本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種二肽酶突變體及其編碼基因和應(yīng)用。

背景技術(shù)：
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有機(jī)磷化合物屬于磷酸酯或磷酸硫醇類衍生物。世界首例有機(jī)磷化合物四乙基焦磷酸酯于1937年被人工合成，二戰(zhàn)期間沙林、索曼等有機(jī)磷化合物曾被用作化學(xué)武器，而在現(xiàn)代有機(jī)磷被作為農(nóng)藥、石油添加劑、增塑劑、阻燃劑等在工農(nóng)業(yè)中廣泛使用。以農(nóng)藥為例，目前有機(jī)磷類農(nóng)藥有100余種，占世界農(nóng)藥總使用量的38％。我國是農(nóng)藥生產(chǎn)和使用大國，2015年化學(xué)農(nóng)藥原藥年產(chǎn)量達(dá)374萬噸，其中有機(jī)磷農(nóng)藥占近一半，我國有機(jī)磷類農(nóng)藥使用量約每年8萬噸。有機(jī)磷化合物能與乙酰膽堿酯酶等受體蛋白絲氨酸特異結(jié)合，對(duì)高等動(dòng)物具有強(qiáng)神經(jīng)毒性。人類活動(dòng)持續(xù)過度使用的有機(jī)磷化合物經(jīng)地表徑流和土壤滲漏進(jìn)入江河，最終匯入海洋，可顯著影響微藻、甲殼類動(dòng)物、棘皮動(dòng)物和魚類的生長發(fā)育。有機(jī)磷污染已成為全球性環(huán)境問題，有機(jī)磷化合物殘留在土壤、河流、江河入?？?、近岸海洋等區(qū)域被廣泛檢測到，并對(duì)人類健康造成威脅，據(jù)估計(jì)每年有近300萬起因攝入有機(jī)磷化合物引發(fā)的中毒事件。

微生物徹底礦化有機(jī)磷化合物轉(zhuǎn)變?yōu)槟芰啃杞?jīng)歷水解、氧化等多步反應(yīng)，其中對(duì)磷氧烷基或磷氧芳基酯鍵的水解是有機(jī)磷化合物解毒最為關(guān)鍵的一步，而此步反應(yīng)由微生物體內(nèi)的有機(jī)磷水解酶催化。有機(jī)磷水解酶，亦稱磷酸三酯酶(EC 3.1.8)，該類酶包含兩個(gè)亞類：一是芳二烷基磷酸酯酶(EC 3.1.8.1)，傾向水解含P-O的有機(jī)磷酸三酯類化合物；另一類是二異丙基氟磷酸水解酶(EC 3.1.8.2)，傾向水解含P-F或P-CN鍵的有機(jī)磷酸酯類化合物。目前研究較多的微生物有機(jī)磷水解酶主要包括三類：有機(jī)磷水解酶(organophosphorus hydrolase，OPH)、甲基對(duì)硫磷水解酶(methyl parathion hydrolase，MPH)和有機(jī)磷酸酐酶(organophosphorous acid anhydrolase，OPAA)。OPH，MPH和OPAA在結(jié)構(gòu)上無相似性，但都是二價(jià)金屬酶，依靠金屬離子去質(zhì)子化水分子實(shí)現(xiàn)對(duì)磷酸酯鍵的攻擊。有機(jī)磷水解酶降解有機(jī)磷類異型生物質(zhì)的活性均來自具有其他功能的常見蛋白結(jié)構(gòu)域。OPH屬于氨基水解酶超家族，具有典型的(α/β)8桶結(jié)構(gòu)；MPH屬于β-內(nèi)酰胺酶超家族，能高效水解甲基對(duì)硫磷，該類酶僅在中國發(fā)現(xiàn)；OPAA來源于肽酶M24B家族，該家族蛋白羧基端都由保守的皮塔餅結(jié)構(gòu)構(gòu)成。OPH和MPH都能水解信號(hào)分子高絲氨酸內(nèi)酯，內(nèi)酯酶活性是對(duì)氧磷酶活性的10²-10⁶倍，提示這兩類有機(jī)磷水解酶由細(xì)菌群感效應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白進(jìn)化而來。已鑒定的OPAA一級(jí)結(jié)構(gòu)與脯氨酸二肽酶高度同源，這類肽酶在細(xì)菌體內(nèi)參與膠原蛋白利用過程，介導(dǎo)脯氨酸的釋放，為微生物體提供營養(yǎng)，而有機(jī)磷水解酶是其混雜活性，通常對(duì)含有P＝S鍵的有機(jī)磷類化合物催化活力極微弱，利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)改良這類肽酶可增強(qiáng)該酶水解有機(jī)磷化合物的能力，使其成為有機(jī)磷類污染物修復(fù)工具酶源。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中二肽酶OPAA4301對(duì)有機(jī)磷化合物水解活力較弱的不足，提供了一類水解有機(jī)磷化合物活性提高的二肽酶突變體及其編碼基因和應(yīng)用。

發(fā)明人從分離自南海沉積物(18°0’N，109°42′E，-63m水深)的假交替單胞菌(Pseudoalteromonas sp.)SCSIO 04301中鑒定一條編碼假定二肽酶OPAA4301(Genbank accession NO.WP_036973676)的基因opaa4301(其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)，對(duì)應(yīng)的氨基酸序列(如SEQ ID NO.1所示)與大腸桿菌來源的M24家族脯氨酸二肽酶PepQ(PDB code:4QR8)的氨基酸一致性達(dá)51％，體外活性表征表明該基因合成的二肽酶OPAA4301同時(shí)具有水解對(duì)氧磷(k_cat/K_m＝(0.935±0.089)×10³M^-1s^-1)和二肽底物Gly-Pro(k_cat/K_m＝(7.684±1.242)×10⁴M^-1s^-1)活性，催化二肽底物的能力是對(duì)氧磷的近100倍。與此同時(shí)對(duì)含有P＝S鍵的有機(jī)磷類化合物催化活力極微弱(k_cat/K_m＝1.24±0.01M^-1s^-1)。

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中二肽酶OPAA4301對(duì)有機(jī)磷化合物水解活力較弱的不足，利用基因突變技術(shù)改造二肽酶OPAA4301以提高其水解有機(jī)磷化合物的活性，進(jìn)而提供了系列水解對(duì)氧磷和甲基對(duì)硫磷活性提高的二肽酶突變體及其編碼基因，含有二肽酶突變體編碼基因的重組表達(dá)載體和含有該重組表達(dá)載體的重組菌及其制備方法，以及二肽酶突變體在水解有機(jī)磷化合物及修復(fù)有機(jī)磷化合物污染中的應(yīng)用。

二肽酶OPAA4301的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，該二肽酶OPAA4301同時(shí)具有二肽酶和有機(jī)磷水解酶活性，對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)氧磷和甲基對(duì)硫磷的催化速率常數(shù)(k_cat/K_m)分別為(0.935±0.089)×10³M^-1s^-1和1.24±0.01M^-1s^-1。為提高二肽酶OPAA4301對(duì)對(duì)氧磷和甲基對(duì)硫磷的水解活性，發(fā)明人通過對(duì)其底物結(jié)合相關(guān)的區(qū)域(小底物結(jié)合口袋、大底物結(jié)合口袋和離去結(jié)合位點(diǎn))氨基酸進(jìn)行蛋白質(zhì)工程改造技術(shù)，分別以上述兩種農(nóng)藥為底物從突變文庫中篩選有益突變體，并對(duì)有益突變進(jìn)行組合。

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一類水解有機(jī)磷化合物活性提高的二肽酶突變體，其特征在于，其為二肽酶突變體D45W、H226G、Y292F/L366F、D45W/H226G、D45W/Y292F/L366F、D45W/H226G/Y292F/L366F、H343I、L225Y/H226L或L225Y/H226L/H343I；

所述的二肽酶突變體D45W，與SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相比，其是將SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第45位天冬氨酸替換為色氨酸，其它與SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相同；

所述的二肽酶突變體H226G，與SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相比，其是將SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第226位組氨酸替換為甘氨酸，其它與SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相同；

所述的二肽酶突變體Y292F/L366F，與SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相比，其是將SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第292位酪氨酸和第366位亮氨酸同時(shí)替換為苯丙氨酸，其它與SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相同；

所述的二肽酶突變體D45W/H226G，與SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相比，其是將SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第45位天冬氨酸替換為色氨酸，同時(shí)第226位組氨酸替換為甘氨酸，其它與SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相同；

所述的二肽酶突變體D45W/Y292F/L366F，與SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相比，其是將SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第45位天冬氨酸替換為色氨酸，同時(shí)第292位酪氨酸替換為苯丙氨酸，同時(shí)第366位亮氨酸替換為苯丙氨酸，其它與SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相同；

所述的二肽酶突變體D45W/H226G/Y292F/L366F，與SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相比，其是將SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第45位天冬氨酸替換為色氨酸，同時(shí)第226位組氨酸替換為甘氨酸，同時(shí)第292位酪氨酸替換為苯丙氨酸，同時(shí)第366位亮氨酸替換為苯丙氨酸，其它與SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相同；

所述的二肽酶突變體H343I，與SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相比，其是將SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第343位組氨酸替換為異亮氨酸，其它與SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相同；

所述的二肽酶突變體L225Y/H226L，與SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相比，其是將SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第225位亮氨酸替換為酪氨酸，同時(shí)第226位組氨酸替換為亮氨酸，其它與SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相同；

所述的二肽酶突變體L225Y/H226L/H343I，與SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相比，其是將SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第225位亮氨酸替換為酪氨酸，同時(shí)第226位組氨酸替換為亮氨酸，同時(shí)第343為組氨酸替換為異亮氨酸，其它與SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相同。

所述的二肽酶突變體水解對(duì)氧磷活力較佳的情況是：對(duì)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列第45、226、292、366位氨基酸殘基中的一個(gè)或者多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行氨基酸替換后形成的新的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的二肽酶突變體。所述的二肽酶突變體水解甲基對(duì)硫磷活力較佳的情況是：對(duì)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列第225、226、342、343位氨基酸殘基中的一個(gè)或者多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行氨基酸替換后形成的新的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的二肽酶突變體。

所述的二肽酶突變體水解對(duì)氧磷活力最佳的情況是：同時(shí)對(duì)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的二肽酶的第45、226位氨基酸殘基經(jīng)過氨基酸替換的新氨基酸序列對(duì)應(yīng)的二肽酶突變體D45W/H226G。所述的二肽酶突變體水解甲基對(duì)硫磷活力最佳的情況是：同時(shí)對(duì)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的二肽酶的第225、226、343位氨基酸殘基經(jīng)過氨基酸替換的新氨基酸序列對(duì)應(yīng)的二肽酶突變體L225Y/H226L/H343I。

所述的二肽酶突變體的制備可以是從表達(dá)該蛋白的重組菌中分離獲得，也可以是人工合成獲得。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供上述二肽酶突變體的編碼基因。

編碼基因可以從含二肽酶突變體的編碼基因的重組表達(dá)質(zhì)?；蛑亟M轉(zhuǎn)化體中分離獲得，也可以通過人工全基因序列合成獲得。由于密碼子存在簡并性，本發(fā)明所述的編碼基因不限于一種，還可適當(dāng)引入替換以提供多聚核苷酸的同系物。本發(fā)明的多聚核苷酸同系物可通過維持上述二肽酶突變體的氨基酸序列的基礎(chǔ)上對(duì)基因片段中的一個(gè)或多個(gè)堿基進(jìn)行替換制得。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供含有上述二肽酶突變體的編碼基因的重組表達(dá)載體。

所述的重組表達(dá)載體的制備方法為將編碼本發(fā)明所述的二肽酶突變體的編碼基因連接于各種異源表達(dá)載體上構(gòu)建而成。所述的異源表達(dá)載體可為本領(lǐng)域常規(guī)各類質(zhì)粒。

本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供含有上述重組表達(dá)載體的重組菌。

所述的重組菌可通過將上述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞中制得。所述的宿主細(xì)胞可為本領(lǐng)域常規(guī)宿主細(xì)胞，可供實(shí)現(xiàn)重組表達(dá)載體穩(wěn)定自主復(fù)制，且所攜帶的本發(fā)明提供的編碼基因可被有效表達(dá)。所述的轉(zhuǎn)化方法為本領(lǐng)域常規(guī)方法，如熱激法、原生質(zhì)體融合法、電轉(zhuǎn)化法。重組菌用于制備二肽酶突變體。

本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供上述二肽酶突變體在水解有機(jī)磷化合物中的應(yīng)用。

上述的二肽酶突變體D45W、H226G、Y292F/L366F、D45W/H226G、D45W/Y292F/L366F、D45W/H226G/Y292F/L366F在水解對(duì)氧磷中的應(yīng)用。

上述的二肽酶突變體H343I、L225Y/H226L、L225Y/H226L/H343I在水解甲基對(duì)硫磷中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第六個(gè)目的是提供上述二肽酶突變體在有機(jī)磷化合物污染修復(fù)中的應(yīng)用。

上述的二肽酶突變體D45W、H226G、Y292F/L366F、D45W/H226G、D45W/Y292F/L366F、D45W/H226G/Y292F/L366F在對(duì)氧磷污染修復(fù)中的應(yīng)用。

上述的二肽酶突變體H343I、L225Y/H226L、L225Y/H226L/H343I在甲基對(duì)硫磷污染修復(fù)中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于：針對(duì)海洋細(xì)菌二肽酶OPPA4301水解有機(jī)磷化合物混雜活性低的問題，以二肽酶OPAA4301作為蛋白質(zhì)工程改造的起點(diǎn)，通過對(duì)底物結(jié)合區(qū)域氨基酸殘基的進(jìn)化與篩選，并組合有益突變，獲得分別水解對(duì)氧磷和甲基對(duì)硫磷活性大幅提高的一系列二肽酶突變體。二肽酶突變體D45W、H226G、Y292F/L366F、D45W/H226G、D45W/Y292F/L366F、D45W/H226G/Y292F/L366F，相較于野生型二肽酶OPAA4301，水解對(duì)氧磷的催化速率常數(shù)k_cat/K_m均顯著提高，H343I、L225Y/H226L、L225Y/H226L/H343I，相較于野生型二肽酶OPAA4301，水解甲基對(duì)硫磷的催化速率常數(shù)k_cat/K_m均顯著提高。水解對(duì)氧磷最優(yōu)二肽酶突變體D45W/H226G的催化速率常數(shù)k_cat/K_m為(2.96±0.05)×10⁴M^-1s^-1，相較于野生型二肽酶OPAA4301提高了30.68倍；水解甲基對(duì)硫磷最優(yōu)二肽酶突變體L225Y/H226L/H343I的催化速率常數(shù)k_cat/K_m為(1.10±0.02)×10⁴M^-1s^-1，相較于野生型二肽酶OPAA4301提高了8837.71倍。本發(fā)明的二肽酶突變體可高效水解對(duì)氧磷、甲基對(duì)硫磷等常見有機(jī)磷化合物污染物，在有機(jī)磷化合物污染修復(fù)領(lǐng)域具有良好應(yīng)用前景。

附圖說明：

圖1是二肽酶突變體D45W/H226G和L225Y/H226L/H343I水解有機(jī)磷化合物的催化動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

具體實(shí)施方式：

以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。

下述實(shí)施例中所用的方法，如無特殊說明均為常規(guī)方法，具體步驟可參見：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3^rd edition,2001,NY,Cold Spring Harbor)。所用引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。高保真DNA聚合酶Fast Pfu Taq Mix購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，內(nèi)切酶購自Fermentas公司，對(duì)氧磷和甲基對(duì)硫磷購自Sigma。其他化學(xué)試劑一般為國產(chǎn)分析純。

實(shí)施例1：

單位點(diǎn)飽和突變體文庫的構(gòu)建

海洋沉積物來源的假交替單胞菌(Pseudoalteromonas sp.)SCSIO 04301中的二肽酶OPAA4301具有較強(qiáng)的肽酶活性和較弱的有機(jī)磷水解酶活性，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。通過同源建模與結(jié)構(gòu)比對(duì)發(fā)現(xiàn)該二肽酶OPAA4301存在三個(gè)典型與底物結(jié)合相關(guān)的區(qū)域：小底物結(jié)合口袋(由第45位天冬氨酸、第212位酪氨酸、第342位纈氨酸、第343位組氨酸組成)、大底物結(jié)合口袋(由第89位色氨酸、第225位亮氨酸、第226位組氨酸、第332位組氨酸、第418位精氨酸組成)、離去結(jié)合位點(diǎn)(由第292位酪氨酸和第366位亮氨酸組成)。本發(fā)明通過對(duì)底物結(jié)合區(qū)域氨基酸(第45位天冬氨酸、第212位酪氨酸、第342位纈氨酸、第343位組氨酸、第89位色氨酸、第225位亮氨酸、第226位組氨酸、第332位組氨酸、第418位精氨酸、第292位酪氨酸、第366位亮氨酸)的進(jìn)化，實(shí)現(xiàn)二肽酶水解有機(jī)磷化合物的能力大幅提高。根據(jù)海洋沉積物來源的假交替單胞菌(Pseudoalteromonas sp.)SCSIO 04301中的二肽酶OPAA4301的基因opaa4301，設(shè)計(jì)對(duì)二肽酶OPAA4301的第45位天冬氨酸、第212位酪氨酸、第342位纈氨酸、第343位組氨酸、第89位色氨酸、第225位亮氨酸、第226位組氨酸、第332位組氨酸、第418位精氨酸、第292位酪氨酸、第366位亮氨酸進(jìn)行單位點(diǎn)氨基酸替換的定點(diǎn)飽和突變引物，其引物設(shè)計(jì)如表1所示。

表1定點(diǎn)飽和突變引物列表(N為A、G、C或T；K為G或T)

基因點(diǎn)突變采用反向PCR法，以連接有二肽酶OPAA4301編碼基因opaa4301(其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)的大腸桿菌表達(dá)載體pET22b-opaa4301為模板，以一對(duì)定點(diǎn)飽和突變引物進(jìn)行反向PCR擴(kuò)增，獲得線性化表達(dá)載體核酸片段。PCR擴(kuò)增使用的DNA聚合酶為北京全式金生物技術(shù)有限公司的Fast Pfu mix；反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃5min；95℃30sec，50℃30sec，72℃3min，共30個(gè)循環(huán)；72℃10min。反應(yīng)結(jié)束后，用DpnⅠ消化甲基化模板，純化消化產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化至大腸桿菌XL1-Blue中，將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌涂布于50μg/mL氨芐青霉素的LA抗性平板上，37℃培養(yǎng)12小時(shí)。用滅菌PBS緩沖液將不少于1000個(gè)克隆的轉(zhuǎn)化子重懸并收集菌體，提取質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosetta(DE3)，涂布于50μg/mL氨芐青霉素的LA抗性平板，37℃培養(yǎng)12小時(shí)，得到飽和突變文庫平板。平板上生長的菌落即為二肽酶OPAA4301底物結(jié)合相關(guān)位點(diǎn)氨基酸替換的二肽酶突變體轉(zhuǎn)化子。

實(shí)施例2:

突變文庫中水解有機(jī)磷化合物活性提高的二肽酶突變體篩選

挑取實(shí)施例1產(chǎn)生的飽和突變文庫平板上的二肽酶突變體轉(zhuǎn)化子單菌落至裝有200μL含0.1mM IPTG和50μg/ml氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基的96孔酶標(biāo)板孔內(nèi)，從每個(gè)底物結(jié)合相關(guān)位點(diǎn)氨基酸的飽和突變文庫中至少挑取384個(gè)單克隆。28℃，100r/min搖床培養(yǎng)60小時(shí)。靜置30min后吸取上清，分別以對(duì)氧磷和甲基對(duì)硫磷為底物，55℃反應(yīng)30min酶標(biāo)儀讀取反應(yīng)液405nm吸光值的變化。吸光值高于野生型二肽酶OPAA4301的為潛在活性提高的突變克隆，送交上海美技生物技術(shù)有限公司進(jìn)行質(zhì)粒常規(guī)測序以排除重復(fù)或沉默突變。提取測序驗(yàn)證的突變質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達(dá)宿主Rosetta(DE3)中，進(jìn)行擴(kuò)大發(fā)酵制備純化二肽酶突變體。

將上述二肽酶突變體轉(zhuǎn)化子接種于含50μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm搖床培養(yǎng)12小時(shí)，從培養(yǎng)后的菌液中吸取1mL菌液，加入到100mL新鮮LB液體培養(yǎng)基(含50μg/mL氨芐青霉素)的250mL三角瓶中；37℃，200r/min搖床中劇烈振蕩培養(yǎng)2～3h，檢測OD值，當(dāng)OD600達(dá)到0.6時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.1mmol/L，在28℃，180rpm搖床中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)約12h。將誘導(dǎo)好的菌液于4℃，6000rpm條件下離心10min，收集菌體；將收集的菌體用50mM Tris-HCl(pH 7.5)緩沖液重懸，用超聲波進(jìn)行細(xì)胞破碎。超聲波工作條件為：功率30％，工作5s暫停5s，破碎時(shí)間為30min；在4℃，12000rpm下離心30min，收集上清溶液，即為粗酶液可用于鎳柱純化。純化過程：5mL蒸餾水沖洗鎳柱→5mL Binding緩沖液(5mmol/L咪唑，50mM pH 8.5的Tris-HCl緩沖液)平衡→加入過濾好的粗酶液→20mL Binding buffer(5mmol/L咪唑，50mM pH 8.5的Tris-HCl緩沖液)沖洗層析柱→100～200mL Washing buffer(20mmol/L咪唑，50mM pH 8.5的Tris-HCl緩沖液)沖洗層析柱→10mL Elution buffer(500mmol/L咪唑，50mM pH 8.5的Tris-HCl緩沖液)洗脫，收集洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE檢測純化效果，由此得到二肽酶突變體純酶液。

以純酶的比活力為指標(biāo)，分別以對(duì)氧磷和甲基對(duì)硫磷為底物，進(jìn)一步比較野生型二肽酶OPAA4301與單位點(diǎn)二肽酶突變體催化活性的差異。酶活測定反應(yīng)體系包括1mM底物，0.4μM純化酶蛋白，200μM氯化錳，50mM甘氨酸-氫氧化鈉(pH8.5)，于55℃反應(yīng)30min，95℃加熱5min終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測定405nm處吸光值。對(duì)照對(duì)硝基苯酚在405nm吸光值的標(biāo)準(zhǔn)曲線換算反應(yīng)產(chǎn)生的對(duì)硝基苯酚產(chǎn)物量。比活力表示為每毫克酶蛋白每分鐘催化產(chǎn)生的產(chǎn)物對(duì)硝基苯酚量。獲得水解對(duì)氧磷活性提高的二肽酶突變體列于表2，水解甲基對(duì)硫磷活性提高的二肽酶突變體列于表3。

表2水解對(duì)氧磷活性提高的單位點(diǎn)突變體

表3水解甲基對(duì)硫磷活性提高的單位點(diǎn)突變體

表2和表3中的WT是野生型二肽酶OPAA4301，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；D45W的氨基酸序列與SEQ ID NO.1相同，只是第45位天冬氨酸替換為色氨酸；H226G的氨基酸序列與SEQ ID NO.1相同，只是第226位組氨酸替換為甘氨酸；H332P的氨基酸序列與SEQ ID NO.1相同，只是第332位組氨酸替換為脯氨酸；Y292F的氨基酸序列與SEQ ID NO.1相同，只是第292位酪氨酸替換為苯丙氨酸；L366F的氨基酸序列與SEQ ID NO.1相同，只是第366位亮氨酸替換為苯丙氨酸。

實(shí)施例3：

多位點(diǎn)組合突變進(jìn)一步提高二肽酶突變體水解有機(jī)磷化合物活性

將獲得的單位點(diǎn)二肽酶突變體按次序進(jìn)行同區(qū)域內(nèi)組合突變和不同區(qū)域組合突變，同時(shí)對(duì)一級(jí)結(jié)構(gòu)鄰近的兩對(duì)氨基酸第225、226位和第342、343位進(jìn)行組合飽和突變(Combinatorial Saturation Test)。按照實(shí)施例1的突變方法，以含有表2、表3所述的水解有機(jī)磷化合物活性提高的單位點(diǎn)突變體的編碼基因的重組表達(dá)載體為模板，使用如表4所示的組合突變引物，進(jìn)行多位點(diǎn)組合突變。

表4組合突變引物(N為A、G、C或T；D為A或G)

水解有機(jī)磷化合物活性提高的組合突變體的篩選、制備和純化同實(shí)施例2。以比活力為考量指標(biāo)，對(duì)獲得的組合突變體進(jìn)行水解對(duì)氧磷和甲基對(duì)硫磷活性評(píng)價(jià)。在此基礎(chǔ)上分別獲得水解兩類有機(jī)磷化合物底物的最優(yōu)突變體。水解對(duì)氧磷改良的組合突變體催化動(dòng)力學(xué)參數(shù)列如表5。催化動(dòng)力學(xué)參數(shù)測定反應(yīng)體系包括不同終濃度的對(duì)氧磷或甲基對(duì)硫磷(0.5-3mM),0.4μM純化酶蛋白，200μM氯化錳，50mM甘氨酸-氫氧化鈉(pH8.5)，于55℃反應(yīng)30min，95℃加熱5min終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測定405nm處吸光值，以獲得不同底物濃度下的反應(yīng)速率。雙倒數(shù)線計(jì)算酶反應(yīng)米氏常數(shù)(K_m)和最大反應(yīng)速率v_max，根據(jù)v_max和酶濃度計(jì)算催化常數(shù)(k_cat)，最終獲得反應(yīng)速率常數(shù)(k_cat/K_m)。最優(yōu)情況是將氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的第45位天冬氨酸和第226位組氨酸同時(shí)分別替換為色氨酸和甘氨酸(D45W/H226G)；水解甲基對(duì)硫磷改良的組合突變體催化動(dòng)力學(xué)參數(shù)列如表6，最優(yōu)情況是將氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的第225位亮氨酸、第226位組氨酸和第343為組氨酸同時(shí)分別替換為酪氨酸、亮氨酸和異亮氨酸(L225Y/H226L/H343I)(圖1)。

表5水解對(duì)氧磷活性提高的組合突變體催化動(dòng)力學(xué)參數(shù)

表6水解甲基對(duì)硫磷活性提高的組合突變體催化動(dòng)力學(xué)參數(shù)

表5和表6中的WT是野生型二肽酶OPAA4301，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；D45W的氨基酸序列與SEQ ID NO.1相同，只是第45位天冬氨酸替換為色氨酸；H226G的氨基酸序列與SEQ ID NO.1相同，只是第226位組氨酸替換為甘氨酸；Y292F/L366F的氨基酸序列與SEQ ID NO.1相同，只是第292位酪氨酸替換為苯丙氨酸，同時(shí)第366位亮氨酸替換為苯丙氨酸；D45W/H226G的氨基酸序列與SEQ ID NO.1相同，只是第45位天冬氨酸替換為色氨酸，同時(shí)第226位組氨酸替換為甘氨酸；D45W/Y292F/L366F的氨基酸序列與SEQ ID NO.1相同，只是第45位天冬氨酸替換為色氨酸，同時(shí)第292位酪氨酸替換為苯丙氨酸，同時(shí)第366位亮氨酸替換為苯丙氨酸；D45W/H226G/Y292F/L366F的氨基酸序列與SEQ ID NO.1相同，只是第45位天冬氨酸替換為色氨酸，同時(shí)第226位組氨酸替換為甘氨酸，同時(shí)第292位酪氨酸替換為苯丙氨酸，同時(shí)第366位亮氨酸替換為苯丙氨酸；H343I的氨基酸序列與SEQ ID NO.1相同，只是第343位組氨酸替換為異亮氨酸；L225Y/H226L的氨基酸序列與SEQ ID NO.1相同，只是第225位亮氨酸替換為酪氨酸，同時(shí)第226位組氨酸替換為亮氨酸；L225Y/H226L/H343I的氨基酸序列與SEQ ID NO.1相同，只是第225位亮氨酸替換為酪氨酸，同時(shí)第226位組氨酸替換為亮氨酸，同時(shí)第343為組氨酸替換為異亮氨酸。

從表5、表6和圖1中可知，水解對(duì)氧磷最優(yōu)的二肽酶突變體D45W/H226G催化速率常數(shù)k_cat/K_m為(2.96±0.05)×10⁴M^-1s^-1，相較于野生型二肽酶OPAA4301提高了30.68倍；水解甲基對(duì)硫磷最優(yōu)二肽酶突變體L225Y/H226L/H343I的催化速率常數(shù)k_cat/K_m為(1.10±0.02)×10⁴M^-1s^-1，相較于野生型二肽酶OPAA4301提高了8837.71倍。

經(jīng)改良后的二肽酶突變體水解有機(jī)磷類化合物的活力大幅提高，可有望應(yīng)用于飼料添加劑、日化成分、環(huán)境治理試劑等方面。

上述的對(duì)實(shí)施例的描述是為便于該技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能理解和使用發(fā)明。熟悉本領(lǐng)域技術(shù)的人員顯然可容易地對(duì)某些實(shí)施例做出各種修改，并把在此說明的一般原理應(yīng)用到其他實(shí)施例中而不必經(jīng)過創(chuàng)造性的勞動(dòng)。因此，本發(fā)明不限于上述實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的掲示，不脫離本發(fā)明范疇所做出的改進(jìn)和修改都應(yīng)該在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。