專利名稱：雙峰駝溶菌酶蛋白基因、重組蛋白及其克隆方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，是一種雙峰駝溶菌酶蛋白基因、重組蛋白及其克隆方法。
背景技術(shù)：
溶菌酶(Iysozyme)又稱胞壁質(zhì)酶(muramidase)或N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶(N-acetylmuramide glycanohydrlase),是一種特異性地作用于細(xì)菌細(xì)胞壁的水解酶。主要通過破壞細(xì)胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間的β -1, 4糖苷鍵，使細(xì)胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂內(nèi)容物逸出而使細(xì)菌溶解。溶菌酶還可與帶負(fù)電荷的病毒蛋白直接結(jié)合，與DNA、RNA、脫輔基蛋白形成復(fù)鹽，使病毒失活。因此，該酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。
人們主要以鮮奶的形式飲用駝乳，并在長期的生活實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)駝乳具有更長的保存期。這一點(diǎn)引起了廣大學(xué)者的興趣，誘發(fā)人們?nèi)パ芯狂勅橹械谋Ｗo(hù)性蛋白。同時(shí)，將駝乳用來治療某些感染性疾病的事實(shí)也暗示了它所含有的抗微生物成分。Elagamy等報(bào)道，駝乳除了擁有與牛奶相似的各種營養(yǎng)物質(zhì)外，還有很高的生物學(xué)價(jià)值，即駝乳中含有大量的諸如溶菌酶，乳鐵蛋白和免疫球蛋白等保護(hù)性蛋白。溶菌酶不僅能裂解細(xì)菌的細(xì)胞壁，而且還能增強(qiáng)抗體活性，因此溶菌酶是一種具有殺菌作用的乳蛋白。Elagamy等報(bào)道駝乳中的溶菌酶含量是牛奶的4. 9倍，是水牛乳中的11倍。Barbour等研究了駝乳的抗菌作用與其溶菌酶含量的關(guān)系。在200份乳樣中發(fā)現(xiàn)有20個(gè)抑制了六種病原菌中的一個(gè)或多個(gè)病原菌的生長。并且這20個(gè)具有抗菌作用的樣品中溶菌酶含量達(dá)648 μ g/1OOmL,明顯高于無抗菌作用的乳樣溶菌酶含量(62. 6 μ g/100mL)。人乳的溶菌酶含量為40000 μ g/100mL、牛乳為120 μ g/100mL。Elagamy (2000)報(bào)道，駝乳中除了擁有與牛奶相似的各種營養(yǎng)物質(zhì)外，溶菌酶、乳鐵蛋白和免疫球蛋白等保護(hù)性蛋白含量均高于牛乳。El-Sayed等(1992)的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)駝乳中的溶菌酶可抑制鼠傷寒沙門氏菌的生長發(fā)育，而且與卵清蛋白有相同的抗菌譜，但與牛奶中的溶菌酶的抗菌譜不一樣。Duhaiman等報(bào)道，與G-菌(埃希氏菌屬)相比，G+菌(微球菌屬)對駝乳溶菌酶更為敏感。El Sayed等研究發(fā)現(xiàn)駝乳溶菌酶可抑制鼠傷寒沙門氏菌的生長發(fā)育，而且與卵清蛋白有相同的抗菌譜，但與牛奶的溶菌酶的抗菌譜不一樣。雙峰駝駝乳中的溶菌酶含量明顯高于牛乳和水牛乳，且可以有效的抑制病原菌的生長，但是目前國內(nèi)外對駝乳中溶菌酶的研究甚少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種雙峰駝溶菌酶蛋白基因，該基因是一種具有抗菌、消炎、抗病毒并可以增強(qiáng)抗體活性密切相關(guān)的基因。本發(fā)明的技術(shù)方案之一是通過以下措施來實(shí)現(xiàn)的一種雙峰駝溶菌酶蛋白基因，該基因是一種具有抗菌、消炎、抗病毒并可以增強(qiáng)抗體活性密切相關(guān)的基因，具有SEQ IDNO.1中從核苷酸第27-481位的核苷酸序列。本發(fā)明的技術(shù)方案之二是通過以下措施來實(shí)現(xiàn)的一種雙峰駝溶菌酶蛋白基因的
重組蛋白。下面是對上述發(fā)明技術(shù)方案之二的進(jìn)一步優(yōu)化或/和改進(jìn)
上述重組蛋白的核苷酸序列為SEQ ID NO.1。上述重組蛋白為SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
上述重組蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO. 2。上述重組蛋白通過設(shè)計(jì)一對引物從雙峰駝溶菌酶蛋白中得到雙峰駝溶菌酶蛋白基因，該引物對的核苷酸序列正向引物為SEQ ID NO. 3和反向引物為SEQ ID NO. 4，其序列信息如下
SEQ ID NO. 3 :5’ - ATGAAGGCTCTCCTTGTGCTGG -3’，
SEQ ID N0.4 :5’ -GCCCCAGCACAAGGAGAGCCT -3’。本發(fā)明的技術(shù)方案之三是通過以下措施來實(shí)現(xiàn)的一種雙峰駝溶菌酶蛋白基因的克隆方法，按下述步驟進(jìn)行第一步，組織分離(Isolation);第二步,總RNA的分離(TotalRNA isolation),總RNA的分離(Total RNA isolation)包括提取RNA的準(zhǔn)備工作、組織總RNA提取、組織總RNA的鑒定；第三步，全長cDNA的克隆(Cloning of Full-length cDNA)，全長cDNA的克隆(Cloning of Full-length cDNA)包括引物設(shè)計(jì)及合成、RT-PCR擴(kuò)增、克隆和測序，該引物對的核苷酸序列正向引物為SEQ ID NO. 3和反向引物為SEQ ID NO. 4，其序列信息如下
SEQ ID NO. 3 :5’ - ATGAAGGCTCTCCTTGTGCTGG -3’，
SEQ ID N0.4 :5’ -GCCCCAGCACAAGGAGAGCCT -3’。本發(fā)明通過雙峰駝的溶菌酶序列及進(jìn)化樹可以直觀的表現(xiàn)出雙峰駝溶菌酶序列與其他物種此蛋白序列的差異，為以后研究雙峰駝及其他物種的溶菌酶對細(xì)菌細(xì)胞壁的水解作用的研究提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，對研究雙峰駝及其他物種以及人類溶菌酶與帶負(fù)電荷的病毒蛋白結(jié)合并使之失活提供一定的理論依據(jù)并對溶菌酶在人類的抗菌、消炎、抗病毒的作用研究起到了很重要的作用，因此本發(fā)明具有很大的應(yīng)用價(jià)值。


附圖1為本發(fā)明雙峰駝溶菌酶蛋白基因RT-PCR產(chǎn)物電泳圖。附圖2為雙峰駝和人、鼠、牛等動(dòng)物用Clustal X中對齊的溶菌酶基因編碼氨基酸序列同源性比較結(jié)果圖。附圖3為本發(fā)明雙峰駝溶菌酶氨基酸序列與人、鼠、牛等動(dòng)物溶菌酶氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明不受下述實(shí)施例的限制，可根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案與實(shí)際情況來確定具體的實(shí)施方式。
實(shí)施例1 :一種雙峰駝溶菌酶蛋白基因，該基因是一種具有抗菌、消炎、抗病毒并可以增強(qiáng)抗體活性密切相關(guān)的基因，具有SEQ ID NO.1中從核苷酸第27-481位的核苷酸序列。實(shí)施例2 :—種雙峰駝溶菌酶蛋白基因的重組蛋白。實(shí)施例3 :重組蛋白的核苷酸序列為SEQ ID NO.1。實(shí)施例4 :重組蛋白為SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。實(shí)施例5 :重組蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO. 2。實(shí)施例6 :重組蛋白通過設(shè)計(jì)一對引物從雙峰駝溶菌酶蛋白中得到雙峰駝溶菌酶 蛋白基因，該引物對的核苷酸序列正向引物為SEQ ID N0.3和反向引物為SEQ ID NO. 4，其序列信息如下
SEQ ID NO. 3 :5’ - ATGAAGGCTCTCCTTGTGCTGG -3’，
SEQ ID N0.4 :5’ -GCCCCAGCACAAGGAGAGCCT -3’。實(shí)施例7 :—種雙峰駝溶菌酶蛋白基因的克隆方法，按下述步驟進(jìn)行第一步，組織分離(Isolation);第二步，總 RNA 的分離(Total RNA isolation),總 RNA 的分離(TotalRNA isolation)包括提取RNA的準(zhǔn)備工作、組織總RNA提取、組織總RNA的鑒定；第三步，全長 cDNA 的克隆(Cloning of Full-length cDNA),全長 cDNA 的克隆(Cloning ofFull-length cDNA)包括引物設(shè)計(jì)及合成、RT-PCR擴(kuò)增、克隆和測序，該引物對的核苷酸序列正向引物為SEQ ID NO. 3和反向引物為SEQ ID NO. 4，其序列信息如下
SEQ ID NO. 3 :5’ - ATGAAGGCTCTCCTTGTGCTGG -3’，
SEQ ID N0.4 :5’ -GCCCCAGCACAAGGAGAGCCT -3’。雙峰駝溶菌酶蛋白基因cDNA序列的克隆1. 組織分離(Isolation)
從內(nèi)蒙古阿拉善盟采得雙峰駝，快速屠宰并取肝臟樣，將組織樣迅速放入液氮中冷凍后于-70°C保存，拿回實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備提取組織總RNA。2.總 RNA 的分離(Total RNA isolation)
(I)提取RNA的準(zhǔn)備工作
玻璃制品用0.1M的NaOH浸泡過夜，用自來水反復(fù)沖洗，再用蒸餾水沖洗2遍，180°C烘烤4小時(shí)。勻漿器、電泳槽用3%的雙氧水浸泡20分鐘至30分鐘，再用0. 1%的DEPC水沖洗，由于未滅活的DEPC對PCR反應(yīng)有影響，可用0. 5%的SDS處理。Tip頭、EP管用0. 1%的DEPC水浸泡過夜，高壓滅菌使DEPC失活。雙蒸水和溶液用DEPC處理，即每IOOml水或溶液加0.1mlDEPC液，室溫放置過夜，高壓滅菌30分鐘DEPC失活。(2 )組織總RNA提取
取IOOmg在液氮中凍存的組織樣放入有Iml Trizol (trizal reagent, invitrogenBRL, USA)的勻漿器管中勻漿。4°C 12000g離心10分鐘，吸取上清液，15°C至30°C溫育5分鐘，加0. 2ml氯仿，蓋上蓋子，用手劇烈震蕩15秒，15°C至30°C溫育2分鐘至3分鐘，4°C12000g離心15分鐘；吸取上清液，加0. 8ml異丙醇，混合均勻；15°C至30°C溫育10分鐘，4°C 12000g離心10分鐘，離心管底部白色沉淀即為RNA ;倒掉上清，加Iml 75%乙醇洗滌RNA,40C 7500g離心10分鐘，自然干燥或真空干燥RNA ;溶于水(RNase free)中分裝，_70°C保存。(3)組織總RNA的鑒定
通過分光光度計(jì)上測定RNA含量并且用瓊脂糖電泳分析RNA的質(zhì)量，具體方法如下電泳槽用RNA清洗液(IOOmM NaOH, ImM EDTA)浸泡4小時(shí)至5小時(shí)，再用DEPC處理過的水反復(fù)沖洗數(shù)次后倒入IXTBE待用，瓊脂糖凝膠用IXTBE配制；在IOul上樣緩沖液(2XTBE，13%菲可，O. 1%溴酚蘭，7M尿素)中加入Iul以上組織總RNA，65°C變性10分鐘后立即放入冰水中2分鐘至3分鐘，點(diǎn)樣于瓊脂糖凝膠中電泳。·3.全長 cDNA 的克隆(Cloning of Full-length cDNA)
(1)引物設(shè)計(jì)及合成
根據(jù)GenBanK發(fā)表的人(Accession No: MC63078.1)、鼠(Accession No: 038618.1)、牛(Accession No: AAC37312.1)等物種的溶菌酶基因mRNA序列ORF側(cè)翼同源序列，設(shè)計(jì)如下引物用于以雙峰駝溶菌酶cDNA為模版的PCR擴(kuò)增，以獲得雙峰駝溶菌酶蛋白基因cDNA序列；引物用Primer Premier 5. O自行設(shè)計(jì)，由上海桑尼生物科技有限公司合成,該引物對的核苷酸序列分別為SEQ ID NO:3 (正向WPSEQ ID NO:4 (反向)，序列信息如下
SEQ ID NO. 3 :5’ - ATGAAGGCTCTCCTTGTGCTGG -3’
SEQ ID N0.4 :5’ -GCCCCAGCACAAGGAGAGCCT -3’
(2)RT-PCR 擴(kuò)增
按大連寶生物反轉(zhuǎn)錄試劑盒(BcaBEST RNA PCR Kit Ver.1.1)要求進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液組成IOul 2 XBca 1st Buffer, 4ul 25Mm MgS04, lul dNTP Mixtur, 0. 5ul RnaseInhibitor (40U/ul),lul BcaBEST Polymerase(22U/ul), lul Oligo dT Primer,lul RNASample,1. 5ul Rnase Free dH20，總體系為 20 ul。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件65°C I 分鐘，30°C 5分鐘(15分鐘至30分鐘內(nèi)勻速升溫)，65°C 25分鐘，98°C 5分鐘，5V 5分鐘；PCR擴(kuò)增條件970C變性5分鐘；95°C 30秒一55°C 30秒一72V I分鐘，如此進(jìn)行30次循環(huán)；72°C延伸10分鐘，4°C保存。(3)克隆和測序
PCR擴(kuò)增片段的回收片段回收按上海華舜小量膠回收試劑盒說明進(jìn)行，操作過程如下盡可能小的割下含DNA的瓊脂糖塊，放入1. 5mlEP管中；按每IOOmg瓊脂糖加入300ulSl液的比例加SI液，50°C水浴10分鐘；將溶化的瓊脂糖液移入吸附柱，IOOOOg離心I分鐘，倒掉管中液體。在吸附柱中加入500ul Wl液，IOOOOg離心15秒；倒掉管中液體，在吸附柱中加入500ul Wl液，靜置I分鐘后，IOOOOg離心15秒，倒掉管中液體；離心I分鐘，將吸附柱放入一個(gè)干凈的1. 5mlEP管中，在吸附膜中央加入30ulTl液，靜置I分鐘后，IOOOOg離心I分鐘，EP管中液體即為回收的DNA?；厥掌瓮琓載體的連接連接用TaKaRa pMD18_T Vector試劑盒，操作過程如下在 EP 管中制備下列連接反應(yīng)液pMD 18-T Vector (50ng/ul) 0. 5ul, DNA 20_40ng，Solution I 5ul，加dH20至10ul。將上述反應(yīng)液在16°C反應(yīng)30分鐘(過夜也可以)，產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化 從_70°C冰箱中取出保存的感受態(tài)細(xì)胞，冰浴助溶。IOOul感受態(tài)細(xì)胞加入IOul連接產(chǎn)物，冰浴30分鐘。42°C水浴熱應(yīng)激90秒鐘，立即置入冰浴中2分鐘。加400ul液體LB培養(yǎng)基，37°C復(fù)活50分鐘；取IOOul鋪于LB平板上，平板含O. 1%(V/V)的氨節(jié)青霉Amp (100mg/ml), 37°C恒溫培養(yǎng)10小時(shí)至15小時(shí)。轉(zhuǎn)化菌落的PCR鑒定與培養(yǎng)用記號筆標(biāo)記轉(zhuǎn)化培養(yǎng)的單菌落，用滅菌的牙簽蘸取單菌落。將牙簽頭放入在加有PCR反應(yīng)液(不含模板)的EP管中晃動(dòng)，使單菌落充當(dāng)模板。用獲得該片段的PCR條件進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物同Marker —起進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，鑒別T載體上是否含有目的片段，若得到目的片段，可用滅菌槍頭挑取在平板上的與之對應(yīng)的單菌落，放入40 ml LB液體培養(yǎng)基中，先在液體中加入O. 1%(V/V)的青霉素鈉(100mg/ml)，37°C過夜搖菌培養(yǎng)，用于質(zhì)粒回收。質(zhì)粒的回收質(zhì)?；厥沼蒙虾ＨA舜小量質(zhì)粒抽提純化試劑盒，操作步驟如下將轉(zhuǎn)化培養(yǎng)的菌液加入1. 5mlEP管中，4000轉(zhuǎn)/分鐘離心，倒掉液體獲細(xì)菌沉淀。細(xì)菌沉淀不夠時(shí)可再加一次菌液離心。在細(xì)菌沉淀中加入250ulPl液，振蕩懸浮。加入250ulP2液，溫 和搖勻，室溫靜置4分鐘。加入350ulP3液，溫和搖勻。離心10分鐘，將上清液小心移入吸附柱，離心15秒，倒掉液體。在吸附柱中加入500ulWl，離心15秒，倒掉液體。在吸附柱中加入500ulWl，靜置I分鐘，離心15秒，倒掉液體。離心I分鐘，將吸附柱放入一個(gè)干凈的1. 5mlEP管中，在吸附膜中央加入25-30ulTl液，靜置I分鐘后，離心I分鐘，EP管中液體即為回收的質(zhì)粒。質(zhì)粒的酶切鑒定為了證明回收質(zhì)粒確為插入目的片段的重組質(zhì)粒，采用雙酶切法鑒定。本研究具體操作如下根據(jù)TaKaRa pMD18_T Vector圖，選擇內(nèi)切酶Bam H I和Hin d III,保證目的片段中無這兩種酶的切點(diǎn)。組成如下酶切反應(yīng)體系Bam H I lul, Hind III lul，10XK Buffer 2ul，DNA 彡 lul，加 dH20 至 20ul。30°C反應(yīng) 3 小時(shí)，瓊脂糖凝膠電泳檢測。重組質(zhì)粒的測序取20ul重組質(zhì)粒于EP管中，封口膜密封，交生物技術(shù)公司測序。雙峰駝溶菌酶蛋白基因編碼序列同源性比較和系統(tǒng)發(fā)生樹構(gòu)建1、雙峰駝溶菌酶的序列信息與生物信息學(xué)分析
本發(fā)明雙峰駝溶菌酶⑶S的長度為504 bp，詳細(xì)序列見SEQ ID NO:1。根據(jù)全長⑶S推導(dǎo)出雙峰駝溶菌酶的氨基酸序列，共151個(gè)氨基酸殘基，詳見SEQ ID N0:2，在線預(yù)測(http://www. expasy. ch/tools/pi_tool. html)結(jié)果顯不，其分子量為 16997. 47 道爾頓，等電點(diǎn)(PI)為8. 81。2、溶菌酶基因編碼序列系統(tǒng)發(fā)生樹構(gòu)建
在GenBank上搜索并獲得人、鼠、牛等九種物種的九條溶菌酶基因的編碼蛋白序列，力口上本發(fā)明獲得的SEQ ID N0.2序列，利用分子生物學(xué)軟件MEGA4構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)生樹見附圖
3;雙峰駝溶菌酶氨基酸序列與人、鼠、牛等物種氨基酸的相似性見表一。本發(fā)明在提供了雙峰駝溶菌酶蛋白基因的cDNA序列和蛋白編碼序列基礎(chǔ)上；將人、鼠、牛等不同物種溶菌酶基因的CDS序列和氨基酸序列進(jìn)行同源性比較；對包括雙峰駝在內(nèi)的十個(gè)物種的十個(gè)溶菌酶基因的CDS序列構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)生樹。本發(fā)明中的雙峰駝溶菌酶基因的cDNA序列是通過以雙峰駝肝臟組織中總RNA為模板，參考人、鼠、牛等物種的溶菌酶基因的同源序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR而獲得的新基因序列。獲得的雙峰駝溶菌酶基因cDNA序列見SEQ ID NO.1。將雙峰駝溶菌酶基因cDNA序列中的編碼序列(⑶S)按通用密碼子翻譯成的蛋白質(zhì)編碼序列見SEQ ID NO. 2。在SEQ ID NO.1中，RT-PCR產(chǎn)物長度為504bp，電泳結(jié)果見附圖1，其中27_29位為起始密碼子ATG，479-481位為終止密碼子TAA，27-481位為編碼蛋白質(zhì)區(qū)域(⑶S)。在SEQ ID NO. 1，雙峰駝溶菌酶基因編碼151個(gè)氨基酸。雙峰駝與鼠、人、牛等溶菌酶氨基酸相似性見表一。雙峰駝和人、鼠、牛等動(dòng)物用Clustal X中對齊的溶菌酶基因編碼氨基酸序列同源性比較結(jié)果見附圖2。其中十種動(dòng)物溶菌酶氨基酸個(gè)數(shù)及分子量見表二。其中十種動(dòng)物溶菌酶氨基酸比例見表三。本發(fā)明提供了雙峰駝溶菌酶的核酸序列，該核酸序列為SEQ ID NO. 1，本發(fā)明還提供了一種分離出的溶菌酶的氨基酸序列，該序列的氨基酸序列為SEQ ID NO. 2。對包括SEQID NO.1在內(nèi)的10個(gè)物種的10條溶菌酶基因的氨基酸序列構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)生樹，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雙峰駝與牛、羊的親緣關(guān)系最近。
我們參考了其他九種動(dòng)物的溶菌酶基因序列，克隆并測序得到了雙峰駝駝乳中溶菌酶基因的cDNA序列，并對包括雙峰駝在內(nèi)的十種物種基因的CDS序列進(jìn)行同源性比較并作進(jìn)化樹，為今后研究雙峰駝駝乳中溶菌酶提供基礎(chǔ)資料。以上技術(shù)特征構(gòu)成了本發(fā)明的實(shí)施例，其具有較強(qiáng)的適應(yīng)性和實(shí)施效果，可根據(jù)實(shí)際需要增減非必要的技術(shù)特征，來滿足不同情況的需求。序列 表
<110>新疆旺源駝奶實(shí)業(yè)有限公司
〈120〉雙峰駝溶菌酶的蛋白編碼序列
〈160〉 4
〈210〉 I
〈211〉 504
〈212〉 DNA
〈213〉阿拉善盟雙峰駝 〈400〉 I
atcccagtgt gtagacggct gcaaccatga aggctctcct tgtgctgggg ctcgtcctcc60
tcgctgtcgc cgtgcagggc aaggtctggg agagatgcga gctggcccga aagctgaagg120
aactcggaat ggatggctac aggggagtca gcgtggccga ctggatgtgt ttggccagat180
gggaaagtaa ttatgacacg aaagctacaa acttcaatcc ctccagcaga agcactgatt240
atgggatatt tcagatcaac agccgctact ggtgtaacga tggcaaaact ccaaaagcag300
tgaacggctg tggcatcaac tgtaacggtg actctgacaa aattgctgaa gcaagacatt360
tcttcttttc aacggctatg agctatttct caactctgat tatgcatgag atcgtcaaag420
cttcatccta cagttaccgt atcagacact tgggagtaga tgtaagtaac ctgtatgctt480
[Iagatatattt ttatacaaaa aaaa504
〈210〉 2 〈211〉 151 〈212〉 PRT
〈213〉阿拉善盟雙峰駝
權(quán)利要求
1.一種雙峰駝溶菌酶蛋白基因，其特征在于該基因是一種具有抗菌、消炎、抗病毒并可以增強(qiáng)抗體活性密切相關(guān)的基因，具有SEQ ID NO.1中從核苷酸第27-481位的核苷酸序列。
2.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙峰駝溶菌酶蛋白基因的重組蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組蛋白，其特征在于該重組蛋白的核苷酸序列為SEQID NO.1。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的重組蛋白，其特征在于該重組蛋白為SEQID NO. 2所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的重組蛋白，其特征在于該重組蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO. 2。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組蛋白，其特征在于該重組蛋白的氨基酸序列為SEQID NO. 2。
7.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的重組蛋白，其特征在于通過設(shè)計(jì)一對引物從雙峰駝溶菌酶蛋白中得到雙峰駝溶菌酶蛋白基因，該引物對的核苷酸序列正向引物為SEQ ID NO. 3和反向引物為SEQ ID NO. 4，其序列信息如下SEQ ID NO. 3 :5’ - ATGAAGGCTCTCCTTGTGCTGG -3’，SEQ ID N0.4 :5’ -GCCCCAGCACAAGGAGAGCCT -3’。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組蛋白，其特征在于通過設(shè)計(jì)一對引物從雙峰駝溶菌酶蛋白中得到雙峰駝溶菌酶蛋白基因，該引物對的核苷酸序列正向引物為SEQ ID NO. 3和反向引物為SEQ ID NO. 4，其序列信息如下SEQ ID NO. 3 :5’ - ATGAAGGCTCTCCTTGTGCTGG -3’，SEQ ID N0.4 :5’ -GCCCCAGCACAAGGAGAGCCT -3’。
9.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的重組蛋白，其特征在于通過設(shè)計(jì)一對引物從雙峰駝溶菌酶蛋白中得到雙峰駝溶菌酶蛋白基因，該引物對的核苷酸序列正向引物為SEQ ID NO. 3和反向引物為SEQ ID NO. 4，其序列信息如下SEQ ID NO. 3 :5’ - ATGAAGGCTCTCCTTGTGCTGG -3’，SEQ ID N0.4 :5’ -GCCCCAGCACAAGGAGAGCCT -3’。
10.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙峰駝溶菌酶蛋白基因的克隆方法，按下述步驟進(jìn)行 第一步，組織分離(Isolation);第二步，總RNA的分離(Total RNA isolation),總RNA的分離(Total RNA isolation)包括提取RNA的準(zhǔn)備工作、組織總RNA提取、組織總RNA的鑒定；第三步，全長cDNA的克隆(Cloning of Full-length cDNA),全長cDNA的克隆(Cloning of Full-length cDNA)包括引物設(shè)計(jì)及合成、RT-PCR擴(kuò)增、克隆和測序，該引物對的核苷酸序列正向引物為SEQ ID NO. 3和反向引物為SEQ ID NO. 4，其序列信息如下SEQ ID NO. 3 :5’ - ATGAAGGCTCTCCTTGTGCTGG -3’，SEQ ID N0.4 :5’ -GCCCCAGCACAAGGAGAGCCT -3’。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，是一種雙峰駝溶菌酶蛋白基因、重組蛋白及其克隆方法；該基因是一種具有抗菌、消炎、抗病毒并可以增強(qiáng)抗體活性密切相關(guān)的基因，具有SEQIDNO.1中從核苷酸第27-481位的核苷酸序列。本發(fā)明通過雙峰駝的溶菌酶序列及進(jìn)化樹可以直觀的表現(xiàn)出雙峰駝溶菌酶序列與其他物種此蛋白序列的差異，為以后研究雙峰駝及其他物種的溶菌酶對細(xì)菌細(xì)胞壁的水解作用的研究提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，對研究雙峰駝及其他物種以及人類溶菌酶與帶負(fù)電荷的病毒蛋白結(jié)合并使之失活提供一定的理論依據(jù)并對溶菌酶在人類的抗菌、消炎、抗病毒的作用研究起到了很重要的作用，因此本發(fā)明具有很大的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號C12N9/36GK103014038SQ20121047826
公開日2013年4月3日 申請日期2012年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月23日
發(fā)明者陳鋼糧 申請人:新疆旺源駝奶實(shí)業(yè)有限公司