專利名稱：基因型的判斷方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從包含與乙醇敏感度相關(guān)的基因(乙醇敏感度相關(guān)基因)的固體待測樣品中，判斷所述固體待測樣品中包含的基因的基因型的方法。
背景技術(shù)：
乙醇脫氫酶ADH(Alcohc)I Dehydrogenase)是與在體內(nèi)將乙醇分解為乙醛相關(guān)的酶，已知有多種種類。其中，基因ADHlB(原名ADH2)中，有乙醇代謝速度慢被稱為低活性型的基因型ADHB1*1/*1，具有該基因型的人在飲酒后表現(xiàn)出面色潮紅、心悸等所謂的上頭 (flushing)癥狀，由于乙醇分解速度慢，因而乙醇易殘留于體內(nèi)，被稱為易于成為酒精依賴癥的體質(zhì)。此外，乙醛脫氫酶ALDH(Aldehyde Dehydrogenase)是與在體內(nèi)將乙醛分解為乙酸相關(guān)的酶之一，已知有多種種類。其中，在血液中乙醛濃度低的情況下發(fā)揮作用的ALDH2基因中，已知也有被稱為無活性型的基因型ALDH2*l/*2、ALDH2M/*2，具有該基因型的人，由于乙醛分解速度慢，被認(rèn)為是一飲酒就變紅易于發(fā)生宿醉的體質(zhì)。已知基因型ADHB1*1/*1占日本人的5 %左右，基因型ALDH2*lA2占日本人的約 40%左右。乙醇、乙醛具有致癌性，具有上述基因型ADHB1*1/*1、基因型ALDH2*l/*2的人， 具有由于飲酒量的增加，而易于發(fā)生口腔癌、咽喉癌、喉頭癌、食道癌、肝癌、乳腺癌、直腸結(jié)腸癌等癌癥的傾向，特別是同時具有基因型ADHB1*1/*1和基因型ALDH2*l/*2的人，被認(rèn)為該風(fēng)險力口倍(例如，參見 Akira Yokoyama 等人，“Genetic polymorphisms of alcohol and aldehyde dehydrogenases and glutathione S-transferase Ml and drinking, smoking, and diet in Japanese men with esophageal squamous cell carcinoma", Carcinogenesis,第 23 卷，第 11 期(2002)，第 1851-1859 頁(非專利文獻 1) ；Akira Yokoyama 等人，“Alcohol and aldehyde dehydrogenase gene polymorphisms and oropharyngolaryngeal, esophageal and stomach cancers in Japanese alcoholics", Carcinogenesis，第 22 卷，第 3 期(2001)，第 433-439 頁(非專利文獻幻；Akira Yokoyama ^Α "Macrocytosis, a new predictor for esophageal squamous cell carcinoma in Japanese alcoholic men，，，Carcinogenesis,第 24 卷，第 11 其月(2003),第 1773-1778 頁 (非專利文獻 3) ；Takahiro Asakage 等人，"Genetic polymorphisms of alcohol and aldehyde dehydrogenases,and drinking,smoking and diet in Japanese men with oral and pharyngeal squamous cell carcinoma", Carcinogenesis,28 ^,M 4 M (2007), 第865-874頁(非專利文獻4)等)。此外，已知細胞色素CYP2E1 (Cytochrome P4502E1)與被稱為第2乙醇代謝路徑的肝微粒體氧化體系中的乙醇代謝相關(guān)，已知存在具有不同的乙醇敏感度的兩個基因型CYP2El*cl、CYP2El*c2(例如，參見野村文夫“第2 ^rn ^ 一義代謝経路Microsomal Ethanol-Oxidizing System(MEOS) i f 卜夕口一 A P4502E1 (CYP2E1) ”，千葉醫(yī)學(xué)， 78 000 ，第69-73頁(非專利文獻幻；山田裕一“日本人^ 7 > 二一 >代謝酵素c^遺伝的多形^飲酒行動杉太&飲酒d石健康障害們関係”，金醫(yī)大誌，30 (2005)，第448-455頁(非專利文獻 6) ；Yan-Mel Guo 等人,“Genetic polymorphisms in cytochrome P4502E1,alcohol and aldehyde dehydrogenases and the risk of esophageal squamous cellcarcinoma in Gansu Chinese males", World J Gastroenterol,14(9), (2008), 第1444-1449頁(非專利文獻7)等)。因此，可認(rèn)為判斷上述乙醇脫氫酶ADH的基因、乙醛脫氫酶ALDH的基因和細胞色素CYP2E1的基因等乙醇敏感度相關(guān)基因的基因型，尤其對于規(guī)避與日本人的飲酒相關(guān)的疾病或致癌的風(fēng)險，以及對于個人健康管理方面，具有重要的意義。已開展了利用傳統(tǒng)PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))法等解析基因的各種研究來檢測生物個體間具有與野生型不同的堿基序列的基因多態(tài)性(SNP 單核苷酸多態(tài)性)，該基因多態(tài)性會引起如上所述的個體的基礎(chǔ)代謝、性質(zhì)、疾病等差異。例如，日本特開2005-245273號公報(專利文獻1)公開了檢測乙醛脫氫酶基因多態(tài)性的方法、日本特開2005-245272號公報(專利文獻2)和日本特開2006-75134號公報(專利文獻3)中分別公開了檢測乙醇脫氫酶基因多態(tài)性的方法。但是，就這些專利文獻1-3中公開任何方法而言，由于用于PCR法的DNA純化等手續(xù)繁雜，因此需開發(fā)更簡單的方法?，F(xiàn)有技術(shù)文獻專利文獻專利文獻1 日本特開2005-245273號公報專利文獻2 日本特開2005-245272號公報專利文獻3 日本特開2006-75134號公報非專利文獻非專禾丨J 文獻 1 :Akira Yokoyama 等人，"Genetic polymorphisms of alcoholand aldehyde dehydrogenases and glutathione S-transferase Ml and drinking,smoking, and diet in Japanese men with esophageal squamous cell carcinoma",Carcinogenesis，第 23 卷，第 11 期(2002)，第 1851-1859 頁非專利文獻 2 :Akira Yokoyama 等人，"Alcohol and aldehyde dehydrogenasegene polymorphisms and oropharyngolaryngeal, esophageal and stomach cancers inJapanese alcoholics”，Carcinogenesis，第 22 卷，第 3 期(2001)，第 433-439 頁非專禾丨J 文獻 3 :Akira Yokoyama 等人，“Macrocytosis，a new predictor foresophageal squamous cell carcinoma in Japanese alcoholic men", Carcinogenesis,第對卷，第11期(2003)，第1773-1778頁非專禾丨J文獻 4 :Takahiro Asakage 等人，"Genetic polymorphisms of alcoholand aldehyde dehydrogenases,and drinking,smoking and diet in Japanese men withoral and pharyngeal squamous cell carcinoma", Carcinogenesis, M 28 .4 (2007)，第 865-874 頁非專利文獻5 :野村文夫“第2 O 7 - 一義代謝経路MicrosomalEthanol-Oxidizing System(MEOS) i f 卜夕 α — Λ Ρ4502Ε 1 (CYP2E1) ”，千葉醫(yī)學(xué)，78(2002)，第 69-73 頁非專利文獻6 山田裕一“日本人O 7 > 二一 >代謝酵素 遺伝的多形^飲酒行動杉^ &飲酒d石健康障害們関係”，金醫(yī)大誌，30 (2005)，第448-455頁非專利文獻 7 :Yan_Mel Guo 等人，"Genetic polymorphisms in cytochromeP4502E1,alcohol and aldehyde dehydrogenases and the risk of esophageal squamouscell carcinoma in Gansu Chinese males，，，World J Gastroenterol, 14(9), (2008),第1444-1449 頁非專利文獻8 :Michael P.和 Andrew L. , Nucleic Acids Reserch，19，1151，(1991)非專利文獻9 =Henke W.，Herdel K.，Jung K.，Schnorr D.和 Loening Α. S.，Nucleic Acids Reserch,25,3957, (1997)非專利文獻10 :Waleed Α. Α.和 Peter R.，J. clin. Microbiol.，39，485-493，(2001)

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的課題本發(fā)明是為了能夠解決上述課題而進行的發(fā)明，其目的在于提供安全、快速且廉價的判斷與乙醇敏感度相關(guān)的基因的基因型的方法。解決課題的手段本發(fā)明是判斷乙醇敏感度相關(guān)基因的基因型的方法，其特征在于，該方法包括使含有上述基因的固體待測樣品與含有緩沖液和DNA聚合酶的溶液，以及用于擴增上述基因的引物DNA直接接觸，實施選自聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、LAMP法、鏈置換擴增、逆轉(zhuǎn)錄酶鏈置換擴增、逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、逆轉(zhuǎn)錄LAMP法、基于核酸序列的擴增、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增和滾環(huán)擴增法的方法，擴增上述基因的步驟，和根據(jù)上述擴增的基因，判斷所述基因的基因型的步驟。本發(fā)明中的乙醇敏感度相關(guān)基因優(yōu)選是乙醇脫氫酶ADHlB基因、乙醛脫氫酶ALDH2基因和細胞色素CYP2E1基因中的至少一個基因。本發(fā)明中的固體待測樣品理想的是血液的干燥物、毛根或唾液的干燥物。本發(fā)明的基因型判斷方法優(yōu)選同時擴增選自乙醇脫氫酶ADHlB基因、乙醛脫氫酶ALDH2基因和細胞色素CYP2E1基因中的至少2個，同時判斷基因型。發(fā)明的效果通過本發(fā)明，提供了安全、快速且廉價的判斷與乙醇敏感度相關(guān)的基因的基因型的方法。


圖1 模式化的示意本發(fā)明的一個優(yōu)選實例的圖。圖2 模式化的示意乙醇在體內(nèi)被分解直到排泄到體外的圖。圖3 顯示實施例1的結(jié)果的電泳照片。圖4 顯示實施例2的結(jié)果的電泳照片。圖5 顯示實施例3的結(jié)果的電泳照片。圖6 顯示實施例4的結(jié)果的電泳照片。
圖7 顯示實施例5的結(jié)果的電泳照片。圖 8 顯示了實施例 6 中的通過使用 Taqman Genotyping Master Mix (AppliedBiosystems公司生產(chǎn))的TaqMan方法，判斷ADHlB的結(jié)果的圖。圖 9 顯示了實施例 6 中的通過使用 Taqman Genotyping Master Mix (AppliedBiosystems公司生產(chǎn))的TaqMan方法，判斷ALDH2的結(jié)果的圖。圖10 顯示了實施例6中的通過使用Realtime PCR Master Mix(T0Y0B0(株)生產(chǎn))的TaqMan方法，判斷ADHlB的結(jié)果的圖(使用干燥濾紙唾液)。圖11 顯示了實施例6中的通過使用Realtime PCR Master Mix(T0Y0B0(株)生產(chǎn))的TaqMan方法，判斷ALDH2的結(jié)果的圖(使用干燥濾紙唾液)。圖12 顯示了實施例6中的通過使用Realtime PCR Master Mix(T0Y0B0(株)生產(chǎn))的TaqMan方法，判斷ADHlB的結(jié)果的圖(使用干燥濾紙血液)。圖13 顯示了實施例6中的通過使用Realtime PCR Master Mix(T0Y0B0(株)生產(chǎn))的TaqMan方法，判斷ALDH2的結(jié)果的圖(使用干燥濾紙血液)。圖14 顯示了實施例6中的通過使用RNA-direct RT-PCR MasterMiX(T0Y0B0 (株)生產(chǎn))的TaqMan方法，判斷ADHlB的結(jié)果的圖(使用干燥濾紙唾液)。圖15:顯示了實施例6中的通過使用RNA-direct RT-PCR MasterMiX(T0Y0B0 (株)生產(chǎn))的TaqMan方法，判斷ALDH2的結(jié)果的圖(使用干燥濾紙唾液)。圖16 顯示了實施例6中的通過使用RNA-direct RT-PCR MasterMiX(T0Y0B0 (株)生產(chǎn))的TaqMan方法，判斷ADHlB的結(jié)果的圖(使用干燥濾紙血液)。圖17:顯示了實施例6中的通過使用RNA-direct RT-PCR MasterMiX(T0Y0B0 (株)生產(chǎn))的TaqMan方法，判斷ALDH2的結(jié)果的圖(使用干燥濾紙血液)。
具體實施例方式圖1是模式化的示意本發(fā)明的一個優(yōu)選實例的圖。本發(fā)明是判斷乙醇敏感度相關(guān)基因的基因型的方法，其包括使含有上述基因的固體待測樣品與含有緩沖液和DNA聚合酶的溶液，以及用于擴增上述基因的引物DNA直接接觸，實施選自聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、LAMP (環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(Loop-Mediated Isothermal Amplification))法、鏈置換擴增、逆轉(zhuǎn)錄酶鏈置換擴增、逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、逆轉(zhuǎn)錄LAMP法、基于核酸序列的擴增、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增和滾環(huán)擴增法的方法，擴增上述基因的步驟，和根據(jù)上述擴增的基因，判斷所述基因的基因型的步驟。下文參考圖1詳細地說明本發(fā)明的方法。在圖1中顯示的實例中，首先，通過直接采集固體待測樣品或干燥液體物質(zhì)，從檢測對象采集含乙醇敏感度相關(guān)基因的固體待測樣品。在直接采集固體待測樣品的情況下，以選自檢測對象的毛根、口腔粘膜和細胞組織的固體作為固體待測樣品，直接提供給到后續(xù)步驟。需要說明的是，毛根只要是包括頭發(fā)、眉毛、鼻毛、胡須、陰毛、腋毛在內(nèi)的全部體毛來源的毛根即可，沒有特殊的限制。由于毛根是從根部拔出毛發(fā)而獲得的，因此能夠相對不伴隨疼痛而采集，而口腔粘膜是用棉簽等在口中輕輕拭取皮膚而采集，可以無痛采集。此外，口腔粘膜也可以在采集后使其直接置于室溫干燥而成為固體狀態(tài)。優(yōu)選將細胞組織干燥到直接使用的程度，特別優(yōu)選水含量在O%以上且低于50%。此外，優(yōu)選細胞組織被細微粉碎。
此外，在通過干燥液體物質(zhì)來采集固體待測樣品的情況下，將使選自檢測對象的鼻涕、鼻拭子、眼結(jié)膜拭子、咽拭子、喀痰、糞便、血液、血漿、脊髓液、唾液(一般包括口腔粘膜)、尿、汗、精液和細胞組織中的液體物質(zhì)干燥從而獲得的固體物質(zhì)供給到后續(xù)步驟。在本文中，含在液體物質(zhì)中的細胞組織表示含水量在50%以上的物質(zhì)。需要說明的是，所述口腔粘膜也可以在適當(dāng)干燥后使用。在本文中，干燥液體物質(zhì)的方法可以選自如下的公知的干燥方法將液體物質(zhì)浸透到濾紙中、蒸發(fā)水分的方法，自然干燥或冷凍干燥等。但是，為了獲得糞便來源的固體待測樣品，優(yōu)選將糞便涂抹在植物纖維物體上，在將植物纖維物體自然干燥后，與硅膠一起密封并保存1小時以上。植物纖維物體是指紙、棉等植物性的纖維物體。通過干燥液體物質(zhì)并作為固體待測樣品，可以抑制原來包含在液體物質(zhì)中的蛋白酶、淀粉酶和核酸酶等的酶活性，可以不完全殺死生物體組織細胞、微生物和病毒而使其生命活動休止。因而，固體待測樣品的運輸、保存等可以在室溫下進行，具有變得更方便的優(yōu)點ο在本發(fā)明的基因型判斷方法中，上述步驟中，從采集獲得的細胞數(shù)量是一定的，且可以為基因型判斷提供穩(wěn)定量的模板，再現(xiàn)性好這樣的觀點來看，優(yōu)選固體待測樣品為血液或唾液的干燥物或者是毛根，此外，由于如上所述是從根部拔出毛發(fā)，能夠相對不伴隨疼痛而采集，因此固體待測樣品特別優(yōu)選是毛根。需要說明的是，在固體待測樣品是血液的干燥物的情況下，與傳統(tǒng)的乙醇敏感度相關(guān)基因的基因型判斷方法相比，具有血液采集量較少即可以判斷的優(yōu)點。圖1中，顯示了從檢測對象中小心地拔出含有毛根2的頭發(fā)1，作為固體待測樣品來采集的實例。在本文中，圖2是模式化的示意乙醇在體內(nèi)被分解直到排泄到體外的圖。被攝入體內(nèi)的乙醇一般首先通過乙醇脫氫酶ADH、肝微粒體氧化體系的細胞色素CYP2E1等被分解為乙醛。乙醛通過乙醛脫氫酶(ALDH)被分解為乙酸。之后，乙酸在被分解為水和二氧化碳后，被排泄到體外。本發(fā)明中的“乙醇敏感度相關(guān)基因”指與此類乙醇代謝相關(guān)的酶的基因，優(yōu)選是乙醇脫氫酶ADHlB基因、乙醛脫氫酶ALDH2基因和細胞色素CYP2E1基因中的至少一個基因。如上所述，在乙醇脫氫酶ADHlB基因中存在基因型ADHB1*1 (SEQ IDNO :1所示堿基序列)和基因型ADHB1*2(SEQ ID NO :2所示堿基序列)，已知約60%的日本人具有乙醇脫氫酶ADH具有正常活性(酶活性200)的等位基因ADHB1*2A2，約35%的日本人具有乙醇脫氫酶ADH具有正?；钚?酶活性100)的等位基因ADHB1*1#2，約5%的日本人具有乙醇脫氫酶ADH具有低活性(酶活性1)的等位基因ADHB1*1/*1。此外，在乙醛脫氫酶ALDH2基因中存在基因型ALDH2*1 (SEQ ID NO 3所示堿基序列)和基因型ALDH2M (SEQ ID NO 4所示堿基序列)，已知約56%的日本人具有乙醛脫氫酶ADH具有正常活性(酶活性100)的等位基因ALDH2*1/*1，約40%的日本人具有低乙醛脫氫酶ADH活性(酶活性6)的等位基因ALDH2*l/*2，約4%的日本人具有乙醛脫氫酶ADH為無活性型(酶活性0)的等位基因ALDH2M/*2。進一步的，在細胞色素CYP2E1基因中已知有基因型CYP2El*cl(SEQID NO :5所示堿基序列)和基因型CYP2El*c2(SEQ ID NO 6所示堿基序列)。需要說明的是，本發(fā)明中的乙醇敏感度相關(guān)基因可適用的長度一般為20至數(shù)十萬堿基左右，優(yōu)選50至3000個堿基。本發(fā)明的基因型判斷方法中，接下來，將如上所述采集的固體待測樣品與含有緩沖液和DNA聚合酶的溶液，以及用于擴增特定基因的引物DNA直接接觸，實施選自聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、LAMP法、鏈置換擴增、逆轉(zhuǎn)錄酶鏈置換擴增、逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、逆轉(zhuǎn)錄LAMP法、基于核酸序列的擴增、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增和滾環(huán)擴增法的方法，擴增包含在固體待測樣品中的乙醇敏感度相關(guān)基因。本步驟優(yōu)選在板狀或管狀的擔(dān)載體上擴增上述基因。具體而言，首先將試劑放在板狀或管狀的擔(dān)載體上。在管狀擔(dān)載體的情況下，試劑放入其內(nèi)部，在板狀擔(dān)載體的情況下，試劑放在其表面。該試劑含有包含緩沖液和DNA聚合酶的溶液，以及引物DNA。在擔(dān)載體上放置固體待測樣品從而使試劑和固體待測樣品直接接觸，通過公知的方法，通過選自聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、LAMP法、鏈置換擴增、逆轉(zhuǎn)錄酶鏈置換擴增、逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、逆轉(zhuǎn)錄LAMP法、基于核酸序列的擴增、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增和滾環(huán)擴增法的方法擴增基因。需要說明的是，也可以在擔(dān)載體上放置固體待測樣品，然后再在擔(dān)載體上放置試劑。圖1中顯示了在管狀擔(dān)載體3的內(nèi)部放入PCR反應(yīng)溶液4，再在擔(dān)載體3中放入作為固體待測樣品的頭發(fā)1，使固體待測樣品與PCR反應(yīng)溶液接觸，然后在管狀的擔(dān)載體3上蓋上蓋5，進行PCR反應(yīng)的實例。在本步驟中，DNA聚合酶只要是以Taq DNA聚合酶為代表的耐熱性DNA聚合酶即可，沒有特殊的限制，但優(yōu)選使用KOD DNA聚合酶。對緩沖液而言，只要是即使在包含于固體待測樣品中的抑制PCR反應(yīng)的物質(zhì)存在的條件下，緩沖液也可以擴增DNA即可，沒有特殊的限制，但優(yōu)選使用feWay (商標(biāo))(KOMA Biotechnology)、AmpdireCt (注冊商標(biāo))(島津制作所)、Phusion (注冊商標(biāo))Blood Direct PCR試劑盒緩沖液(New ENGLANDBio-Labs) ,KODFX緩沖液(Τ0Υ0Β0)等，特別優(yōu)選使用為KOD DNA聚合酶開發(fā)的KOD FX緩沖液(Τ0Υ0Β0)。在構(gòu)成乙醇敏感度相關(guān)基因的核酸是DNA的情況下，可以進行直接PCR法或LAMP法等。此外，在所述核酸是RNA片段的情況下，在RNA片段進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后，可以使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、LAMP 法、鏈置換擴增(SDA Strand Displacement Amplification)、逆轉(zhuǎn)錄酶鏈置換擴增(RT(逆轉(zhuǎn)錄)_SDA)、逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)、逆轉(zhuǎn)錄 LAMP 法(RT-LAMP)、基于核酸序列的擴增(NASBA =Nucleic Acid Sequence-BasedAmplification)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增(TMA =Transcription-MediatedAmplification)和滾環(huán)擴增法等基因擴增方法進行擴增。需要說明的是，PCR等的擴增條件只要引起特異性擴增即可，沒有其他特殊限制，可以進行恰當(dāng)設(shè)定。需要說明的是，在本發(fā)明中，優(yōu)選同時擴增選自乙醇脫氫酶ADHlB基因、乙醛脫氫酶ALDH2基因和細胞色素CYP2E1基因中的至少2個，同時判斷基因型。本發(fā)明中用于PCR法的引物DNA只要可以特異性的擴增乙醇敏感度相關(guān)基因即可，沒有特殊的限制，此外，可以用適當(dāng)公知的方法來設(shè)計。需要說明的是，因為可以用簡單的步驟判斷基因型，在PCR方法中優(yōu)選利用等位基因擴增(ASP :Allele SpecificPrimer)-PCR 法和 PCR-RFLP (限制性酶切片段長度多態(tài)性Restriction Fragment LengthPolymorphism)法，故使用為此設(shè)計的引物DNA是優(yōu)選的。此外，在本發(fā)明中，PCR方法可利用TaqMan方法。TaqMan方法是利用熒光標(biāo)記的等位基因特異性寡核苷酸(TaqMan探針)和TaqDNA聚合酶的PCR方法(例如，參見Genet.Anal.，14143-149 (1999)，J. Clin. Microbiol.，34，2933-2936 (1996)等)。針對包含目標(biāo)序列的區(qū)域設(shè)計引物，TaqMan探針設(shè)置在其間。在該探針的5’末端側(cè)標(biāo)記報告熒光色素 (R)，在3’末端側(cè)標(biāo)記淬滅劑熒光色素⑴)。通過設(shè)計探針的Tm值比引物的Tm值高10°C， 從而首先雜交探針。然后雜交引物，通過DNA聚合酶的5’-3’外切核酸酶活性，逐個堿基的水解TaqMan探針，游離出報告熒光色素。利用該游離的報告色素的強度與PCR產(chǎn)物成比例這一點。在用TaqMan方法解析基因的情況下，可以恰當(dāng)?shù)拇_定引物和探針的具體的核苷酸序列。5’末端側(cè)的報告熒光色素和3’末端側(cè)的淬滅劑熒光色素這兩種熒光標(biāo)記物只要是可以相互識別的組合即可，這類熒光標(biāo)記物的組合可以使用各自公知產(chǎn)品。適當(dāng)?shù)木唧w實例可列舉6-FAM(注冊商標(biāo))、VIC (注冊商標(biāo))和TET (注冊商標(biāo))的任何組合。需要說明的是，上述引物和探針只不過是一個例子，如果是寡核苷酸引物則只要不妨礙能夠進行目的擴增反應(yīng)，而另一方面如果是寡核苷酸探針則只要不妨礙能夠進行目標(biāo)雜交反應(yīng)即可，在一部分堿基序列中也可以進行缺失、取代、插入和/或添加等改變。發(fā)生改變的堿基數(shù)可以是例如1-5個，優(yōu)選1-3個。需要說明的是，此類改變原則上在與多態(tài)性位點對應(yīng)的堿基以外的部分中進行。用于多態(tài)性解析的寡核苷酸(探針、引物)可使用與解析方法對應(yīng)的恰當(dāng)?shù)腄NA 片段或RNA片段。用于多態(tài)性解析的寡核苷酸的堿基長度只要是能發(fā)揮各自功能的長度即可，以在用作引物的情況下的堿基長度為例，是15-30個堿基的長度，優(yōu)選18-25個堿基左右的長度。根據(jù)所使用的檢測方法適當(dāng)?shù)卦O(shè)定所擴增的多核苷酸的長度，一般而言是20-500 個堿基的長度，優(yōu)選20-200個堿基的長度。本發(fā)明的引物和探針在其序列末端還包括添加了用于檢測的恰當(dāng)標(biāo)記。作為標(biāo)記，可列舉例如ROX(注冊商標(biāo))、FITC(注冊商標(biāo)；熒光黃)、TET(注冊商標(biāo))、Cy5(注冊商標(biāo))、HEX (注冊商標(biāo))、NED (注冊商標(biāo))、6-FAM (注冊商標(biāo))、ROX (注冊商標(biāo))、TAMRA (注冊商標(biāo))、羅丹明(rhodamin)或它們的衍生物等熒光色素、酶、蛋白質(zhì)、放射性物質(zhì)、生物素、 硫醇等，但不限于此。用熒光色素標(biāo)記堿基的方法，可使用公知的方法。此外，也可以使用市售的熒光標(biāo)記試劑盒。用于多態(tài)性解析的寡核苷酸(探針、引物)的合成具體可通過普通的亞磷酰胺法、 磷酸三酯法等化學(xué)合成法，或者可使用市售的自動化寡核苷酸合成裝置(例如Wiarmacia LKB Gene Assembler Plus :Pharmacia公司生產(chǎn))等來合成。或者可以使用用戶合成的寡核苷酸。在本文中，作為本發(fā)明所稱的“不溶性擔(dān)載體”，除了由塑料、玻璃等組成的管之外，還可列舉96孔板等。所謂的管狀，是指中空的狀態(tài)，可以是具有底的PCR管或Eppendorf 管這樣的形狀。如上所述，在擔(dān)載體表面固定探針DNA是特別優(yōu)選的。這是因為固體待測樣品中的乙醇敏感度相關(guān)基因經(jīng)由固定在管狀擔(dān)載體上的寡聚DNA(探針DNA)通過雜交而被捕獲，可以利用RT-PCR法進行基因擴增，或者在擔(dān)載體上的液相中擴增特定基因，同時用固定在板狀擔(dān)載體中的多種探針DNA檢測多種生物體的特異性基因，從而具有可以包羅性的檢測基因多態(tài)性(SNP)的優(yōu)點。
然后，通過選自聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、LAMP法、鏈置換擴增、逆轉(zhuǎn)錄酶鏈置換擴增、逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、逆轉(zhuǎn)錄LAMP法、基于核酸序列的擴增、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增和滾環(huán)擴增法的方法，擴增乙醇敏感度相關(guān)基因。在本發(fā)明的基因型判斷方法中，隨后根據(jù)如上所述擴增的基因判斷該基因的基因型。該步驟中的解析方法只要能夠檢測或定量所擴增的基因即可，沒有特殊的限制，可列舉選自DNA測序法、凝膠電泳法、通過平板狀DNA芯片或珠的雜交、Realtime PCR法和利用探針DNA的延伸反應(yīng)，或通過雜交的基因測定法中的任何方法。通過凝膠電泳法，可以評估 PCR擴增產(chǎn)物的量及其大小。此外，通過Realtime PCR法，可以快速的定量PCR擴增產(chǎn)物。 在采用Realtime PCR法的情況下，一般而言，由于擴增循環(huán)數(shù)到1_10時，熒光強度的變化與作為噪音水平的零相等，因此將其作為擴增產(chǎn)物零的空白樣品，計算出它們的標(biāo)準(zhǔn)偏差， 乘以10后的熒光值作為閾值，最初高于該閾值的PCR循環(huán)數(shù)被稱為循環(huán)數(shù)閾值(Ct值)。 因此，在PCR反應(yīng)溶液中，初始的DNA模板量越多，則Ct值越小，模板DNA量越少，則Ct值越大。此外，即使模板DNA的量相同，在該模板內(nèi)的PCR特定基因發(fā)生切割的比例越高，則同區(qū)域的PCR反應(yīng)的Ct值越大。根據(jù)本發(fā)明，可以安全、快速且廉價的判斷乙醇敏感度相關(guān)基因的基因型。由此使得能夠以比傳統(tǒng)安全、快速且廉價得多的構(gòu)建乙醇敏感度相關(guān)基因的檢測系統(tǒng)。此類基因檢測系統(tǒng)可用于預(yù)防未成年人飲酒的酒精健康教育、面向通過基因診斷的定制醫(yī)療的普及以及理解的啟蒙活動，用于針對酒精的安心及安全的健康管理等。實施例下面，列舉實施例更詳細的說明本發(fā)明，但本發(fā)明不限于這些實施例?！磳嵤├?>(1)通過PCR-RFLP法判斷基因型按以下順序，針對從檢測對象分別采集的血液(全血)、唾液(包含口腔內(nèi)的細胞)、毛根，進行乙醇脫氫酶ADHlB基因和乙醛脫氫酶ALDH2基因的基因多態(tài)性檢測。對于血液和唾液，浸透在濾紙(Advantec定性濾紙No. 2)上，使其自然干燥，作為固體待測樣品采集。省略了一般進行的DNA提取、純化過程，將該干燥濾紙的直徑Imm的打孔片("千片)直接放入管狀擔(dān)載體內(nèi)的PCR反應(yīng)溶液中。此外，對于毛根，將其直接放入管狀擔(dān)載體內(nèi)的PCR反應(yīng)溶液中。PCR反應(yīng)溶液使用PCR試劑盒KOD FX (Τ0Υ0Β0 (株)生產(chǎn))，遵循所附規(guī)程，分別配制含以下試劑的25 μ L反應(yīng)溶液。(用于ADHlB基因的PCR反應(yīng)溶液)· KOD FX 的 2 X PCR 緩沖液:7· 5 μ L‘ dNTP 1. 5μ L 引物 1 (ADHlB-F) (10 μ Μ) :0. 6M1 引物 2 (ADHlB-R) (10 μ Μ) :0. 6 μ L· KOD FX :0. 3Μ1.DW(蒸餾水)4.5yL。(用于ALDH2基因的PCR反應(yīng)溶液)· KOD FX 的 2 X PCR 緩沖液:7· 5 μ L‘ dNTP 1. 5μ L
弓丨物 3 (ALDH2-F) (10 μ Μ) :0. 6 μ L·引物 4(ALDH2_R) (10 μ Μ) :0. 6 μ L‘ KOD FX :0. 3μ L.DW(蒸餾水)4.5yL。需要說明的是，作為ADHlB基因用的PCR-RFLP引物使用以下2種。 引物 I(ADHlB-F) :5，-CCTTGGGGATAAACTGAATCTT-3，(SEQ IDNO 7)·引物 2 (ADHlB-R) :5，-GAAATCCTGGATGGTGAACC-3，(SEQ ID NO :8)。此外，作為ALDH2基因用的PCR-RFLP引物使用以下2種?！ひ?3(ALDH2-F) :5，-TCAAATTACAGGGTCAACTGCT-3，(SEQ IDNO 9)·引物 4(ALDH2-R) :5，-GGCTGGGTCTTTACCCTCTC-3，(SEQ ID N0:10)。給管狀的擔(dān)載體蓋上蓋，用以下擴增條件進行PCR反應(yīng)。(擴增條件)熱變性95°C，5分鐘98 "C，10 秒一60 "C，30 秒一74 °C，45 秒，循環(huán) 40 次延伸反應(yīng)74 °C，2分鐘。PCR反應(yīng)后獲得的ADHlB基因的擴增產(chǎn)物是349bp。將該ADHlB基因的擴增產(chǎn)物在以下組成的反應(yīng)溶液中37°C進行1小時的限制性酶切反應(yīng)。(用于ADHlB基因的限制性酶切反應(yīng)溶液)· 10XNEB 緩沖液 4 :2 μ L· ADHlB基因的擴增產(chǎn)物6 μ L· Msl 1 :0. 25 μ L蒸餾水)11.75yL。此外，PCR反應(yīng)后獲得的ALDH2基因的擴增產(chǎn)物是430bp。將該ALDH2基因的擴增產(chǎn)物在以下組成的反應(yīng)溶液中37°C進行1小時的限制性酶切反應(yīng)。(用于ALDH2基因的限制性酶切反應(yīng)溶液)· 10XNEB 緩沖液 4 :2 μ L· 8XSAM 2. 5μ L· ALDH2基因的擴增產(chǎn)物6 μ L· Acu 1 :0. 25 μ L蒸餾水)9.25yL。將反應(yīng)后的ADHlB基因、ALDH2基因的限制性酶切處理片段分別上樣至瓊脂糖凝膠，利用電泳確定所擴增的基因。圖3是顯示實施例1的結(jié)果的電泳照片。需要說明的是，從圖3中，已知分別獲得了 189bp、160bp的ADHlB基因的限制性酶切處理片段，296bp、134bp 的ALDH2基因的限制性酶切處理片段。在圖3(a)中，各條帶顯示了以下結(jié)果?！l帶 1(血液)·條帶 2 :ADHlB*2/*2 (唾液)·條帶 3 :ADHlB*2/*2 (毛根)·條帶 4 :ALDH2*2/*2 (血液)條帶 5 :ALDH2*2/*2 (唾液) 條帶 6 :ALDH2*2/*2 (毛根)。 在圖3(b)中，各條帶顯示了以下結(jié)果t 條帶 1 :ADHlB*2/*2 (血液) 條帶 2 :ADHlB*2/*2 (唾液) 條帶 3 :ADHlB*2/*2 (毛根) 條帶 4 :ALDH2*1/*1 (血液) 條帶 5 :ALDH2*1/*1 (唾液) 條帶 6 :ALDH2*1/*1 (毛根)。 在圖3(c)中，各條帶顯示了以下結(jié)果t 條帶 1 :ADHlB*2/*2 (血液) 條帶 2 :ADHlB*2/*2 (唾液) 條帶 3 =ADHlB(毛根)
條帶 4:ALDH2 *1/*2(血液) 條帶 5:ALDH2 *1/*2(唾液) 條帶 6:ALDH2 *1/*2(毛根)。 在圖3(d)中，各條帶顯示了以下結(jié)果t 條帶 1 :ADH1B *1/*1 (血液) *1/*1 (唾液) *1/*1(毛根) *1/*1(血液) *1/*1 (唾液) *1/*1(毛根)。 在圖3(e)中，各條帶顯示了以下結(jié)果t 條帶 1 :ADH1B *1/*1 (血液) *1/*1 (唾液) *1/*1(毛根)
氺 1/氺 2 (lit)
*1/*2(唾液) *1/*2(毛根)。 在圖3(f)中，各條帶顯示了以下結(jié)果t 條帶 1 :ADH1B *1/*2(血液) *1/*2(唾液) *1/*2(毛根) *1/*1(血液) *1/*1 (唾液) *1/*1(毛根)。 在圖3(g)中，各條帶顯示了以下結(jié)果t 條帶 1 :ADH1B *1/*2(血液)
條帶 2 =ADHlB 條帶 3 =ADHlB 條帶 4 :ALDH2 條帶 5 :ALDH2 條帶 6 :ALDH2
條帶 2 =ADHlB 條帶 3 =ADHlB 條帶 4 :ALDH2 條帶 5 :ALDH2 條帶 6 :ALDH2
條帶 2 =ADHlB 條帶 3 =ADHlB 條帶 4 :ALDH2 條帶 5 :ALDH2 條帶 6 :ALDH2
·條帶 2 =ADHlB(唾液) 條帶 3:ADH1B *1/*2(毛根)·條帶 4 :ALDH2(血液)·條帶 5 :ALDH2(唾液)·條帶 6 :ALDH2(毛根)。〈實施例2>與實施例1同樣的將采集的血液浸透濾紙(Advantec定性濾紙No. 2)，使其自然干燥，作為固體待測樣品，將該干燥濾紙的直徑Imm的打孔片直接放入管狀擔(dān)載體內(nèi)的PCR反應(yīng)溶液中。PCR反應(yīng)溶液使用PCR試劑盒K0DFX(T0Y0B0(株)生產(chǎn))，遵循所附規(guī)程，分別配制含以下試劑的25 μ L反應(yīng)溶液。
0173](用于ADHlB基因的PCR反應(yīng)溶液)
0174]· KOD FX 的 2 X PCR 緩沖液10 μ L
0175]· dNTP :2μ L
0176] 弓丨物 5 (ADHlB-F) (10 μ Μ) :0· 8μ L
0177] 弓丨物 6 (ADHlB-R) (10 μ Μ) :0· 8μ L
0178]· KOD FX :0· 4μ L
0179]· DW(蒸餾水)6yL。
0180](用于ALDH2基因的PCR反應(yīng)溶液) 0181 ]· KOD FX 的 2 X PCR 緩沖液10 μ L
0182]· dNTP :2μ L
0183] 引物 7(ALDH2_F) (ΙΟμΜ) :0· 8μ L
0184] 引物 8(ALDH2_R) (ΙΟμΜ) :0. 8μ L
0185]‘ KOD FX :0. 4μ L
0186]· DW(蒸餾水)6yL。
0187]需要說明的是，作為用于ADHlB基因的PCR-RFLP引物使用以下2種。
0188]·引物 5 (ADHlB-F) :5，-GGAAGGTAGAGAAGGGCTTTAGACTG-3，(SEQ ID NO 11)
0189]·引物 6 (ADHlB-R) :5，-GTGCAAGCACTTTCGTCTCTCATTG-3，(SEQID NO 12)。
0190]需要說明的是，作為用于ALDH2基因的PCR-RFLP引物使用以下2種。
0191]·引物 7(ALDH2-F) :5，-TGGGCGAGTACGGGCTGCAGGCAIAGACT-3，(SEQ ID NO 13)
0192]·引物 8(ALDH2-R) :5，-CCGGCAGGTCCTGAACCTCTGGCAGGC—3，(SEQ ID NO: 14)。
0193]給管狀的擔(dān)載體蓋上蓋，用以下擴增條件分別獨立的進行ADHlB基因、ALDH2基因的PCR反應(yīng)。
0194](擴增條件)
0195]熱變性95°C，10分鐘
0196]98 "C，10 秒一62 "C，30 秒一74°C，30 秒，循環(huán) 40 次
0197]延伸反應(yīng)74°C，2分鐘。
0198]PCR反應(yīng)后獲得的ADHlB基因的擴增產(chǎn)物是428bp。將該ADHlB基因的擴增產(chǎn)物在以下組成的反應(yīng)溶液中37°C進行1小時的限制性酶切反應(yīng)。(用于ADHlB基因的限制性酶切反應(yīng)溶液)
· 10 XNEB 緩沖液 4 :2 μ L· ADHlB基因的擴增產(chǎn)物6 μ L· Msl 1 :0. 5μ L.DW(蒸餾水)11.5yL。此外，PCR反應(yīng)后獲得的ALDH2基因的擴增產(chǎn)物是169bp。將該ALDH2基因的擴增產(chǎn)物在以下組成的反應(yīng)溶液中37°C進行1小時的限制性酶切反應(yīng)。(用于ALDH2基因的限制性酶切反應(yīng)溶液)· 10 XNEB 緩沖液 4 :2 μ L· 8XSAM 2. 5μ L· ALDH2基因的擴增產(chǎn)物6 μ L· Acu 1 :0. 5μ L蒸餾水)9.25yL。將反應(yīng)后的ADHlB基因、ALDH2基因的限制性酶切處理片段分別上樣至瓊脂糖凝膠，利用電泳確定所擴增的基因。需要說明的是，作為對照，還使用了 DW。圖4是顯示實施例2的結(jié)果的電泳照片。需要說明的是，從圖4中，已知分別獲得了 217bp、211bp的ADHlB 基因的限制性酶切處理片段，48bp、121bp的ALDH2基因的限制性酶切處理片段。在圖4(a)中，各條帶顯示了以下結(jié)果。·條帶 1 :ADHlB*l/*2 條帶 2 :ADH1B*1/*1 條帶 3 :ADH1B*1A2 條帶 4:而。在圖4(b)中，各條帶顯示了以下結(jié)果?！l帶 1 :ALDH2*lA2 條帶 2 :ALDH2*2A2·條帶 3 :ALDH2*2/*2 條帶 4:而。<實施例3>使用以下限制性酶切反應(yīng)溶液，將與實施例2同樣獲得的ADHlB基因、ALDH2基因的擴增產(chǎn)物，同時在37°C進行限制性酶切反應(yīng)1小時。(限制性酶切反應(yīng)溶液)· 10 XNEB 緩沖液 4 :2 μ L· ADHlB基因的擴增產(chǎn)物3 μ L· ALDH2基因的擴增產(chǎn)物3 μ L· 8XSAM 2. 5μ L· Msl 1 :0. 5μ L· Acu 1 :0. 5μ L蒸餾水)8.5yL。將反應(yīng)后的ADHlB基因、ALDH2基因的限制性酶切處理片段分別上樣至瓊脂糖凝膠，利用電泳確定所擴增的基因。需要說明的是，作為對照，還使用了 DW。圖5是顯示實施
14例3的結(jié)果的電泳照片。在圖5中，各條帶顯示了以下結(jié)果?！l帶 1 :ADHlB*l/*2、ALDH2*l/*2·條帶 2 :ADHlB*l/*l、ALDH2M/*2·條帶 3 :ADHlB*l/*2、ALDH2*2/*2·條帶 4 =Dff0<實施例4>與實施例1同樣的將采集的血液浸透濾紙(Advantec定性濾紙No. 2)，使其自然干燥，作為固體待測樣品，將該干燥濾紙的直徑Imm的打孔片直接放入管狀擔(dān)載體內(nèi)的PCR反應(yīng)溶液中。PCR反應(yīng)溶液使用PCR試劑盒K0DFX(T0Y0B0(株)生產(chǎn))，遵循所附規(guī)程，分別配制含以下試劑的25 μ L反應(yīng)溶液。(PCR反應(yīng)溶液)· KOD FX 的 2 X PCR 緩沖液10 μ L‘ dNTP :2μ L 引物 5 (ADHlB-F) (10 μ Μ) :0. 4 μ L 引物 6 (ADHlB-R) (10 μ Μ) :0. 4 μ L 弓 I物 7 (ALDH2-F) (10 μ Μ) :0· 8 μ L 弓 I物 8 (ALDH2-R) (10 μ Μ) :0· 8 μ L‘ KOD FX 0. 4μ L 而(蒸餾水)5.2口1^。給管狀的擔(dān)載體蓋上蓋，用以下擴增條件，同時進行ADHlB基因、ALDH2基因的PCR反應(yīng)。(擴增條件)熱變性95°C，10分鐘98 "C，10 秒一62 "C，30 秒一74°C，30 秒，循環(huán) 40 次延伸反應(yīng)74 °C，2分鐘。使用以下組成的限制性酶切反應(yīng)溶液，將所獲得的PCR擴增產(chǎn)物在37°C進行1小時的限制性酶切反應(yīng)。(限制性酶切反應(yīng)溶液)· 10XNEB 緩沖液 4 :2 μ L· PCR 擴增產(chǎn)物6 μ L· 8XSAM 2. 5μ L· Msl 1 :0. 5μ L· Acu 1 :0. 5μ L蒸餾水)8.5yL。將反應(yīng)后的限制性酶切處理片段分別上樣至瓊脂糖凝膠，利用電泳確定所擴增的基因。需要說明的是，作為對照，還使用了 DW。圖6是顯示實施例4的結(jié)果的電泳照片。在圖6中，各條帶顯示了以下結(jié)果?！l帶 1 :ADHlB*l/*2、ALDH2*l/*2
·條帶 2 :ADHlB*l/*l、ALDH2M/*2·條帶 3 :ADHlB*l/*2、ALDH2*2/*2 條帶4 :DW(蒸餾水)。<實施例5>與實施例1同樣的將采集的血液浸透濾紙(Advantec定性濾紙No. 2)，使其自然干燥，作為固體待測樣品，將該干燥濾紙的直徑Imm的打孔片直接放入管狀擔(dān)載體內(nèi)的PCR反應(yīng)溶液中。PCR反應(yīng)溶液使用PCR試劑盒K0DFX(T0Y0B0(株)生產(chǎn))，遵循所附規(guī)程，分別配制含以下試劑的25 μ L反應(yīng)溶液。(PCR反應(yīng)溶液)· KOD FX 的 2 X PCR 緩沖液12. 5 μ L‘ dNTP 2. 5μ L 引物 9(CYP2E1_F) (ΙΟμΜ) :1 μ L·引物 10(CYP2E1-R) (ΙΟμΜ) :1 μ L‘ KOD FX 0. 5μ L蒸餾水)7.5yL。需要說明的是，作為用于CYP2E1基因的PCR-RFLP引物，使用以下2種?！ひ?9(CYP2E 1-F) :5，-CCAGTCGAGTCTACATTGTCA-3，(SEQ IDNO 15)·引物 10(CYP2E1-R) :5，-TTCATTCTGTCTTCTAACTGG-3，(SEQ IDNO :16)。給管狀的擔(dān)載體蓋上蓋，用以下擴增條件同時進行CYP2E1基因的PCR反應(yīng)。(擴增條件)熱變性95°C，10分鐘98 "C，10 秒—55 "C，30 秒—74°C，30 秒，循環(huán) 40 次延伸反應(yīng)74 °C，2分鐘。PCR反應(yīng)后獲得的CYP2E1基因的擴增產(chǎn)物為410bp。將該CYP2E1基因的擴增產(chǎn)物在以下組成的限制性酶切反應(yīng)溶液中，37°C進行1小時的限制性酶切反應(yīng)。(限制性酶反應(yīng)溶液)· IOXNEB 緩沖液 4 :2 μ L· PCR 擴增產(chǎn)物6 μ L· 8XSAM 2. 5μ L· Pst 1 :0. 5μ L.DW(蒸餾水)11.5yL。將反應(yīng)后的限制性酶切處理片段分別上樣至瓊脂糖凝膠，利用電泳確定所擴增的基因。圖7是顯示實施例5的結(jié)果的電泳照片。在圖7中，各條帶顯示了以下結(jié)果?！l帶 1 :CYP2El*cl/*cl·條帶 2 :CYP2El*cl/*c2·條帶 3 :CYP2El*c2/*c2。<實施例6>按以下順序，針對分別從檢測對象(被檢測者A、B、C、D)采集的唾液(包含口腔內(nèi)的細胞)或血液，使用Realtime PCR裝置ABI7300 (Applied Biosystems公司生產(chǎn))，通過 TaqMan (注冊商標(biāo))法進行乙醇脫氫酶ADHlB基因和乙醛脫氫酶ALDH2基因的基因多態(tài)性的檢測。對于唾液或血液，浸透在濾紙(Advantec定性濾紙No. 2)中，使其自然干燥，作為固 #Ι# #[ πΜ_。 $ Taqman Genotyping Master Mix (Applied Biosystems)白勺
情況下，省略了一般進行的DNA提取、純化過程，將該干燥濾紙的直徑2mm的打孔片1片放入裝有10 μ L水的Eppendorf管中，于90°C加熱10分鐘。將其5 μ L的上清液放入TaqMan 反應(yīng)溶液中。在使用Realtime PCR Master Mix(T0Y0B 0(株)制造和 RNA-directRT-PCR Master Mix (T0Y0B0 (株)制造)的情況下，如下調(diào)整干燥濾紙唾液或干燥濾紙血液加熱處理的上清。將干燥濾紙唾液或干燥濾紙血液的1張直徑2mm的打孔片放入裝有含IM甜菜堿的10 μ LPCR緩沖液的Eppendorf管中，90°C加熱10分鐘。將其5 μ L的上清液放入TaqMan 反應(yīng)溶液中。在此，已知血液中含有大量抑制PCR的物質(zhì)，以此為模板不能成功的進行PCR。 迄今為止，在以血液為樣品的PCR中，Tth DNA聚合酶比Taq DNA聚合酶更有利，血液中的抑制物質(zhì)是血紅蛋白、乳鐵蛋白，已報道BSA或甜菜堿可作為添加劑有效回避抑制物質(zhì)的影響。另一方面，已知作為抗凝血劑的肝素也抑制PCR(例如，參見Michael P.和Andrew L.， Nucleic Acids Reserch，19，1151 (1991)(非專利文獻 8) ；Henke W.，Herdel K.，Jung K.， Schnorr D.和 Loening A. S.，Nucleic Acids Reserch，25，3957 (1997)(非專利文獻 9)； Waleed Α. A.和 Peter R.，J. clin. Microbiol.，39，485-493 (2001)(非專利文獻 10)等)。在通過TaqMan法判斷基因中，探針和引物對使用Applied Biosystems公司的 TaqMan(注冊商標(biāo))SNP基因分型測定試劑盒，PCR擴增使用TaqmanGenotyping Master Mix (Applied Biosystems 公司生產(chǎn))、Realtime PCR MasterMix (T0Y0B0 (株)生產(chǎn))或 RNA-direct RT-PCR Master Mix (T0Y0B0(株)生產(chǎn))，分別配制含有以下試劑的20 μ L反應(yīng)溶液?；蛐偷呐袛嗍歉鶕?jù)該反應(yīng)的結(jié)果，按附帶的規(guī)程通過檢測到的2色熒光強度來判斷。(用于ADHlB基因的TaqMan探針和引物對)· TaqMan(注冊商標(biāo))藥物代謝基因分型測定(Drug Metabolism Genotyping Assays) (Applied Biosystems 公司生產(chǎn))·基因名稱乙醇脫氫酶IB (I類)，beta多肽· iTac1Man (注冊商標(biāo))SNP Genotyping Assay Mix ID :C_2688467_20。(用于ADHlB基因的TaqMan反應(yīng)溶液)〈在使用 Taqman Genotyping Master Mix (Applied Biosystems 公司生產(chǎn))的情況下〉· Taqman Genotyping Master Mix :10 μ L· Taqman Assay Mix C_2688467_20 :1 μ L·干燥濾紙唾液加熱處理的上清5 μ L· DW(蒸餾水)4yL?！丛谑褂肦ealtime PCR Master Mix(T0Y0B 0(株)制造)的情況下〉· Realtime PCR Master Mix :10 μ L· Taqman Assay Mix C_2688467_20 :1 μ LCN 102549171 A_
·干燥濾紙唾液加熱處理的上清5 μ L· DW(蒸餾水)4yL。< 在使用 Realtime PCR Master Mix(T0Y0B 0(株)制造)的情況下 >· Realtime PCR Master Mix :10 μ L· Taqman Assay Mix C_2688467_20 :1 μ L·干燥濾紙血液加熱處理的上清5 μ L· DW(蒸餾水)4yL?！丛谑褂肦NA-direct RT-PCR Master Mix(T0Y0B 0(株)制造)的情況下〉· RNA-direct RT-PCR Master Mix :10 μ L· 25mM MgSO4 1 μ L· Taqman Assay Mix C_2688467_20 :1 μ L·干燥濾紙唾液加熱處理的上清5 μ L· DW(蒸餾水)3yL。〈在使用RNA-direct RT-PCR Master Mix(T0Y0B 0(株)制造)的情況下〉· RNA-direct RT-PCR Master Mix :10 μ L· 25mM MgSO4 1 μ L· Taqman Assay Mix C_2688467_20 :1 μ L·干燥濾紙血液加熱處理的上清5 μ L· DW(蒸餾水)3yL。(用于ALDH2基因的TaqMan探針和引物對)·TaqMan (注冊商標(biāo))Drug Metabolism Genotyping Assays (Applied Biosystems 公司生產(chǎn))·基因名稱乙醛脫氫酶2家族(線粒體的)· TaqMan (注冊商標(biāo))SNP Genotyping Assay Mix ID :C_11703892_10。<Taqman Genotyping Master Mix (Applied Biosystems ^W]^zfe )白勺If 況下〉· Taqman Genotyping Master Mix :10 μ L· Taqman Assay Mix C_11703892_10 :1 μ L·干燥濾紙唾液加熱處理的上清5 μ L· DW(蒸餾水)4yL。< 在使用 Realtime PCR Master Mix(T0Y0B 0(株)制造)的情況下 >· Realtime PCR Master Mix :10 μ L· Taqman Assay Mix C_11703892_10 :1 μ L·干燥濾紙唾液加熱處理的上清5 μ L· DW(蒸餾水)4yL。< 在使用 Realtime PCR Master Mix(T0Y0B0 (株)制造)的情況下 >· Realtime PCR Master Mix :10 μ L· Taqman Assay Mix C_11703892_10 :1 μ L·干燥濾紙血液加熱處理的上清5 μ L
· DW(蒸餾水)4yL。< 在使用 RNA-direct RT-PCR Master Mix(T0Y0B0 (株)制造)的情況下 >· RNA-direct RT-PCR Master Mix :10 μ L· 25mM MgSO4 1 μ L· Taqman Assay Mix C_11703892_10 :1 μ L·干燥濾紙唾液加熱處理的上清5 μ L· DW(蒸餾水)3yL。< 在使用 RNA-direct RT-PCR Master Mix(T0Y0B0 (株)制造)的情況下 >· RNA-direct RT-PCR Master Mix :10 μ L· 25mM MgSO4 1 μ L· Taqman Assay Mix C_11703892_10 :1 μ L·干燥濾紙血液加熱處理的上清5 μ L· DW(蒸餾水)3yL。(擴增條件)熱變性95°C，10分鐘95"C，15 秒一60°C，1 分鐘，40 個循環(huán)。樣品如下所示。表 權(quán)利要求
1.一種判斷基因型的方法，其是判斷乙醇敏感度相關(guān)基因的基因型的方法，該方法包括使含有所述基因的固體待測樣品與含有緩沖液和DNA聚合酶的溶液，以及用于擴增所述基因的引物DNA直接接觸，實施選自聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、LAMP法、鏈置換擴增、逆轉(zhuǎn)錄酶鏈置換擴增、逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、逆轉(zhuǎn)錄LAMP法、基于核酸序列的擴增、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增和滾環(huán)擴增法的方法，擴增所述基因的步驟，和根據(jù)所述擴增的基因，判斷所述基因的基因型的步驟。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述乙醇敏感度相關(guān)基因是乙醇脫氫酶ADHlB基因、乙醛脫氫酶ALDH2基因和細胞色素CYP2E1基因中的至少一個基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述固體待測樣品是血液的干燥物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述固體待測樣品是毛根。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述固體待測樣品是唾液的干燥物。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其同時擴增選自乙醇脫氫酶ADHlB基因、乙醛脫氫酶 ALDH2基因和細胞色素CYP2E1基因中的至少2個，同時判斷基因型。
全文摘要
本發(fā)明是判斷乙醇敏感度相關(guān)基因的基因型的方法，其包括使含有上述基因的固體待測樣品與含有緩沖液和DNA聚合酶的溶液，以及用于擴增上述基因的引物DNA直接接觸，實施選自聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、LAMP法、鏈置換擴增、逆轉(zhuǎn)錄酶鏈置換擴增、逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、逆轉(zhuǎn)錄LAMP法、基于核酸序列的擴增、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增和滾環(huán)擴增法的方法，擴增上述基因的步驟，和根據(jù)上述擴增的基因，判斷所述基因的基因型的步驟；通過判斷基因型的方法，提供了安全、快速且廉價的判斷與乙醇敏感度相關(guān)的基因的基因型的方法。
文檔編號C12Q1/68GK102549171SQ20108004536
公開日2012年7月4日 申請日期2010年10月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月7日
發(fā)明者木下健司 申請人:學(xué)校法人武庫川學(xué)院, 株式會社大賽璐