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耐高溫SOD蛋白及其克隆和純化方法與流程

文檔序號:12577489閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.一種從藍藻獲取的耐高溫SOD蛋白,該蛋白的cDNA含有600個核苷酸堿基,所述耐高溫SOD蛋白的cDNA具有連同編碼前序列和編碼后序列的完整編碼序列,氨基酸具體基因序列見序列表中的SEQ ID NO.1。

2.一對用于擴增從藍藻獲取的耐高溫SOD蛋白的編碼cDNA的引物,其特征在于,

FW為:5’-GGGTTTCATATGATGGCGTTTGTGCAGGAAC-3’,含NdeI酶切位點;

Rev為:5’-CCCAAGCTTCGCCGCTGCTAAGTTTTTC-3’,含HindIII酶切位點。

3.一種從藍藻獲取的耐高溫SOD蛋白的克隆方法,包括以下步驟:

(1)對從藍藻獲取的耐高溫SOD蛋白的編碼cDNA進行大腸桿菌密碼子優(yōu)化編輯進行基因合成Fe-SOD全基因序列,具體基因序列見序列表中的SEQ ID NO.1;

(2)以合成的Fe-SOD全基因序列為模板,使用以下引物進行PCR擴增30個循環(huán)反應(yīng),得到預(yù)期基因片段,其中PCR所用的兩種引物為:

FW:5’-GGGTTTCATATGATGGCGTTTGTGCAGGAAC-3’,含NdeI酶切位點;

Rev:5’-CCCAAGCTTCGCCGCTGCTAAGTTTTTC-3’,含HindIII酶切位點;

(3)將所述預(yù)期基因片段連接到載體上,然后將所述載體轉(zhuǎn)化到重組用大腸桿菌中,并涂布于含有100ug/mL Amp的LB固體培養(yǎng)基平板上,在37℃條件下培養(yǎng)16h~18h進行克隆,挑去單克隆菌落進行鑒定,鑒定為陽性的所述重組用大腸桿菌再經(jīng)DNA測序驗證基因序列正確,得到重組Fe-SOD的質(zhì)粒;

(4)將所述重組Fe-SOD質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到培育用大腸桿菌中,從而完成菌體的構(gòu)建。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的從藍藻獲取的耐高溫SOD蛋白的克隆方法,其特征在于,所述重組用大腸桿菌為DH5a菌株、JM109菌株或Top10菌株。

5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的從藍藻獲取的耐高溫SOD蛋白的克隆方法,其特征在于,所述培育用大腸桿菌為BL21菌株或Rosetta(DE3)Plys菌株。

6.一種從藍藻獲取的耐高溫SOD蛋白純化方法,包括以下步驟:

菌體培育:將轉(zhuǎn)化有重組Fe-SOD質(zhì)粒的培育用大腸桿菌置于含有100 mmoL/L的Amp核苷酸的LB液體培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)12h~16小時后,將培養(yǎng)物按照1:(100~200)的比例接種到500mL 含有100ug/mL Amp新鮮TB培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)4h至OD600達到0.8~1時,向其中加入IPTG終濃度至0.2 mmoL/L,在20℃下誘導(dǎo)12h~16h,從而完成菌體的培育;

菌體收集勻化:離心并收集所述培育菌體,然后將其重新懸浮于由20 mmoL/L的Tris、100 mmoL /L的 NaCL溶液、1 mmoL/L的EDTA、0.5 mmoL/L的PMSF組成的培育緩沖液中進行勻化處理;

粗酶提取液制備:向所述培育緩沖液加入T4溶菌酶進行孕育20 min~40 min,然后向其中加入Tween20至最終濃度為0.5%并在40℃~60℃溫度下進行水浴處理15 min~25 min,經(jīng)離心過濾處理所得上清液即為粗酶提取液;

層析純化:對所述上清液依次進行過濾、層析柱層析純化處理,然后對層析后的所述層析柱依次進行沖洗、洗雜和洗脫處理,得到富含F(xiàn)e-SOD的洗脫液。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的從藍藻獲取的耐高溫SOD蛋白的純化方法,其特征在于,所述層析柱為金屬層析柱、陽離子層析柱或陰離子層析柱。

8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的從藍藻獲取的耐高溫SOD蛋白的純化方法,其特征在于,所述層析純化的步驟還包括:

首先對層析后的所述層析柱依次采用質(zhì)量百分數(shù)為0.1%的Triton X-114與10 mmoL/L咪唑混合組成的沖洗液沖洗、采用20 mmoL/L咪唑洗雜和采用300 mmoL/L的咪唑洗脫處理;然后收集富含F(xiàn)e-SOD的洗脫液并進行超濾、濃縮處理,從而得到高純度的富含F(xiàn)e-SOD的洗脫液。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的從藍藻獲取的耐高溫SOD蛋白的純化方法,其特征在于,所述層析純化的步驟還包括:按照質(zhì)量比為1:(1~3)向所述高純度的富含F(xiàn)e-SOD的洗脫液中加入含糖物質(zhì)進行凍干,并進行無菌冷凍、干燥從而制得Fe-SOD凍干粉。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的從藍藻獲取的耐高溫SOD蛋白的純化方法,其特征在于,所述含糖物質(zhì)為蔗糖或甘露糖。

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