本發(fā)明涉及一種利用以高溫酯酶為主的復(fù)合酶制劑去除廢紙漿中膠黏物的方法。

背景技術(shù)：

近年來，廢紙漿在全球紙漿消費(fèi)總量中占比已超過60％。廢紙作為我國制漿造紙工業(yè)的一種重要原料，廢紙的再利用不僅可以節(jié)約大量植物纖維原料、降低生產(chǎn)成本，而且對于實現(xiàn)節(jié)能降耗、緩解環(huán)境污染有著深遠(yuǎn)的意義。然而膠黏物的形成和控制問題在實際的廢紙回收利用過程中日益凸顯，膠黏物是指廢紙回用過程中各種來源不同且具有永久或者臨時黏性并可在造紙過程中引起問題和引起產(chǎn)品質(zhì)量下降的所有物質(zhì)。膠黏物主要來源于廢紙中的熱熔物、壓敏物、施膠劑、涂布膠黏物和油墨殘留物等,這些物質(zhì)主要由聚丙烯酸酯、聚醋酸乙烯酯等與其他雜質(zhì)混合而成,它們通過酯鍵將膠黏物的基本結(jié)構(gòu)組分連接在一起。由于膠黏物在漿料體系中呈現(xiàn)負(fù)電性，因而可以吸附各種陽離子物質(zhì)，因此在制漿造紙過程中就容易造成堵塞網(wǎng)孔、出現(xiàn)紙張空洞、產(chǎn)生陰離子垃圾、引起斷紙以及紙機(jī)停機(jī)等問題。

目前，去除和控制漿料中膠黏物的方法主要采用機(jī)械法和化學(xué)法。機(jī)械法包括篩選、凈化、洗滌、浮選以及熱分散等物理方法，主要用來去除廢紙漿中的大膠黏物?；瘜W(xué)法則通過添加膠黏物控制機(jī)，利用化學(xué)吸附、改性、分散、表面鈍化等方法來去除微細(xì)膠黏物。這些方法為廢紙造紙企業(yè)常用的膠黏物控制方法，雖然有一定的去除效果，然而存在高耗能、效率低、易產(chǎn)生大量工業(yè)廢水等問題，而且去除效率還要受設(shè)備性能的優(yōu)劣等諸多因素的影響。

生物酶具有高效、專一、穩(wěn)定的催化性，而且對環(huán)境無污染，因此在制漿造紙領(lǐng)域的應(yīng)用受到了越來越多的關(guān)注，近年來許多企業(yè)利用生物酶法處理廢紙回收過程中的膠黏物問題。隨著酶工程技術(shù)的發(fā)展，生物酶的催化效率，底物特異性及穩(wěn)定性可進(jìn)一步被提高，更適合用于實際生產(chǎn)。目前用于造紙工業(yè)的生物酶制劑有蛋白酶、纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶、脂肪酶及酯酶等。其中脂肪酶及酯酶是一類羧酸酯水解酶，具有加快黏性物質(zhì)酯鍵的斷裂，使其黏附物體積變小及黏附效率減弱的特性，可用于控制和去除廢紙中的膠黏物。酯鍵一旦斷裂，膠黏物的基本組分很難在系統(tǒng)中重新聚合，而且生物酶可以自行降解，不會污染環(huán)境。萬金泉等[萬金泉等，脫墨紙漿中膠黏物生物酶法處理]利用脂肪酶對脫墨紙漿中膠黏物進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)不同種類的脂肪酶處理效果不同,但在通常的制漿條件下很難實現(xiàn)較好的處理效果。林濤等[林濤等，膠黏物控制酶在廢紙?zhí)幚碇械膽?yīng)用]利用生物酶optimyze525處理廢紙膠黏物，膠黏物去除率達(dá)到29.9％。閆曉婷等[閆曉婷等，酯酶與表面活性劑復(fù)配控制OCC漿中的膠黏物]利用酯酶與表面活性劑復(fù)配來去除OCC廢紙漿中的膠黏物，去除率達(dá)到47.26％。

雖然普通的脂肪酶及酯酶有一定的膠黏物去除效果，但是廢紙漿成分較為復(fù)雜，含有大量能夠使生物酶失活的化學(xué)物質(zhì)，且高溫等極端環(huán)境易導(dǎo)致生物酶制劑在實際生產(chǎn)應(yīng)用的效率受到抑制，因此具有耐受強(qiáng)酸堿、有機(jī)溶劑及高溫處理條件的生物酶更能滿足造紙工業(yè)的生產(chǎn)需求。極端微生物是一類能夠在火山口、極地、深海沉積物或溫泉等極端環(huán)境生長的微生物，其所產(chǎn)生酶類在苛刻的催化反應(yīng)條件下仍可以保持良好的催化活性。例如，來源于嗜熱古細(xì)菌Pyrobaculum calidifontis VA1的酯酶Est在100℃保溫2小時及在含有80％有機(jī)溶劑條件下保持1小時，其催化活力沒有明顯的減少。從宏基因組文庫中篩選獲得一個高溫酯酶EstE1最適合反應(yīng)溫度為70℃，且在80℃保溫2小時催化活力保持不變。來源于古菌Archaeoglobus fulgidus的脂酶AFEST的最適反應(yīng)溫度為70℃，同時表現(xiàn)出良好的熱穩(wěn)定性，這些來源于極端微生物的酯酶表現(xiàn)出良好的催化性能及結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，可作為造紙工業(yè)應(yīng)用的重要候選酶制劑。同時，廢紙膠黏物中的成分較為復(fù)雜，還包括少量淀粉、果膠等其它物質(zhì)，因此將多種酶進(jìn)行復(fù)配來降解廢紙漿中的膠黏物，效果更為理想。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有的廢紙膠黏物去除工藝中高耗能、效率低、易產(chǎn)生大量工業(yè)廢水以及普通生物酶在高溫環(huán)境中易失活等問題。本發(fā)明提供一種以高溫酯酶TTEST為主的復(fù)合酶制劑去除廢紙漿中膠黏物的方法，本發(fā)明提供的工藝簡單、效果明顯、易于操作。

本發(fā)明為實現(xiàn)上述目的，技術(shù)方案如下：

一種利用復(fù)合酶制劑去除廢紙漿中膠黏物的方法，包括如下步驟：

(1)高溫酯酶TTEST的制備：

將酯酶TTEST菌種接種到種子液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)，再將菌種接種到發(fā)酵培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)，制備得到高溫酯酶TTEST粗酶液，將高溫酯酶TTEST粗酶液純化，用對硝基苯酚比色法測定高溫酯酶TTEST的酶活。所述的酯酶TTEST的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

(2)將高溫酯酶TTEST與淀粉酶、果膠酶、木聚糖酶、甘油、聚乙二醇、水復(fù)配成復(fù)合酶制劑，按照質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計，所述復(fù)合酶制劑由以下組分組成：

利用復(fù)合酶制劑處理廢紙漿，根據(jù)TAPPIT-277標(biāo)準(zhǔn)法檢測廢紙漿中膠黏物含量。

所述復(fù)合酶制劑的添加量為所述廢紙漿絕干漿質(zhì)量的0.1％～1.0％，處理溫度為40～80℃，處理時間45～120min，pH為6.0～9.0，攪拌轉(zhuǎn)速為100～150rpm。

所述復(fù)合酶處理廢紙漿的溫度為50℃～55℃，所述復(fù)合酶處理廢紙漿的攪拌條件為120rpm，反應(yīng)時間為60min。

所述復(fù)合酶的添加量為所述廢紙漿絕干漿質(zhì)量的0.3％～0.5％。

所述復(fù)合酶處理廢紙漿的pH為7.0～8.0。

所述廢紙漿的漿濃為4％～6％。

所述高溫酯酶的酶活為3500U/g。

所述淀粉酶酶活為5000U/g，果膠酶酶活為5000U/g，木聚糖酶酶活為10000U/g。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：

(1)本發(fā)明中的高溫酯酶TTEST制備較為容易，效果明顯。

(2)本發(fā)明中的復(fù)合酶制劑可以應(yīng)對廢紙回收工藝中的各種高溫以及酸堿環(huán)境，在高溫條件下仍能保持較好的膠黏物去除效果。

(3)本發(fā)明通過以高溫酯酶為主的復(fù)合酶制劑去除廢紙膠黏物的方法可直接在生產(chǎn)線上進(jìn)行，無須增加任何機(jī)械設(shè)備，操作簡單，成本低。

因此，本發(fā)明通過以高溫酯酶為主的復(fù)合酶制劑控制廢紙漿中的膠黏物的方法高效、穩(wěn)妥地解決了過去在廢紙造紙領(lǐng)域嚴(yán)重影響產(chǎn)品質(zhì)量膠黏物問題，具有操作簡單、去除效果顯著、生產(chǎn)成本低、無污染等優(yōu)點(diǎn)。

具體實施方式

通過實施例更詳細(xì)地介紹本發(fā)明的實施。在所述實施例中，所述加酶量相對于絕干漿質(zhì)量計算，實驗結(jié)果均重復(fù)三次取平均數(shù)。本發(fā)明所使用的酯酶，其蛋白序列號已被蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫公布(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)；來源于Thermus thermophilus HB8菌種的酯酶TTEST,PDB ID:1ufo，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

酯酶TTEST的制備過程：利用全基因合成方法獲取的TTEST酯酶的編碼基因，并克隆到表達(dá)載體pET23a-CBD載體上獲得重組表達(dá)載體。利用CaCl2轉(zhuǎn)化法，將含有TTEST酯酶編碼基因的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21(DE3)菌種中，獲得基因工程菌。將酯酶TTEST的菌種接到含Amp(100ug/ml)的LB種子培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)OD值達(dá)到0.6～0.8時，將菌液按照1:100的比例接種到含Amp(100ug/ml)的LB發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖至OD值為0.6～0.8時加入IPTG(20mmol/L)誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，18～24h后收菌。將菌液在12000r/min條件下離心10min后收集管壁細(xì)胞進(jìn)行超聲破碎，之后再以12000r/min條件離心10min后取上清液，即得到粗酶液。已有研究報道利用纖維素與酯酶進(jìn)行特異性結(jié)合，之后再用3C蛋白酶進(jìn)行酶切從而得到純酶。1L菌液對應(yīng)1g纖維素，常溫下將粗酶液與纖維素結(jié)合30min，適時攪拌。結(jié)合后高速離心10min，棄去上清液，將吸附蛋白用PBS緩沖液洗兩次。3C蛋白酶在使用前先離心、棄去上清，利用PBS緩沖液清洗2次。向吸附蛋白中加入適量PBS，按1L菌液對應(yīng)1ml 3C蛋白酶的比例混勻后酶切4h或過夜。酶切后高速離心，上清液即為純酶。之后利用對硝基苯酚比色法測定制備的高溫酯酶TTEST的酶活，測得酶活為3500U/g。

其余淀粉酶酶活為5000U/g，果膠酶酶活為5000U/g，木聚糖酶酶活為10000U/g。

脂肪酶CALB為商品化脂肪酶，測得酶活為150.0U/ml。

實施例1

酯酶TTEST與淀粉酶、果膠酶、木聚糖酶、甘油、聚乙二醇、水復(fù)配的復(fù)合酶制劑，按照質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計，所述復(fù)合酶制劑由以下組分組成：

稱取100g OCC絕干漿，稀釋漿濃至4％，復(fù)合酶添加量為所述廢紙漿絕干漿質(zhì)量的0.3％，處理溫度為40℃，pH為6.0，處理時間45min，攪拌轉(zhuǎn)速為100rpm，實施例按照TAPPIT-277膠黏物測定法利用Pulmac-MasterScreen篩分儀將漿料進(jìn)行篩選，之后將篩出的膠黏物進(jìn)行染色、壓片，最后用掃描軟件進(jìn)行分析掃描，進(jìn)而測得酶處理后的膠黏物含量。在不加酶的情況下，用其余相同條件處理廢紙漿，實驗測定結(jié)果為空白組膠黏物含量。

實施例2

酯酶TTEST與淀粉酶、果膠酶、木聚糖酶、甘油、聚乙二醇、水復(fù)配的復(fù)合酶制劑，按照質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計，所述復(fù)合酶制劑由以下組分組成：

稱取100g OCC絕干漿，稀釋漿濃至5％，復(fù)合酶添加量為所述廢紙漿絕干漿質(zhì)量的0.5％，處理溫度為55℃，pH為7.0，處理時間60min，攪拌轉(zhuǎn)速為120rpm，實施例按照TAPPIT-277膠黏物測定法利用Pulmac-MasterScreen篩分儀將漿料進(jìn)行篩選，之后將篩出的膠黏物進(jìn)行染色、壓片，最后用掃描軟件進(jìn)行分析掃描，進(jìn)而測得酶處理后的膠黏物含量。在不加酶的情況下，用其余相同條件處理廢紙漿，實驗測定結(jié)果為空白組膠黏物含量。

實施例3

酯酶TTEST與淀粉酶、果膠酶、木聚糖酶、甘油、聚乙二醇、水復(fù)配的復(fù)合酶制劑，按照質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計，所述復(fù)合酶制劑由以下組分組成：

稱取100g OCC絕干漿，稀釋漿濃至6％，復(fù)合酶添加量為所述廢紙漿絕干漿質(zhì)量的1.0％，處理溫度為80℃，pH為9.0，處理時間120min，攪拌轉(zhuǎn)速為150rpm，實施例按照TAPPIT-277膠黏物測定法利用Pulmac-MasterScreen篩分儀將漿料進(jìn)行篩選，之后將篩出的膠黏物進(jìn)行染色、壓片，最后用掃描軟件進(jìn)行分析掃描，進(jìn)而測得酶處理后的膠黏物含量。在不加酶的情況下，用其余相同條件處理廢紙漿，實驗測定結(jié)果為空白組膠黏物含量。

對比實施例1

加入脂肪酶CALB代替復(fù)合酶處理廢紙漿，其他條件與實施例1相同，對比實施例按照TAPPIT-277膠黏物測定法利用Pulmac-MasterScreen篩分儀將漿料進(jìn)行篩選，之后將篩出的膠黏物進(jìn)行染色、壓片，最后用掃描軟件進(jìn)行分析掃描，進(jìn)而測得酶處理后的膠黏物含量。在不加酶的情況下，用其余相同條件處理廢紙漿，實驗測定結(jié)果為空白組膠黏物含量。

對比實施例2

加入脂肪酶CALB代替復(fù)合酶處理廢紙漿，其他條件與實施例2相同，對比實施例按照TAPPIT-277膠黏物測定法利用Pulmac-MasterScreen篩分儀將漿料進(jìn)行篩選，之后將篩出的膠黏物進(jìn)行染色、壓片，最后用掃描軟件進(jìn)行分析掃描，進(jìn)而測得酶處理后的膠黏物含量。在不加酶的情況下，用其余相同條件處理廢紙漿，實驗測定結(jié)果為空白組膠黏物含量。

對比實施例3

加入脂肪酶CALB代替復(fù)合酶處理廢紙漿，其他條件與實施例3相同，對比實施例按照TAPPIT-277膠黏物測定法利用Pulmac-MasterScreen篩分儀將漿料進(jìn)行篩選，之后將篩出的膠黏物進(jìn)行染色、壓片，最后用掃描軟件進(jìn)行分析掃描，進(jìn)而測得酶處理后的膠黏物含量。在不加酶的情況下，用其余相同條件處理廢紙漿，實驗測定結(jié)果為空白組膠黏物含量。

表1

由表1可知，在40～55℃條件下，加入復(fù)合酶處理后的廢紙漿中膠黏物含量明顯減少，膠黏物去除率可達(dá)60.8％～74.1％，要明顯優(yōu)于脂肪酶CALB的去除效果。即使在80℃高溫條件下，加入復(fù)合酶后的處理效果也較為理想，廢紙漿中的膠黏物去除率達(dá)到58.5％，而脂肪酶CALB在此條件下基本失活，難以去除膠黏物?？紤]到廢紙造紙過程中不同工段的溫度不盡相同，酯酶PCEST在廢紙回收不同工段中去除膠黏物的效果都較為理想。