本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種高GC含量基因突變體的創(chuàng)制方法。

背景技術(shù)：

基因突變的點(diǎn)突變是導(dǎo)致生物發(fā)生遺傳變異的重要物質(zhì)基礎(chǔ)之一。基因是由三聯(lián)體密碼子組成的，堿基的改變會(huì)引起被編碼的氨基酸的改變，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，最終影響生物表型。

生物進(jìn)化過(guò)程中，通過(guò)增加基因特殊部位重要氨基酸密碼子的GC含量來(lái)增強(qiáng)基因的穩(wěn)定性，進(jìn)而穩(wěn)定其編碼蛋白質(zhì)或酶的活性功能，保證生物代謝有條不紊的進(jìn)行，維持其正常的生長(zhǎng)發(fā)育。

在分子生物學(xué)研究中，為了研究氨基酸在蛋白質(zhì)或酶結(jié)構(gòu)中的功能，通常采用PCR技術(shù)進(jìn)行體外點(diǎn)突變，將野生型基因的一種氨基酸突變?yōu)榱硪环N氨基酸，如將酸性氨基酸突變?yōu)閴A性氨基酸、或極性氨基酸突變?yōu)橹行园被?、或長(zhǎng)鏈氨基酸突變?yōu)槎替湴被?、或帶有基團(tuán)的氨基酸突變?yōu)闊o(wú)基團(tuán)的氨基酸等等，反之亦然。首先，將編碼野生型氨基酸的密碼子改變?yōu)楸煌蛔儼被岬拿艽a子，并以該氨基酸的密碼子為中心，向上、向下各5個(gè)氨基酸密碼子長(zhǎng)度，設(shè)計(jì)相互配對(duì)的正向和反向PCR引物；根據(jù)引物Tm值，設(shè)定退火溫度，在DNA聚合酶催化下，利用反應(yīng)體系中的正向和反向PCR引物，合成包括載體和突變位點(diǎn)在內(nèi)的DNA雙鏈，最終完成基因突變體的構(gòu)建。

由于設(shè)計(jì)的基因點(diǎn)突變引物中，在1個(gè)密碼子中被突變1個(gè)堿基、或2個(gè)堿基、或3個(gè)堿基，獲得相應(yīng)基因突變體的難度也由此逐漸加大，尤其是獲得3個(gè)堿基同時(shí)被改變的突變體的難度非常大，再加上GC含量過(guò)高，獲得相應(yīng)突變體就難上加難。對(duì)于一個(gè)密碼子中2個(gè)堿基以上突變體的創(chuàng)制，在通過(guò)一次PCR反應(yīng)不易獲得的情況下，通常會(huì)采用間接方法，即先獲得一個(gè)堿基的突變體，然后再以此突變體為模板，獲得第二個(gè)堿基的突變體，以此類推，最終可能獲得相應(yīng)的突變體，但存在幾個(gè)缺點(diǎn)：一是多個(gè)中間突變體的構(gòu)建導(dǎo)致獲得最終突變體所用的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，而且還有可能導(dǎo)致基因的其它位點(diǎn)產(chǎn)生點(diǎn)突變，影響基因本身的功能；二是不一定能夠找到構(gòu)建中間突變體突變位點(diǎn)的合適堿基，甚至根本找不到相應(yīng)的突變堿基。由于無(wú)法構(gòu)建中間突變體，就只能在密碼子中2個(gè)或3個(gè)堿基同時(shí)被改變的情況下直接進(jìn)行PCR，但獲得相應(yīng)基因突變體的難度非常大。眾所周知，被改變的堿基在退火過(guò)程中是無(wú)法與野生型DNA鏈進(jìn)行正確配對(duì)的，而卻與其互補(bǔ)引物優(yōu)先配對(duì)，這就進(jìn)一步增加了獲取突變體的難度。由于配對(duì)堿基GC間能量高，其Tm值為3℃，而AT間能量相對(duì)較弱，其Tm值為2℃。在分子生物學(xué)操作中，經(jīng)常會(huì)遇到GC含量較高的基因，即使提高退火溫度，也難以獲得相應(yīng)基因的突變體。此外，DNA聚合酶在PCR反應(yīng)中的最適溫度為72℃，若因GC含量高而使退火溫度超過(guò)72℃，則會(huì)影響DNA聚合酶的正常活性，不利于DNA鏈的延伸，也就無(wú)法獲得相應(yīng)的基因突變體，這就阻礙了對(duì)氨基酸及其酶蛋白功能的研究，也影響了對(duì)基因功能本身的研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決現(xiàn)有技術(shù)上的不足，本發(fā)明提供了一種高GC含量基因突變體的創(chuàng)制方法。

本發(fā)明基于PCR合成中，95℃下DNA變性解鏈，在退火溫度下引物與DNA模板配對(duì)結(jié)合，在DNA聚合酶催化下合成突變位點(diǎn)在內(nèi)DNA雙鏈的原理，利用單引物合成DNA單鏈，以解決退火過(guò)程中引物自身優(yōu)先配對(duì)而不能全部與DNA模板配對(duì)的問(wèn)題。通過(guò)混合正向引物合成的DNA單鏈和反向引物合成的DNA單鏈，并在95℃使其充分變性解鏈，在溫度自然緩慢下降至室溫的過(guò)程中，使正向和反向單鏈DNA進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)，DpnI酶去除模板DNA，最終創(chuàng)制出高GC含量的基因突變體。該技術(shù)目前在國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明一種高GC含量基因突變體的創(chuàng)制方法，包括以下步驟：

1）將正向引物和反向引物分別加入PCR反應(yīng)體系，分別合成正向DNA單鏈和反向DNA單鏈；

2）充分均勻混合含有正向DNA單鏈和反向DNA單鏈的 PCR產(chǎn)物；

3）95℃變性；

4）溫度緩慢降至室溫；

5）DpnI限制性內(nèi)切酶降解模板DNA；

6）DNA提取、細(xì)菌細(xì)胞轉(zhuǎn)化、克隆篩選、DNA測(cè)序，獲得基因突變體。

優(yōu)選的，步驟1）中所述的PCR反應(yīng)體系為： 0.1μg 模板DNA，10倍pfu DNA聚合酶緩沖液5μL，10 mM dNTP 1μL，100 μM正向引物1μL，pfu DNA聚合酶（2.5U/μL）1μL、10% DMSO，加無(wú)菌水至50μL。。

所述的pfu DNA聚合酶緩沖液含有硫酸銨。

優(yōu)選的步驟1）所述合成正向和反向DNA單鏈，PCR儀擴(kuò)增程序?yàn)?5℃變性0.5 分鐘，66℃退火1分鐘，72℃延伸13 分鐘，共需要13個(gè)循環(huán)。

優(yōu)選的步驟3）中所述95℃變性時(shí)間為10分鐘。

優(yōu)選的步驟5）中所述DpnI限制性內(nèi)切酶降解模板DNA為：PCR產(chǎn)物混合物中加入10U/μL 的DpnI限制性內(nèi)切酶2μL，混勻，37℃反應(yīng)2小時(shí)或過(guò)夜，使模板DNA完全降解。

本方法適用于動(dòng)物、植物、微生物以及人類等GC含量超過(guò)70%的高GC含量基因突變體的創(chuàng)制，或適用于改變?nèi)?lián)體密碼子中2個(gè)堿基、或3個(gè)堿基的基因突變體的創(chuàng)制。

本方法適用于小鼠甲羥戊酸激酶基因中丙氨酸突變?yōu)榘腚装彼岬幕蛲蛔凅w的構(gòu)建。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明技術(shù)操作簡(jiǎn)單，所用儀器設(shè)備與常規(guī)PCR相同，可適用于動(dòng)物、植物、微生物以及人類等GC含量超過(guò)70%的高GC含量基因突變體的創(chuàng)制，也非常適合于改變?nèi)?lián)體密碼子中2個(gè)堿基、或3個(gè)堿基的基因突變體的創(chuàng)制，應(yīng)用前景非常廣泛。

附圖說(shuō)明

圖1 被突變的氨基酸在小鼠甲羥戊酸激酶酶結(jié)構(gòu)中的位置。

圖2 高GC含量基因突變體的創(chuàng)制流程。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的描述：

實(shí)施例1 小鼠甲羥戊酸激酶基因中丙氨酸（A）突變?yōu)榘腚装彼幔–）的基因突變體的構(gòu)建

突變位點(diǎn)：將小鼠甲羥戊酸激酶第141位的丙氨酸突變?yōu)榘腚装彼?，使該酶通過(guò)自身折疊反應(yīng)增加一個(gè)二硫鍵，從而增加酶的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性（圖1）。

突變位點(diǎn)密碼子：野生型丙氨酸的密碼子為GCG；突變體半胱氨酸的密碼子為TGC。突變體氨基酸密碼子的3個(gè)堿基與野生型的完全不同，在退火狀態(tài)下不能與野生型密碼子配對(duì)。

A141C正向引物序列（A141C FPS）為：5′GAA CTG CCC CCT GGG TGC GGC TTG GGC TCC AGT G 3′；設(shè)計(jì)引物的3′端堿基必須保證為G或C。

A141C反向引物序列為（A141C RPS）：5′C ACT GGA GCC CAA GCC GCA CCC AGG GGG CAG TTC3′。

引物的GC含量：整個(gè)引物包括34個(gè)堿基，涵蓋11個(gè)氨基酸密碼子，GC含量為73.5%，Tm值為116℃。

具體操作步驟（圖2）：

1.在一個(gè)滅菌的0.5 ml Eppendorf 管中，依次加入0.1μg 模板DNA，10倍pfu DNA聚合酶緩沖液（含有（NH₄）₂SO₄ ） 5μL，10 mM dNTP 1μL，100 μM正向引物1μL，pfu DNA聚合酶（2.5U/μL）1μL、10% DMSO（二甲基亞砜），加無(wú)菌水至50μL。按照上述同樣步驟在另外一個(gè)Eppendorf 管中加入上述反應(yīng)物質(zhì)，所不同的是正向引物換為反向引物。

2.設(shè)置PCR儀擴(kuò)增程序?yàn)?5℃變性0.5 分鐘，66℃退火1分鐘，72℃延伸13 分鐘（通常每擴(kuò)增1kb DNA，需要2 分鐘時(shí)間。應(yīng)根據(jù)目的基因及其載體的大小，設(shè)計(jì)DNA鏈延伸時(shí)間），共需要13個(gè)循環(huán)。

3.PCR結(jié)束后，將2個(gè)單引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物置于1個(gè)0.5ml的Eppendorf管中，充分混勻，于95℃變性10分鐘，然后慢慢降溫至室溫。再向PCR產(chǎn)物混合物中加入DpnI限制性內(nèi)切酶（10U/μL）2μL，混勻，37℃反應(yīng)2小時(shí)或過(guò)夜，使模板DNA完全降解。

4.按常規(guī)方法進(jìn)行DNA提取，并將提取、純化的DNA溶于20 μL TE緩沖液或無(wú)菌水中。細(xì)菌細(xì)胞轉(zhuǎn)化、克隆子挑選、質(zhì)粒DNA提取以及DNA測(cè)序等均按常規(guī)方法進(jìn)行。

以上所述僅是本專利的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本專利技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和替換，這些改進(jìn)和替換也應(yīng)視為本專利的保護(hù)范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所

<120> 一種高GC含量基因突變體的創(chuàng)制方法

<130> 2016

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gaactgcccc ctgggtgcgg cttgggctcc agtg 34

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<400> 2

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