于上述，所述含糖物質(zhì)為蔗糖或甘露糖。

本發(fā)明相對現(xiàn)有技術(shù)具有突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步，具體的說，本發(fā)明所提供的耐熱型SOD蛋白，其來源于藍(lán)藻其屬于Fe-SOD蛋白，具有分子量小，分子量僅有25kD、熱穩(wěn)定性能好，70℃仍能保持較高的酶活，更有利于蛋白質(zhì)的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的SOD耐高溫純化方法，根據(jù)該耐熱SOD蛋白的良好熱穩(wěn)定性，采用加熱-離心-層析柱純化的純化方法，純化后蛋白純度可達(dá)到95%以上，酶活性可達(dá)到2500 u/mg～3000 u/mg，且在制備粗酶液的過程中，通過溶菌酶的添加及加熱處理，同時達(dá)到細(xì)胞裂解和去除大部分宿主菌中非目的蛋白，達(dá)到初步純化效果，該純化步驟方法簡單，可應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)，節(jié)約成本。

附圖說明

圖1、本發(fā)明提供的耐高溫SOD蛋白的cDNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳鑒定圖。其中，圖中編號說明：泳道1為帶His標(biāo)簽的SOD粗酶提取液，檢出大小為22kD的條帶；泳道2為經(jīng)層析柱層析后的粗酶提取液；泳道3～9為梯度洗脫液；泳道M為蛋白質(zhì)marker。

圖2、本發(fā)明提供的耐高溫SOD的蛋白經(jīng)不同溫度和時間處理后的SDS-PAGE電泳鑒定圖。

具體實(shí)施方式

下面通過具體實(shí)施方式，對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。

實(shí)施例1

本實(shí)施例提供一種從藍(lán)藻獲取的耐高溫SOD蛋白，該蛋白的編碼cDNA為SEQ ID NO.1，含有600個核苷酸堿基，所述編碼cDNA具有連同編碼前序列和編碼后序列的完整編碼序列，具體基因序列見序列表中的SEQ ID NO.1。

其中，用于擴(kuò)增從藍(lán)藻獲取的耐高溫SOD蛋白的編碼cDNA的一對引物包括：

FW為：5’-GGGTTTCATATGATGGCGTTTGTGCAGGAAC-3’，含NdeI酶切位點(diǎn)；

Rev為：5’-CCCAAGCTTCGCCGCTGCTAAGTTTTTC-3’，含HindIII酶切位點(diǎn)。

本實(shí)施例還提供一種從藍(lán)藻獲取的耐高溫SOD蛋白的克隆方法，包括以下步驟：

（1）在無菌條件下，將藍(lán)藻藻種2mL接種到1000mL的藍(lán)藻培養(yǎng)基中，于25℃、2000XL光照強(qiáng)度每天光照10小時并每天搖瓶一次，培養(yǎng)20天后取下層培養(yǎng)物，采用SDS-CATB法抽取藍(lán)藻基因組。

（2）對耐熱型SOD蛋白進(jìn)行大腸桿菌密碼子優(yōu)化編輯進(jìn)行基因合成Fe-SOD全基因序列，其中優(yōu)化后的Fe-SOD全基因序列見序列表中的SEQ ID NO.1。

（3）以合成的Fe-SOD全基因序列為模板，采用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增30個循環(huán)反應(yīng)，得到預(yù)期基因片段。其中PCR程序如下：第一階段：95℃ 2min；第二階段：95℃ 30s；55℃ 30s；72℃ 20s。第二階段循環(huán)30次，最后一個循環(huán)的最后一步保持72℃ 5min。

（4）將所述預(yù)期基因片段連接到載體上，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a中，并涂布于含有100 ug/mL Amp的LB固體培養(yǎng)基平板上37℃培養(yǎng)16h進(jìn)行克隆，挑去單克隆菌落進(jìn)行鑒定，鑒定為陽性克隆的DH5a經(jīng)DNA測序驗證基因序列正確，制得含有重組Fe-SOD的質(zhì)粒，然后將含有重組Fe-SOD的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21-DE3中，完成菌體的構(gòu)建。

本實(shí)施例還提供一種從藍(lán)藻獲取的耐高溫SOD蛋白的純化方法，包括以下步驟：

菌體培育：將轉(zhuǎn)化有重組Fe-SOD質(zhì)粒的大腸桿菌BL21-DE3接種到含有100 ug/mL Amp核苷酸的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h，然后按照1：100的比例將培養(yǎng)所得物接種到含有500mL的100 ug/mL Amp核苷酸的TB培養(yǎng)基中培養(yǎng)3h，至所述標(biāo)記后的Fe-SOD單克隆菌體的OD600達(dá)到0.8，然后向所述TB培養(yǎng)基中加入IPTG（異丙基硫代半乳糖苷）終濃度至0.2 mmoL/L進(jìn)行誘導(dǎo)12h，得到培育菌體。

菌體收集勻化：離心收集所述培育菌體，將其重新懸浮于培育緩沖液中并加入T4溶菌酶進(jìn)行孕育30 min，然后向其中加入Tween20，在50℃溫度下對其進(jìn)行水浴處理20 min，經(jīng)離心過濾處理所得上清液即為粗酶提取液。其中，所述培育緩沖液由20 mmoL/L的Tris（三羥甲基氨基甲烷）、100 mmoL/L的 NaCL溶液、1 mmoL/L的EDTA（乙二胺四乙酸）、0.5 mmoL/L的PMSF（苯甲基磺酰氟）組合。

粗酶提取液制備：首先采用含有10 mmol /L咪唑的所述粗酶提取液平衡Ni層析柱；然后將所述粗酶提取液通過0.45um的濾膜進(jìn)行超濾過濾，過濾后的上清穿過平衡后的Ni層析柱，對層析后的所述Ni層析柱依次采用沖洗復(fù)合緩沖液沖洗、20 mmoL/L咪唑洗雜和300 mmoL/L的咪唑洗脫處理，得到Fe-SOD的洗脫液；其中，所述沖洗緩沖液有質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.1%的Triton X-114（聚氧乙烯單叔辛基苯基醚）與10 mmoL/L咪唑混合而成。

層析純化：將所述富含F(xiàn)e-SOD洗脫液經(jīng)過截留量為10kD的超濾膜系統(tǒng)濃縮處理，然后將濃縮后的Fe-SOD蛋白加入到10倍體積的無菌去離子水再次進(jìn)行濃縮，反復(fù)加水濃縮3次，濃縮至Fe-SOD濃度為20mg/mL得到高純度的富含SOD的洗脫液。

實(shí)施例2

本實(shí)施例提供的一種從藍(lán)藻獲取的耐高溫SOD蛋白，該蛋白的編碼cDNA序列同實(shí)施例1中的基因序列。

本實(shí)施例還提供一種從藍(lán)藻獲取的耐高溫SOD蛋白的克隆方法，具體步驟同實(shí)施例1中的菌體構(gòu)建步驟。

本實(shí)施例提供一種從藍(lán)藻獲取的耐高溫SOD蛋白的純化方法，具體步驟與實(shí)施例1中的步驟大致相同，不同之處在于：

所述菌體培育步驟包括：采用1L的含有濃度為100 ug/mL Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃誘導(dǎo)所述含有重組Fe-SOD的質(zhì)粒的大腸桿菌Rosetta（DE3）Plys菌株16h，然后按照1：200的比例將培養(yǎng)所得物接種到含有濃度為100 ug/mL Amp核苷酸的TB培養(yǎng)基中培養(yǎng)3h，至所述標(biāo)記后的Fe-SOD單克隆菌體的OD600達(dá)到1.0，然后向所述TB培養(yǎng)基中加入IPTG（異丙基硫代半乳糖苷）終濃度至0.2 mmoL/L進(jìn)行誘導(dǎo)12h，得到培育菌體。

所述菌體收集勻化步驟包括：離心收集所述培育菌體，將其重新懸浮于培育緩沖液中并加入T4溶菌酶進(jìn)行孕育30 min，然后向其中加入Tween20至最終濃度0.5%，在45℃溫度下對其進(jìn)行水浴處理20min，經(jīng)離心過濾處理所得上清液即為粗酶提取液。其中，所述培育緩沖液由20mmoL/L的Tris（三羥甲基氨基甲烷）、100mmoL /L的 NaCL溶液、1mmoL /L的EDTA（乙二胺四乙酸）、0.5mmoL /L的PMSF（苯甲基磺酰氟）組合。

所述層析純化步驟還包括：按照質(zhì)量比為1：1的比例向所述高純度的富含F(xiàn)e-SOD的洗脫液溶解混勻后，過濾除菌，無菌分裝后冷凍干燥，即得到淡黃色或白色Fe-SOD凍干粉。

實(shí)施例3

本實(shí)施例提供的一種從藍(lán)藻獲取的耐高溫SOD蛋白的編碼cDNA序列同實(shí)施例1中的基因序列。

本實(shí)施例還提供一種從藍(lán)藻獲取的耐高溫SOD蛋白的克隆方法，具體步驟同實(shí)施例1中的菌體構(gòu)建步驟。

本實(shí)施例提供一種從藍(lán)藻獲取的耐高溫SOD蛋白的純化方法，具體步驟與實(shí)施例1中的步驟大致相同，不同之處在于：

所述菌體收集勻化步驟包括：將發(fā)酵罐中發(fā)酵得到的培育菌體發(fā)酵液用管式離心機(jī)離心，并收集所述培育菌體，離心收集菌體，并將其重懸于20 mmol /L Tris，100 mmol /L NaCL，1mL EDTA，0.5mmol /L pMSF緩沖液中，加入終濃度0.2 mg/mL的 T4 溶菌酶，在4℃下溫育30 min后，再向其中加入Tween 20至終濃度0.5%，混勻后，置于60℃水浴15min，加熱期間攪拌數(shù)次。將加熱后的蛋白溶液在4℃下以10000 rpm離心30min，取上清即為粗酶提取液。所述粗酶提取液可將蛋白純度提高到60%以上。

所述層析純化步驟包括：首先采用含有10 mmol /L咪唑的所述粗酶提取液平衡Ni層析柱；然后將所述粗酶提取液通過0.45um的濾膜進(jìn)行超濾過濾，過濾后的上清穿過平衡后的所述Ni層析柱；對層析后的所述Ni層析柱依次采用沖洗復(fù)合緩沖液沖洗10倍柱體積、20 mmoL/L咪唑沖洗5倍柱體積進(jìn)行洗雜和采用300 mmoL/L的咪唑洗脫處理，重復(fù)上述步驟3～5次，得到純度為95%的Fe-SOD的洗脫液；其中，所述沖洗緩沖液有質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.1%的Triton X-114（聚氧乙烯單叔辛基苯基醚）與10 mmoL/L咪唑混合而成。

性能測試

Fe-SOD活性測試

用GB/T5009.171-2003保健食品中超氧化物歧化酶（SOD）活性測定法中的羥胺法對實(shí)施例1～3所得到的Fe-SOD酶進(jìn)行活性測試，結(jié)果表明：經(jīng)過此方法提取的Fe-SOD酶活可到達(dá)2500 u/mg～3000 u/mg。

Fe-SOD熱穩(wěn)定及電泳測試

同時，對實(shí)施例1～3所得到的Fe-SOD蛋白進(jìn)行酶熱穩(wěn)定測試，所述Fe-SOD熱穩(wěn)定測試的步驟包括：首先將0.4L Fe-SOD菌體發(fā)酵液超聲波破碎，離心取破碎上清液，分別在70℃和90℃下處理15 min、30 min和60 min，將熱處理后Fe-SOD發(fā)酵液上清液10uL并加水稀釋到10mL；然后取50uL稀釋后的上清液，分別在常溫、50℃、70℃、90℃處理不同時間后，采用南京建成總SOD活性測定試劑盒（羥胺法）進(jìn)行測定Fe-SOD殘留活性及采用10%SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳測試。其中，F(xiàn)e-SOD活性的定義為：各處理活性為該處理OD550值減去CK的OD550值,CK為加水活性體系對照；Fe-SOD的相對活性定義為：以Fe-SOD破碎上清的活性（ODsod-ODck）為100%。

電泳結(jié)果如圖1和圖2所示，結(jié)果顯示，所構(gòu)建的SOD耐高溫菌體能檢出大小為22kD的條帶產(chǎn)物，可以據(jù)此判斷出所得產(chǎn)物即為SOD耐高溫菌體；同時可以看出：實(shí)施例1～3所得到的Fe-SOD酶在低于30℃條件下，可長期穩(wěn)定保存且保存2個月內(nèi)酶活性變化不大；在50℃保溫60min后，酶活性保持90%以上；在70℃保溫15min后，酶活性大于95.5%；在70℃保溫30min后酶活性大于89.5%；在70℃保溫1小時后酶活性仍大于76.3%；在90℃處理15min后，酶活性仍大于34.6%。

最后應(yīng)當(dāng)說明的是：以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對其限制；盡管參照較佳實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：依然可以對本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行修改或者對部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明請求保護(hù)的技術(shù)方案范圍當(dāng)中。