專利名稱：雙峰駝血型糖蛋白基因、重組蛋白及其克隆方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，是一種雙峰駝血型糖蛋白基因、重組蛋白及其克隆方法。
背景技術(shù)：
血型糖蛋白(glycophorin )又稱涎糖蛋白(sialo glycoprotein),因它富含唾液酸。是紅血球細(xì)胞膜上的一種含量豐富的穿膜糖蛋白。血型糖蛋白是第一個(gè)被測定氨基酸序列的蛋白質(zhì)，有幾種類型，包括A、B、C、D。血型糖蛋白B、C、D在紅細(xì)胞膜中濃度較低。 血型糖蛋白A是一種單次跨膜糖蛋白，由131個(gè)氨基酸組成，是MN血型抗原，也是流感病毒和瘧原蟲入侵紅血球的受體。其親水的氨基端露在膜的外側(cè)，結(jié)合16個(gè)低聚糖側(cè)鏈。血型糖蛋白的基本功能可能是在于它的唾液酸中含有大量負(fù)電荷，防止了紅細(xì)胞在循環(huán)過程中經(jīng)過狹小血管時(shí)相互聚集沉積在血管中。
研究發(fā)現(xiàn)，血型糖蛋白是一種具有多種生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)并與醫(yī)學(xué)有著重要的關(guān)系。主要存在于細(xì)胞膜上，是典型的膜固有蛋白。血型糖蛋白二聚體是其在膜上存在的生理形式。血型糖蛋白不僅自身形成二聚體或多聚體，也與帶3蛋白形成復(fù)合物。流感病毒、仙臺病毒及抗血型糖蛋白抗體與血型糖蛋白特異性結(jié)合，可降低帶3蛋白的旋光流動性，也影響血型糖蛋白-帶3蛋白復(fù)合物在膜上的分布。血型糖蛋白與細(xì)胞骨架蛋白也有一定的關(guān)系。在醫(yī)學(xué)上，血型糖蛋白異常會引起血型變異。血型糖蛋白作為凝集素受體、病毒受體、支原體受體、毒素受體等應(yīng)用于醫(yī)學(xué)界。血型糖蛋白的疏水部分可使紅細(xì)胞膜對 K+、水的通透性改變，完整的血型糖蛋白可增加人工黑脂膜的導(dǎo)電性，也能促進(jìn)磷脂等穿過細(xì)胞膜。血型糖蛋白在體外能增強(qiáng)紅細(xì)胞生成素對血紅素合成的促進(jìn)作用。
血型糖蛋白的研究，1978年，Gahmberg等人用血型糖蛋白的抗血清和葡萄球菌A 蛋白等對骨髓紅細(xì)胞作玫瑰花形成實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明只有紅系統(tǒng)的骨髓細(xì)胞才能表達(dá)血型糖蛋白，而原始紅細(xì)胞幾乎不含血型糖蛋白。1982年，Jokinen等人提出，骨髓 分化的紅細(xì)胞先在核糖體上合成血型糖蛋白前體物質(zhì)。1990年,Lampio等人對血型糖蛋白A對半乳糖氧化酶紅細(xì)胞糖苷脂氧化的影響作了研究。2005年，Hajime Mizukami等人對血型糖蛋白 A基因MN血型的等位基因作了系統(tǒng)分類。
在雙峰駝中，血型糖蛋白是駱駝紅細(xì)胞膜上重要的糖蛋白，具有血型活性，又是多種物質(zhì)及生物的受體，與生物醫(yī)學(xué)有著密切的關(guān)系。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種雙峰駝血型糖蛋白基因、重組蛋白及其克隆方法，血型糖蛋白是紅血球細(xì)胞膜上的一種含量豐富的穿膜糖蛋白，通過利用該雙峰駝血型糖蛋白的基因編碼序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，可以直觀的表現(xiàn)出雙峰駝血型糖蛋白序列與其他物種血型糖蛋白序列的差異，對研究血型糖蛋白在體外增強(qiáng)紅細(xì)胞生成素對血紅素合成的促進(jìn)作用提供一定的理論依據(jù)。
本發(fā)明的技術(shù)方案之一是通過以下措施來實(shí)現(xiàn)的一種雙峰駝血型糖蛋白基因， 該基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO.1所示的序列。
下面是對上述發(fā)明技術(shù)方案之一的進(jìn)一步優(yōu)化或/和改進(jìn)上述基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO.1中64-501位的序列。
本發(fā)明的技術(shù)方案之二是通過以下措施來實(shí)現(xiàn)的一種雙峰駝血型糖蛋白基因的重組蛋白。
下面是對上述發(fā)明技術(shù)方案之二的進(jìn)一步優(yōu)化或/和改進(jìn)上述重組蛋白的氣基酸序列具有SEQ ID NO. 2所不的序列。
上述組蛋白具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
上述重組蛋白通過設(shè)計(jì)一對引物從雙峰駝血型糖蛋白中得到雙·峰駝血型糖蛋白基因，該引物對的核苷酸序列信息如下正引物，SEQ ID NO. 3 :5’ - ATGAACAGCATCTTGACTGCC-3’反引物，SEQ ID NO. 4 =Oligo dT。
本發(fā)明的技術(shù)方案之三是通過以下措施來實(shí)現(xiàn)的一種雙峰駝血型糖蛋白基因的克隆方法，按下述步驟進(jìn)行第一步，總RNA提取，采取雙峰駝組織樣品后，對組織樣品進(jìn)行組織總RNA提??；第二步，引物設(shè)計(jì)及合成，引物對的核苷酸序列信息如下正引物，SEQ ID NO. 3 :5’ - ATGAACAGCATCTTGACTGCC-3’反引物，SEQ ID NO. 4 =Oligo dT ；第三步，RT-PCR擴(kuò)增，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒對組織樣品中的蛋白基因進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，并對待擴(kuò)增的DNA片段進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增；第四步，蛋白基因的克隆，首先對PCR擴(kuò)增的DNA片段進(jìn)行回收，然后將回收的DNA片段同T載體連接形成感受態(tài)細(xì)胞，將感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化培養(yǎng)成單菌落，取少量該單菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增后的單菌落鑒別T載體上是否含有目的DNA片段，若有目的DNA片段， 將單菌落放入培養(yǎng)基中進(jìn)行過夜培養(yǎng)，最后對質(zhì)粒進(jìn)行回收。
本發(fā)明雙峰駝血型糖蛋白是一種具有多種生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)，是駱駝紅細(xì)胞膜上重要的糖蛋白，具有血型活性，又是多種物質(zhì)及生物的受體，與生物醫(yī)學(xué)有著密切的關(guān)系，并且，血型糖蛋白在體外能增強(qiáng)紅細(xì)胞生成素對血紅素合成的促進(jìn)作用。因此，對駱駝血型糖蛋白的研究將有助于細(xì)胞生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的發(fā)展。


附圖1為雙峰駝血型糖蛋白基因RT-PCR產(chǎn)物電泳圖。
附圖2為構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹所用血型糖蛋白氨基酸同源性比較。
附圖3為不同物種血型糖蛋白氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明不受下述實(shí)施例的限制，可根據(jù)上述本發(fā)明的技術(shù)方案和實(shí)際情況來確定具體的實(shí)施方式。
下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步論述實(shí)施例1，一種雙峰騎血型糖蛋白基因，該基因的核昔酸序列具有SEQ ID NO.1所不的序列。本發(fā)明中的雙峰駝血型糖蛋白基因的cDNA序列是通過以雙峰駝組織中總RNA為模板，參考人、鼠、牛等物種的血型糖蛋白基因的同源序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR而獲得的新基因序列，獲得的雙峰駝血型糖蛋白基因cDNA序列見SEQ ID NO.1。
可根據(jù)實(shí)際需要，對上述雙峰駝血型糖蛋白基因作進(jìn)一步優(yōu)化或/和改進(jìn)基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO.1中64-501位的序列。在SEQ ID NO.1中，RT-PCR 產(chǎn)物長度為563bp，電泳結(jié)果見附圖1，其中64-66位為起始密碼子ATG，499-501位為終止密碼子TGA，64-501位為編碼蛋白質(zhì)區(qū)域(⑶S)。
實(shí)施例2，一種雙峰駝血型糖蛋白基因的重組蛋白。
可根據(jù)實(shí)際需要，對上述雙峰駝血型糖蛋白基因的重組蛋白作進(jìn)一步優(yōu)化或/和改進(jìn)重組蛋白的氨基酸序列具有SEQ ID NO. 2所示的序列。將雙峰駝血型糖蛋白基因cDNA 序列中的編碼序列(OTS)按通用密碼子翻譯成的蛋白質(zhì)編碼序列見SEQ ID NO. 2。
重組蛋白具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多 肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
通過設(shè)計(jì)一對引物從雙峰駝血型糖蛋白中得到雙峰駝血型糖蛋白基因，該引物對的核苷酸序列信息如下正引物，SEQ ID NO. 3 :5’ - ATGAACAGCATCTTGACTGCC-3’反引物，SEQ ID NO. 4 =Oligo dT ；實(shí)施例3，一種雙峰駝血型糖蛋白基因的克隆方法，按下述步驟進(jìn)行第一步，總RNA提取1、組織分離(Isolation)從內(nèi)蒙古阿拉善盟雙峰駝，快速采得樣品，將組織樣迅速放入液氮中冷凍后于一 70°C 保存，拿回實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備提取組織總RNA。
2、總 RNA 的分離(Total RNA isolation)(I)、提取RNA的準(zhǔn)備工作玻璃制品用0.1M的NaOH浸泡過夜，用自來水反復(fù)沖洗，再用蒸餾水沖洗2遍，180°C 烘烤4小時(shí)。
勻漿器、電泳槽用3%的雙氧水浸泡20-30分鐘，再用0. 1%的DEPC水沖洗.由于未滅活的DEPC對PCR反應(yīng)有影響，可用0. 5%的SDS處理。
Tip頭、EP管用0. 1%的DEPC水浸泡過夜，高壓滅菌使DEPC失活。
雙蒸水和溶液用DEPC處理，即每IOOml水或溶液加0.1mlDEPC液，室溫放置過夜，高壓滅菌30分鐘DEPC失活。
(2 )、組織總RNA提取取IOOmg在液氮中凍存的組織樣放入有Iml Trizol (trizal reagent, invitrogen BRL, USA)的勻漿器管中勻漿。4°C 12000g離心10分鐘。吸取上清液，15_30°C溫育5分鐘。 加0. 2ml氯仿，蓋上蓋子，用手劇烈震蕩15秒。15-30°C溫育2_3分鐘。4°C 12000g離心15分鐘。吸取上清液，加0. 8ml異丙醇，混合均勻。15-30°C溫育10分鐘，4°C 12000g離心10分鐘，離心管底部白色沉淀即為RNA。倒掉上清，加Iml 75%乙醇洗滌RNA，4°C 7500g離心10分鐘。自然干燥或真空干燥RNA.溶于水(RNase free)中分裝，_70°C保存。
(3)、組織總RNA的鑒定通過分光光度計(jì)上測定RNA含量并且用瓊脂糖電泳分析RNA的質(zhì)量，具體方法如下電泳槽用RNA清洗液(IOOmM NaOH, ImM EDTA)浸泡4 一 5小時(shí)，再用DEPC處理過的水反復(fù)沖洗數(shù)次后倒入I X TBE待用。瓊脂糖凝膠用IXTBE配制。在IOul上樣緩沖液(2XTBE，13% 菲可，O. 1%溴酚蘭，7M尿素)中加入Iul以上組織總RNA，65°C變性10分鐘后立即放入冰水中2 — 3分鐘。點(diǎn)樣于瓊脂糖凝膠中電泳。
第二步，引物設(shè)計(jì)及合成根據(jù)GenBanK發(fā)表的人(AAA52625.1)、鼠(EDK97062.1)等物種的血型糖蛋白基因mRNA 序列ORF側(cè)翼同源序列，設(shè)計(jì)如下引物用于以雙峰駝血型糖蛋白cDNA為模版的PCR擴(kuò)增， 以獲得雙峰馬它血型糖蛋白基因cDNA序列。引物用Primer Premier 5. O自行設(shè)計(jì)，由上海桑尼生物科技有限公司合成，該引物對的核苷酸序列分別為SEQ ID NO:3 (正向^PSEQ ID NO:4 (反向)，序列信息如下SEQ ID NO. 3 :5’ - ATGAACAGCATCTTGACTGCC-3’SEQ ID NO. 4 (反向)01igo dT 第三步，RT-PCR擴(kuò)增按大連寶生物反轉(zhuǎn)錄試劑盒(BcaBEST RNA PCR Kit Ver.1.1)要求進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液組成IOul 2XBc a 1st Buffer, 4ul 25Mm MgS04, lul dNTP Mixture, 0. 5ul Rnase Inhibitor (40U/ul),lul BcaBEST Polymerase(22U/ul),lul Oligo dT Primer, lul RNA Sample,1. 5ul Rnase Free dH20,總體系為 20 ul。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件65°C I 分鐘，30°C 5分鐘(15分鐘-30分鐘內(nèi)勻速升溫)，65°C 25分鐘，98°C 5分鐘，5°C 5分鐘。PCR 擴(kuò)增條件97°C變性5分鐘；95°C 30秒一55°C 30秒一72°C I分鐘，如此進(jìn)行30次循環(huán)； 72°C延伸10分鐘，4°C保存。
第四步，蛋白基因的克隆1、PCR擴(kuò)增片段的回收片段回收按上海華舜小量膠回收試劑盒說明進(jìn)行，操作過程如下盡可能小的割下含DNA的瓊脂糖塊，放入1. 5mlEP管中。按每IOOmg瓊脂糖加入 300ulSl液的比例加SI液，50°C水浴10分鐘。將溶化的瓊脂糖液移入吸附柱，IOOOOg 離心I分鐘，倒掉管中液體。在吸附柱中加入500ul Wl液，IOOOOg離心15秒，倒掉管中液體。在吸附柱中加入500ul Wl液，靜置I分鐘后，IOOOOg離心15秒，倒掉管中液體。離心I分鐘。將吸附柱放入一個(gè)干凈的1. 5mlEP管中，在吸附膜中央加入30ulTl液， 靜置I分鐘后，IOOOOg離心I分鐘，EP管中液體即為回收的DNA。
2、回收片段同T載體的連接連接用TaKaRa pMD18_T Vector試劑盒，操作過程如下在 EP 管中制備下列連接反應(yīng)液pMD 18-T Vector (50ng/ul) O. 5ul, DNA 20_40ng， Solution I 5ul，加dH20至10ul。將上述反應(yīng)液在16°C反應(yīng)30分鐘(過夜也可以)，產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。
3、質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化從一70°C冰箱中取出保存的感受態(tài)細(xì)胞，冰浴助溶。IOOul感受態(tài)細(xì)胞加入IOul連接產(chǎn)物，冰浴30分鐘。42°C水浴熱應(yīng)激90秒鐘，立即置入冰浴中2分鐘。 加400ul液體LB培養(yǎng)基，37°C復(fù)活50分鐘。取IOOul鋪于LB平板上，平板含0. 1%(V/V)的氨節(jié)青霉Amp (100mg/ml)。37°C恒溫培養(yǎng)10-15小時(shí)。
4、轉(zhuǎn)化菌落的PCR鑒定與培養(yǎng)用記號筆標(biāo)記轉(zhuǎn)化培養(yǎng)的單菌落，用滅菌的牙簽蘸取單菌落。將牙簽頭放入在加有PCR反應(yīng)液(不含模板)的EP管中晃動，使單菌落充當(dāng)模板。用獲得該片段的PCR條件進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物同Marker—起進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，鑒別T載體上是否含有目的片段。若得到目的片段，可用滅菌槍頭挑取在平板上的與之對應(yīng)的單菌落，放入40 ml LB液體培養(yǎng)基中，先在液體中加入O. 1%(V/V)的青霉素鈉(lOOmg/ ml)，37°C過夜搖菌培養(yǎng)，用于質(zhì)粒回收。
5、質(zhì)粒的回收質(zhì)?；厥沼蒙虾ＨA舜小量質(zhì)粒抽提純化試劑盒，操作步驟如下 將轉(zhuǎn)化培養(yǎng)的菌液加入1. 5mlEP管中，4000轉(zhuǎn)/分鐘離心，倒掉液體獲細(xì)菌沉淀。細(xì)菌沉淀不夠時(shí)可再加一次菌液離心。在細(xì)菌沉淀中加入250ulPl液，振蕩懸浮。加入250ulP2 液，溫和搖勻，室溫靜置4分鐘。加入350ulP3液，溫和搖勻。離心10分鐘，將上清液小心移入吸附柱，離心15秒，倒掉液體。在吸附柱中加入500ulWl，離心15秒，倒掉液體。在吸附柱中加入500ulWl，靜置I分鐘，離心15秒，倒掉液體。離心I分鐘。將吸附柱放入一個(gè)干凈的1. 5mlEP管中，在吸附膜中央加入25-30ulTl液，靜置I分鐘后，離心I分鐘.EP管中液體即為回收的質(zhì)粒。
6、質(zhì)粒的酶切鑒定為了證明回收質(zhì)粒確為插入目的片段的重組質(zhì)粒，采用雙酶切法鑒定.本研究具體操作如下根據(jù)TaKaRa pMD18_T Vector圖，選擇內(nèi)切酶Bam H I 和Hin d II1.保證目的片段中無這兩種酶的切點(diǎn)。組成如下酶切反應(yīng)體系Bam H I lul, Hin d III lul, 10XK Buffer 2ul, DNA ( lul，加 dH20 至 20ul。30°C反應(yīng) 3 小時(shí)。瓊脂糖凝膠電泳檢測. 實(shí)施例4，重組質(zhì)粒的測序取20ul重組質(zhì)粒于EP管中，封口膜密封，交生物技術(shù)公司測序。
實(shí)施例5，雙峰駝血型糖蛋白基因編碼序列同源性比較和系統(tǒng)發(fā)生樹構(gòu)建1、雙峰駝血型糖蛋白基因編碼序列同源性比較在GenBank上搜索并獲得人、鼠、牛等六種動物的血型糖蛋白基因編碼蛋白序列，將其同克隆測序獲得的本發(fā)明獲得的SEQ ID NO.1序列一起，在分子生物學(xué)軟件MEGA4上進(jìn)行序列同源性比較(見附圖2)。比較結(jié)果顯示SEQ ID NO. 2序列與牛的血型糖蛋白氨基酸序列同源性為88. 00%ο
2、血型糖蛋白基因編碼序列系統(tǒng)發(fā)生樹構(gòu)建在GenBank上搜索并獲得人、鼠、牛等六種物種的6條血型糖蛋白基因的編碼蛋白序列，加上本發(fā)明獲得的SEQ ID NO. 2序列，利用分子生物學(xué)軟件MEGA4構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)生樹 (見附圖3)。結(jié)果顯示雙峰駝血型糖蛋白基因同牛的親緣關(guān)系最近；間接證明了所得到的序列確為雙峰駝血型糖蛋白基因。
序列表<110>新疆旺源駝奶實(shí)業(yè)有限公司〈120〉雙峰駝血型糖蛋白的蛋白編碼序列〈160〉 4〈210〉 I〈211〉 56權(quán)利要求
1.一種雙峰駝血型糖蛋白基因，其特征在于該基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO.1所示的序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙峰駝血型糖蛋白基因，其特征在于該基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO.1中64-501位的序列。
3.一種含有權(quán)利要求1或2所述的雙峰駝血型糖蛋白基因的重組蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組蛋白，其特征在于該重組蛋白的氨基酸序列具有SEQID NO. 2所示的序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的重組蛋白，其特征在于該重組蛋白具有SEQID NO. 2所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
6.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的重組蛋白，其特征在于通過設(shè)計(jì)一對引物從雙峰駝血型糖蛋白中得到雙峰駝血型糖蛋白基因，該引物對的核苷酸序列信息如下正引物，SEQ ID NO. 3 :5’ - ATGAACAGCATCTTGACTGCC-3’反引物，SEQ ID NO. 4 =Oligo dT。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組蛋白，其特征在于通過設(shè)計(jì)一對引物從雙峰駝血型糖蛋白中得到雙峰駝血型糖蛋白基因，該引物對的核苷酸序列信息如下正引物，SEQ ID NO. 3 :5’ - ATGAACAGCATCTTGACTGCC-3’反引物，SEQ ID NO. 4 =Oligo dT。
8.一種根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的雙峰駝血型糖蛋白基因的克隆方法，其特征在于按下述步驟進(jìn)行第一步，總RNA提取，采取雙峰駝組織樣品后，對組織樣品進(jìn)行組織總RNA提?。坏诙?，引物設(shè)計(jì)及合成，引物對的核苷酸序列信息如下正引物，SEQ ID NO. 3 :5’ - ATGAACAGCATCTTGACTGCC-3’反引物，SEQ ID NO. 4 =Oligo dT ；第三步，RT-PCR擴(kuò)增，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒對組織樣品中的蛋白基因進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，并對待擴(kuò)增的DNA片段進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增；第四步，蛋白基因的克隆，首先對PCR擴(kuò)增的DNA片段進(jìn)行回收，然后將回收的DNA片段同T載體連接形成感受態(tài)細(xì)胞，將感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化培養(yǎng)成單菌落，取少量該單菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增后的單菌落鑒別T載體上是否含有目的DNA片段，若有目的DNA片段， 將單菌落放入培養(yǎng)基中進(jìn)行過夜培養(yǎng)，最后對質(zhì)粒進(jìn)行回收。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，是一種雙峰駝血型糖蛋白及其編碼序列，該蛋白編碼序列的核苷酸序列具有SEQIDNO.1中從核苷酸第64-501位的核苷酸序列，該蛋白的多肽的氨基酸序列具有SEQIDNO:2所示的序列。本發(fā)明雙峰駝血型糖蛋白是一種具有多種生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)，是駱駝紅細(xì)胞膜上重要的糖蛋白，具有血型活性，又是多種物質(zhì)及生物的受體，與生物醫(yī)學(xué)有著密切的關(guān)系，因此，對駱駝血型糖蛋白的研究將有助于細(xì)胞生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的發(fā)展。
文檔編號C12N15/12GK103014004SQ20121047825
公開日2013年4月3日 申請日期2012年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月22日
發(fā)明者陳鋼糧 申請人:新疆旺源駝奶實(shí)業(yè)有限公司