本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及芒果精氨酸脫羧酶基因MiADC的克隆方法。

背景技術(shù)：

芒果(Mangifera indica L.)屬于漆樹科，芒果屬，是著名的熱帶水果，有“熱帶果王”之稱，與香蕉、柑桔、蘋果及葡萄并列成為世界五大水果。在生產(chǎn)過程中，培育品種優(yōu)良、抗病性強、耐貯性好和矮化的芒果品種是研究者的重點指標(biāo)。

精氨酸是植物體內(nèi)N/C比最高的氨基酸之一，它可以很少的碳結(jié)合很多的氮。L-精氨酸在植物中除作為一種重要的氮素貯藏營養(yǎng)物供再利用外，還是生成多胺(PA)和一氧化氮(NO)等的前體物質(zhì)，而PA和NO都是植物中重要的信使分子，參與包括生長發(fā)育、抗逆性等在內(nèi)的幾乎所有的生理生化過程。精氨酸脫羧酶(ADC)、精氨酸酶(ODC)和一氧化氮合酶(NOS)是L-精氨酸分解代謝的關(guān)鍵酶，精氨酸可經(jīng)ADC或ODC途徑形成PA，也可經(jīng)NOS途徑形成NO，3個酶活性的相對強弱，決定了精氨酸的代謝方向。根系在越冬期間會積累豐富的精氨酸；精氨酸代謝對于植物感知和適應(yīng)環(huán)境變化有重要意義。

因ADC基因在非生物脅迫條件下發(fā)揮重要作用，在擬南芥(Waston et al.,1996；Urano et al.,2003)、大豆(Nam et al.,1997)、水稻(Chattopadhyay et al.,1997)、葡萄(Primikirios et al.,1999)等作物中已獲得其全長cDNA序列。雖然有較多的研究證實了ADC基因被克隆，但是在芒果中尚未見該基因克隆及序列分析的報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種芒果精氨酸脫羧酶基因MiADC的克隆方法，為芒果在非生物脅迫條件下進行分子育種提供基因資源，為生態(tài)農(nóng)業(yè)的發(fā)展提供理論支撐。

本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)其目的：

一種芒果精氨酸脫羧酶基因MiADC的克隆方法，包括以下步驟：

1)以芒果為供試材料，稱取其葉片研磨后，提取其總RNA，并冷凍保存?zhèn)溆茫?/p>

2)以步驟1)的總RNA為模板，進行cDNA第一鏈的合成及3'和5'RACE ready cDNA的準(zhǔn)備；

3)以步驟2)中獲得的cDNA為模板，進行MiADC基因保守區(qū)序列的擴增，并進行克隆測序；

4)以步驟2)中獲得的3'/5'RACE ready cDNA為模板，以步驟3)獲得的保守區(qū)序列設(shè)計特異性引物擴增MiADC基因，并進行克隆測序。

其中，步驟1)中采集芒果幼嫩葉片，通過改良CTAB法抽提芒果總RNA。

步驟2)中采用第一鏈cDNA合成試劑盒(RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit)和cDNA末端快速擴增試劑盒(SMARTer RACE cDNA Amplification Kit)。

步驟3)中利用NCBI搜索不同物種中MiADC基因編碼的氨基酸序列，進行多序列比對后，在保守區(qū)域設(shè)計簡并引物，引物信息為：

ADC-sense：5'-CACCCTGCCCCACcargarathga-3'

ADC-antisense：5'-GCCGGAGGTGGAGccraartgncc-3'。

5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的芒果精氨酸脫羧酶MiADC基因的克隆及序列分析方法，其特征在于：步驟4)中獲得MiADC基因的保守區(qū)序列后，采用primer premier 5.0軟件設(shè)計MiADC基因的特異引物，并通過RACE法進行MiADC基因克??；

引物信息為：

ADCGsp1-1：5'-GAGCAAAACTGAGAACTAAACATTCGGGACA-3'

ADCGsp1-2：5'-CGTGTGGTGAGGAAACTTGAACAGGCT-3'

ADCGsp2-1：5'-GCCAGCCTGTTCAAGTTTCCTCACCA-3'。

在完成MiADC基因的克隆后，可以采用生物信息學(xué)的手段進行序列分析，即采用生物軟件進行了MiADC基因序列的分析。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明是以芒果為試驗材料，通過設(shè)計簡并引物獲得該基因的保守區(qū)序列后，再設(shè)計特異性引物，利用RACE技術(shù)克隆獲得芒果精氨酸脫羧酶基因MiADC的全長cDNA序列，為芒果在非生物脅迫條件下進行分子育種提供基因資源，為生態(tài)農(nóng)業(yè)的發(fā)展提供理論支撐。

具體實施方式

為加深對本發(fā)明理解，下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細的描述，該實施例僅用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明保護范圍的限定。在本發(fā)明基礎(chǔ)上作出的修改或改進，若對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的，則屬于本發(fā)明要求保護的范圍。以下內(nèi)容中如涉及數(shù)量或比例，如無特別說明，均表示質(zhì)量單位或質(zhì)量比例。

實施例1：

該基因MiADC的克隆方法，采取芒果為試驗材料，通過總RNA的抽提、cDNA第一鏈合成、保守區(qū)序列克隆、3'和5'-RACE克隆及序列分析，獲得芒果精氨酸脫羧酶基因MiADC的全長cDNA序列。

步驟1、芒果總RNA的抽提：

分別稱取芒果幼嫩和成熟葉片0.2g放入研缽中，用液氮將其研磨成粉末后轉(zhuǎn)至2.0mL的離心管中，迅速加入預(yù)熱的1,000μL2×CTAB于離心管中，65℃水浴6min；立即加入等體積的氯仿/異戊醇(24:1)于離心管中，4℃、11,000rpm離心15min；將上清液轉(zhuǎn)入新的2.0mL的離心管中，加入等體積的氯仿/異戊醇(24:1)重復(fù)抽提1次；將上清液轉(zhuǎn)入新的1.5mL的離心管中，分別加入1/3體積、和等體積的8mol/L LiCl溶液，-80℃冰箱中沉淀；4℃、11,000rpm離心30min，棄上清，用75％乙醇、無水乙醇分別洗滌沉淀1次，吹干，加入30-50μL DEPC水溶解RNA，電泳檢測其完整性，并保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

步驟2、cDNA第一鏈合成及3'和5'RACE ready cDNA的準(zhǔn)備：

cDNA第一鏈合成的反應(yīng)體系：Total RNA3.0μL，Oligo(dT)₁₈Primer 1.0μL，補足DEPC-trade water至12.0μL。65℃溫育5min，立刻置冰上冷卻30s。在上述PCR管中加入以下反應(yīng)試劑：變性總RNA12.0μL，5×RT Buffer4.0μL，dNTP Mix 2.0μL，RNase Inhibitor 1.0μL，Revert Aid MM-RTase1.0μL。輕輕吹吸混勻后，短暫離心。反應(yīng)程序：30℃，10min；42℃，60min；70℃，5min；12℃，保存。注意使用熱蓋PCR儀。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

3'和5'RACE ready cDNA的準(zhǔn)備：3'和5'RACE ready cDNA是以芒果嫩葉葉片總RNA為模板，按照SMARTer RACE cDNAAmplification Kit說明書進行合成。3'和5'RACE ready cDNA產(chǎn)物置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

步驟3、保守區(qū)克隆測序：

利用NCBI搜索不同物種中MiADC基因編碼的氨基酸序列，進行多序列比對后，通過CODEHOPs在保守區(qū)域設(shè)計簡并引物。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，用ADC-sense和ADC-antisense引物對ADC基因保守區(qū)進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系：2×Taq PCR MasterMix 25.0μL，sense 1.0μL，antisense 1.0μL，cDNA模板1.0μL，補足ddH₂O至50.0μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，61℃退火30s，72℃延伸1min，循環(huán)30次；72℃再延伸10min；12℃保存。使用濃度為1.2％的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，連接到19-T載體，轉(zhuǎn)化E.Coli DH5α感受態(tài)細胞，篩選重組子并進行菌落PCR驗證，將陽性克隆送北京諾賽公司測序；目的片段的純化和膠回收都是按照試劑盒提供的說明書進行操作。

步驟4、3'和5'-RACE克?。?/p>

以保守區(qū)序列為基礎(chǔ)，采用primer premier 5.0軟件設(shè)計MiADC基因的特異引物，引物設(shè)計的原則：引物長度為23-28bp，GC含量為50-70％，Tm≥65℃。以3'和5'RACE ready cDNA為模板，按照SMARTer RACE cDNAAmplification Kit說明書進行擴增。PCR反應(yīng)體系：2×Tag PCR MasterMix 25.0μL，3'-RACE-Ready cDNA3.0μL，10×UPM 5.0μL，GSP 2.0μL，補足ddH₂O至50.0μL。PCR反應(yīng)程序：反應(yīng)程序：94℃30s，72℃3min，循環(huán)5次；94℃30s，70℃30s，72℃3min，循環(huán)5次；94℃30s，68℃30s，72℃3min，循環(huán)30次；12℃，保存。使用濃度為1.2％的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，通過膠回收試劑盒回收目的條帶，連接到19-T載體，轉(zhuǎn)化E.Coli DH5α感受態(tài)細胞，篩選重組子并進行菌落PCR驗證，將陽性克隆送北京諾賽公司測序；目的片段的純化和膠回收都是按照試劑盒提供的說明書進行操作。

步驟5、序列分析：

蛋白質(zhì)的基本分析：http://web.expasy.org/protparam/

疏水/親水性分析：http://web.expasy.org/protscale/

信號肽分析：http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/

亞細胞定位：http://wolfpsort.org/

跨膜結(jié)構(gòu)分析：http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html

http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0

保守結(jié)構(gòu)域分析：http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

當(dāng)然，以上只是本發(fā)明的具體應(yīng)用范例，本發(fā)明還有其他的實施方式，凡采用等同替換或等效變換形成的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明所要求的保護范圍之內(nèi)。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110> 貴州省亞熱帶作物研究所

<120> 芒果精氨酸脫羧酶基因MiADC的克隆方法

<130> nm:

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 24

<212> cDNA

<213> 人工序列

<400> 1

caccc tgccc cacca rgara thga 24

<210> 2

<211> 24

<212> cDNA

<213> 人工序列

<400> 2

gccgg aggtg gagcc raart gncc 24

<210> 3

<211> 31

<212> cDNA

<213> 人工序列

<400> 3

gagca aaact gagaa ctaaa cattc gggac a 31

<210> 4

<211> 27

<212> cDNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgtgt ggtga ggaaa cttga acagg ct 27

<210> 5

<211> 23

<212> cDNA

<213> 人工序列

<400> 5

gccag cctgt tcaag tttcc tcacc at 27