專利名稱：一種芯片法鄰位連接技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及檢測多肽及其它分子間關(guān)系的方法，這些方法進(jìn)一步涉及基于陣列的系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
40年來，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)通常在實(shí)驗(yàn)室用于細(xì)胞因子檢測及定量。在此方法中， 目標(biāo)蛋白首先被固定于固相基質(zhì)上。然后，被固定的蛋白與偶聯(lián)酶分子的抗體結(jié)合，最后通過加入可產(chǎn)生檢測信號的底物孵育酶復(fù)合物檢測目標(biāo)蛋白，并且產(chǎn)生的信號強(qiáng)度與目標(biāo)蛋白的濃度成正比，及可通過平行標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)參定量蛋白。如果目標(biāo)蛋白是通過與被固定的特異抗體結(jié)合而被捕獲，即是夾心法ELISA試驗(yàn)。夾心法ELISA采用一對蛋白特異抗體，大大提高試驗(yàn)的特異性和靈敏度。鄰位連接技術(shù)(PLA)是最近發(fā)展起來的通過DNA序列檢測反應(yīng)分析特異蛋白的方法。在此方法種，目標(biāo)分子被兩個或更多鄰位探針識別，鄰位探針是由蛋白結(jié)合部分與DNA 鏈結(jié)合而成。當(dāng)三個探針結(jié)合到同一普通目標(biāo)分子上時，其中兩個探針尾部的游離端在空間上緊密靠近而與第三探針寡核苷酸雜交。加入一個恰好覆蓋前兩個寡核苷酸探針3’端及 5’端間隙的盒式寡核苷酸，并通過DNA連接酶連接成新序列。然后，連接產(chǎn)物通過PCR擴(kuò)增并與未反應(yīng)探針區(qū)分。(例如，請看文獻(xiàn),Fredriksson et al.，(2002)Nat. Biotechnol. 20 473-477,Gullberg et al.，(2004)Proc. Natl Acad. Sci. U. S. Α. 101 :8420-8424,Gullberg et al.，(2003)Curr. Opin. Biotechnol. 14 1-5，Pai et al.，(2005)Nuc. Acids Res. 33 el62 ；US Patent Applications 2002/0064779 ；2005/0003361.

發(fā)明內(nèi)容
簡單描述的本申請的實(shí)施方式，除其它外，包括檢測樣品中目標(biāo)分析物的方法。此方法利用同一個分析物分子中的至少兩個不同位點(diǎn)，或者兩個相鄰和接觸分子的兩個不同位點(diǎn)配對。這些不同位點(diǎn)也許，但并不一定，是一單個分子不可缺少的一部分。例如，一個可檢測的位點(diǎn)也許是一個多肽序列的一個或多個氨基酸的組合。這些氨基酸也許在序列上相鄰，或者由于多肽三維結(jié)構(gòu)而彼此相近。據(jù)假設(shè)，通過一個大分子修飾可形成至少一個可檢測位點(diǎn)。例如，小分子，但不限于，如一個磷酸基團(tuán)，一個糖基化組分，諸如此類，可結(jié)合目標(biāo)分析物以形成一個可被識別和被特定探針結(jié)合的獨(dú)特結(jié)構(gòu)。小分子可能是一個標(biāo)簽，如， 但不僅限于，染料，地高辛，并可被一個探頭識別。因此，本申請的一個方面是提供檢測目標(biāo)分析物的方法，包括(i)獲得懷疑包含目標(biāo)分析物的樣品；(ii)第一探針和第二探針與樣品連接，其中第一探針和第二探針各自獨(dú)立包含一個能夠特異性結(jié)合目標(biāo)分析物或標(biāo)簽的結(jié)合基，及一個寡核苷酸尾巴。所述的寡核苷酸尾巴包含一個接近目標(biāo)分析物結(jié)合基的PCR啟動子區(qū)域，一個唯一與目標(biāo)分析物結(jié)合基有關(guān)的條形碼區(qū)域，一個互補(bǔ)于連接器寡核苷酸一個區(qū)域的連接器-雜交區(qū)域，其中連接器-雜交區(qū)域遠(yuǎn)離于目標(biāo)分析物結(jié)合基，從而捕捉樣品中的目標(biāo)分析物。(iii)雜交一個連接器寡核苷酸到第一探針和第二探針的連接器-雜交區(qū)域上。(iv)連接第一探針的連接器-雜交區(qū)域到第二探針的連接器-雜交區(qū)域上，從而連接第一探針及第二探針的寡核苷酸尾巴。(ν)在第一個PCR啟動子區(qū)域之間擴(kuò)增連接的寡核苷酸尾巴區(qū)域。(vi)用一個基質(zhì)固定的寡核苷酸雜交擴(kuò)增產(chǎn)物，其中基質(zhì)固定的寡核苷酸包含一個互補(bǔ)于條形碼區(qū)域的第一區(qū)域，其中條形碼區(qū)域唯一與第一探針的目標(biāo)分析物結(jié)合基有關(guān)；和一個互補(bǔ)于條形碼區(qū)域的第二區(qū)域，其中條形碼區(qū)域唯一與第二探針的目標(biāo)分析物結(jié)合基有關(guān)。(vii) 將步驟(V)產(chǎn)物與能特異切割單鏈DNA分子或區(qū)域的核酸酶連接，其中單鏈DNA有非堿基配對的3'或一個5'端。(viii)雜交一個信號寡核苷酸到步驟(Vi)產(chǎn)物上，其中信號寡核苷酸包含一個互補(bǔ)于第一探針及第二探針連接器-雜交區(qū)域，或者互補(bǔ)于第一探針連接器-雜交區(qū)域及第二探針連接器-雜交區(qū)域結(jié)合體的核苷酸序列，以及進(jìn)一步包含一個標(biāo)簽。(ix)檢測標(biāo)簽，從而檢測樣品中分析物的存在。在本申請的這方面的實(shí)施方式中，目標(biāo)分析物可以從在其中的肽段，多肽，蛋白質(zhì)或被修飾物的group consisting中篩選出來。在本發(fā)明的這方面的實(shí)施方式中，每個第一探針的結(jié)合基也許是從抗體，抗體片段，適體，肽段，多肽，生物受體，及可結(jié)合生物分子的配體中篩選出來的。在本發(fā)明的這方面的實(shí)施方式中，第二探針的結(jié)合基也許是從抗體，抗體片段，適體，肽段，多肽，生物受體，及可結(jié)合生物分子的配體中篩選出來的。在本發(fā)明的這方面的實(shí)施方式中，樣品也許與一個標(biāo)簽結(jié)合，從而連接標(biāo)簽于目標(biāo)分析物上，其中第一探針的結(jié)合基特異結(jié)合于目標(biāo)分析物一個位點(diǎn)上，及第二探針的結(jié)合基特異結(jié)合于標(biāo)簽上。在本發(fā)明的這方面的實(shí)施方式中，標(biāo)簽也許是從染料，熒光染料及地高辛中篩選出來的。在本發(fā)明的這方面的實(shí)施方式中，第二探針的結(jié)合基能特異結(jié)合于一個多肽的修飾位點(diǎn)上。在本發(fā)明的這方面的實(shí)施方式中，一個多肽的修飾位點(diǎn)可以從包含一個磷酸化位點(diǎn)，一個糖基化位點(diǎn)，及一個多肽氨基酸序列的突變位點(diǎn)的組中篩選。在本發(fā)明的這方面的實(shí)施方式中，目標(biāo)分析物可以是至少兩個多肽的復(fù)合物，其中第一探針的結(jié)合基特異結(jié)合到第一個多肽的一個區(qū)域上，第二探針的結(jié)合基特異結(jié)合到第二個多肽的一個區(qū)域上，及在步驟(iii)中當(dāng)?shù)谝粋€多肽與第二個多肽絡(luò)合在一起時， 雜交一個連接器寡核苷酸到第一探針及第二探針的連接器-雜交區(qū)域上。在本發(fā)明的這方面的實(shí)施方式中，可特異地切割單鏈DNA分子或區(qū)域的核酸酶可從Rec J，核酸外切酶II，小腿脾磷酸二酯酶，核酸外切酶I (磷酸)，蛇毒磷酸和核酸外切酶 VII篩選出來。本發(fā)明的另一個方面提供了檢測目標(biāo)分析物的系統(tǒng)，包括第一探針及第二探針， 其中第一探針及第二探針各自獨(dú)立地包含一個能特異結(jié)合目標(biāo)分析物或者標(biāo)簽的結(jié)合基，及一個寡核苷酸尾巴。所述的寡核苷酸尾巴包含一個接近目標(biāo)分析物結(jié)合基的PCR啟動子區(qū)域，一個唯一目標(biāo)分析物結(jié)合基有關(guān)的條形碼區(qū)域，一個遠(yuǎn)離于目標(biāo)分析物結(jié)合基的連接器-雜交區(qū)域；一個微陣列，其中這個陣列包含至少一個互補(bǔ)于第一探針及第二探針條形碼的寡核苷酸。在本發(fā)明的這方面的實(shí)施方式中，第一探針的結(jié)合基可連接到寡核苷酸尾巴的5’ 端上，及第二探針的結(jié)合基連接到寡核苷酸尾巴的3’端上。在本發(fā)明的這方面的實(shí)施方式中，這個體系也許進(jìn)一步包含一個互補(bǔ)于第一探針 PCR啟動子區(qū)域的寡核苷酸及一個互補(bǔ)于第二探針PCR啟動子區(qū)域的寡核苷酸。但是，本發(fā)明的另一個方面提供了探針，這些探針包含一個可特異結(jié)合目標(biāo)分析物或其上的標(biāo)簽的結(jié)合基，及一個寡核苷酸尾巴。所述的寡核苷酸尾巴包含一個接近目標(biāo)分析物結(jié)合基的PCR啟動子區(qū)域，一個唯一與目標(biāo)分析物結(jié)合基有關(guān)的條形碼區(qū)域，一個連接器-雜交區(qū)域，其中連接器-雜交區(qū)域遠(yuǎn)離于目標(biāo)分析物結(jié)合基，并且其中所述探針被配置為用在根據(jù)本發(fā)明的方法和系統(tǒng)中。


根據(jù)以下描述的其多個實(shí)施例的詳細(xì)說明的觀點(diǎn)，并當(dāng)結(jié)合附圖時，將會更容易理解本申請進(jìn)一步的方面。圖1概要地說明本發(fā)明的芯片法鄰位連接檢測方法。圖2簡要說明陣列結(jié)合的單鏈核酸環(huán)的檢測。圖3概要地說明通過本發(fā)明的芯片法系統(tǒng)檢測被標(biāo)記的多肽。圖4概要地說明通過本發(fā)明的芯片法系統(tǒng)在激酶作用下用磷酸基團(tuán)標(biāo)記目標(biāo)分析物后，檢測被標(biāo)記的多肽。圖5概要地說明根據(jù)本發(fā)明的芯片法系統(tǒng)的過程形成的探針-分析物復(fù)合體區(qū)域。在以下說明和示例中更加詳細(xì)地描述附圖。在以下描述中將提出本發(fā)明的方法和系統(tǒng)的一些示例實(shí)施方式的細(xì)節(jié)。本發(fā)明的其它特征，對象及優(yōu)勢將通過以下說明、附圖、示例和權(quán)利要求的審查使得對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。預(yù)料到所有這些附加的系統(tǒng)、方法、特征及優(yōu)勢將包含在本說明書中，在本發(fā)明的范圍內(nèi)，并且由附隨的權(quán)利要求保護(hù)。
具體實(shí)施例方式在本發(fā)明被詳細(xì)描述之前，要理解本發(fā)明不限于描述的特定的實(shí)施例，并且就這一點(diǎn)而言當(dāng)然可以變化。也要理解此處所用的術(shù)語僅僅是為了描述特定的實(shí)施例的目的， 并且不意在限定，因?yàn)楸景l(fā)明的范圍將僅僅由從屬權(quán)利要求限定。當(dāng)提供值的范圍時，要理解在本發(fā)明內(nèi)包含每一中間值，至下限的單位的十分之一，除非上下文清楚地規(guī)定，否則在該范圍的上限和下限及該規(guī)定范圍內(nèi)的任何其他規(guī)定或中間值之間。這些更小范圍的上限及下限也許獨(dú)立包含在更小范圍內(nèi)，也包含在本發(fā)明內(nèi)，受規(guī)定范圍內(nèi)的任何特定排除限制。當(dāng)規(guī)定范圍包含一方或雙方限制時，排除那些包括限制的一方或雙方的范圍也包含在本發(fā)明內(nèi)。
除非另外限定，此處使用的所有技術(shù)及科學(xué)術(shù)語具有與本領(lǐng)域普通技術(shù)人員普遍理解的相同的含義，本發(fā)明屬于該領(lǐng)域。雖然任何類似或等同于此處所述的方法和材料也可以用在本發(fā)明的實(shí)踐或測試中，但現(xiàn)在提供較優(yōu)的方法及材料。在本說明書中引用的所有出版物及專利在此通過引用并入，仿佛每個單獨(dú)的出版物或?qū)＠菍ｉT及單獨(dú)被指定通過引用并入，并且在此通過引用并入以公開并描述與被引用的出版物相關(guān)的方法和/或材料。在發(fā)明日前，任何出版物的引用都是為了其公開，并且不應(yīng)該解釋為承認(rèn)由于在先公開本發(fā)明無權(quán)先于這種出版物。此外，提供的出版日期可能與實(shí)際出版日期不符合，其可能需要被獨(dú)立證實(shí)。通過閱讀本發(fā)明對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將是顯而易見的，此處描述和說明的每個單獨(dú)的實(shí)施例都有分立元件和技術(shù)特征，這些分立元件及技術(shù)特征可以容易地從任何其他多個實(shí)施例的技術(shù)特征分離或與這些技術(shù)特征結(jié)合，而不脫離本發(fā)明的保護(hù)范圍或精神實(shí)質(zhì)。任何列舉的方法都能按照事件順序或邏輯上可能的其它順序執(zhí)行。除另有注明外，本發(fā)明的實(shí)施例將采用醫(yī)藥學(xué)，有機(jī)化學(xué)，生物化學(xué)，分子生物學(xué)， 藥理學(xué)等諸如此類，其在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中得到完整解釋。必須注意，如使用在說明書及從屬權(quán)利要求中，除非上下文另外清楚地規(guī)定，單數(shù)形式“a”，“an”及“the”包含復(fù)數(shù)指稱。因此，例如，標(biāo)記“一個支持物”包含多個支持物。 在本說明書和下面的權(quán)利要求書中，除非有明顯的相反意圖，將制作標(biāo)記為許多術(shù)語，其應(yīng)當(dāng)被限定為具有以下含義。除另有指明外，如此處使用的以下術(shù)語有屬于它們的含義。在本發(fā)明中， “comprises”，“comprising”，“containing”和“having”及諸如此類可以有屬于它們的在美國專利法中的含義，并可意為“includes”，“including”等；當(dāng)適用于本發(fā)明包含的方法及組成時，consisting essentially of，，或“consists essentially，，或其他類似的指像此處公開的那些的組成，但這些組成也許包含額外的結(jié)構(gòu)組分，組分元件或方法步驟(如以上所述的類似物或衍生物)。然而，與那些相應(yīng)組分或此處公開的方法相比較，這些額外結(jié)構(gòu)組分，組分元件或方法步驟等等并不實(shí)質(zhì)影響組分或方法的基本新穎的特征。當(dāng)適用于本發(fā)明包含的方法及組分時，“Consisting essentially of ” 或“consists essentially” 或其它類似的有屬于美國專利法中的含義并且術(shù)語是開放的，允許出現(xiàn)超過列舉的術(shù)語只要列舉的術(shù)語的基本的或新穎的特征不被超過列舉的術(shù)語的出現(xiàn)改變，但排除現(xiàn)有技術(shù)實(shí)施例。在描述多個實(shí)施例前，除另有注明外，以下的定義被提供并且應(yīng)該被使用。定義在描述和要求公開的主題時，將依據(jù)下面提出的定義使用下列術(shù)語。此處所用的術(shù)語“條形碼”是指一個預(yù)定義序列的寡核苷酸，這是與一個特定的目標(biāo)分析物結(jié)合基相關(guān)。 此處所用的術(shù)語“分析物”或“目標(biāo)分析物”是指生物分子，如，但不僅限于，肽，多肽，核酸和檢測樣品中的類似物。分析物可由特定的結(jié)合對成員(sbp)組成，或許是一個配體，這些分析物是單價(單一同位素)，多價(聚合抗原)，更可能是抗原或半抗原，并且是單個化合物或分子或者是多個化合物或生物分子，共同分享至少一個表位或決定簇。分析物可以是細(xì)胞的一部分，如細(xì)菌，植物細(xì)胞，動物細(xì)胞，或者在自然環(huán)境中如組織，被培養(yǎng)的細(xì)胞，微生物，如細(xì)菌，真菌，原生動物或病毒。如果分析物是單一同位素，分析物可被進(jìn)一步修飾，例如化學(xué)上提供一個或多個額外的結(jié)合位點(diǎn)，如，但不限于，染料(如熒光染料)， 多肽修飾基團(tuán)如磷酸基團(tuán)，糖基化基團(tuán)，諸如此類。在實(shí)施本發(fā)明的方法時，目標(biāo)分析物或許至少有兩個結(jié)合位點(diǎn)。多價配體分析物通常是較大的有機(jī)化合物，通常具有聚合物的性質(zhì)，如多肽和蛋白質(zhì)，多糖，核酸，及其復(fù)合物。這些復(fù)合物包括細(xì)菌，病毒，染色體，基因，線粒體，細(xì)胞核，細(xì)胞膜和類似物的組分。大多數(shù)情況下，主體適用的多表位配體分析物將有至少約5，000的分子量，更通常至少約10，000。在聚合物分子分類中，目標(biāo)聚合物通常有約5，000到5，000, 000分子量， 更通常從20，000到1，000，000分子量。在目標(biāo)激素中，分子量范圍從5，000到60，000。單一表位配體分析物通常從100到2，000分子量，更通常從125到1，000分子量。分析物或許是直接從樣品中發(fā)現(xiàn)的分子，如宿主的體液。例如，體液可以是尿液， 血液，血漿，血清，唾液，精液，糞便，痰，腦脊髓液，流淚，粘液等等。樣品可被直接檢測或預(yù)處理使分析物更容易被檢測到。此處使用的“特定結(jié)合對(sbp)成員”術(shù)語指的是兩個不同分子中的一個，它特異結(jié)合另一個分子的特定空間和/或極點(diǎn)，并定義為與另一個分子互補(bǔ)。這些特定的結(jié)合對可指為配體和受體(抗-配體)。雖然其它特定的結(jié)合對，如生物素-抗生物素蛋白，酶-底物，酶-拮抗劑，酶-激動劑，藥物-靶標(biāo)分子，激素-激素受體，核酸雙鏈，IgG-蛋白A/蛋白G，核苷酸對如DNA-DNA，DNA-RNA,蛋白質(zhì)-DNA，脂質(zhì)-DNA，脂質(zhì)-蛋白，脂質(zhì)-多糖，蛋白質(zhì)-多糖，核酸適配體和相關(guān)的目標(biāo)配體(例如，有機(jī)小分子化合物，核酸，蛋白質(zhì)，多肽，病毒，細(xì)胞等)等都不是免疫對但包含在sbp成員發(fā)明及定義內(nèi)，但是通常這些特定的結(jié)合對將是免疫對成員如抗原-抗體。一個特定的結(jié)合對成員可以是完整的分子，或僅僅是分子的一部分，只要成員能特異結(jié)合到目標(biāo)分析物的位點(diǎn)上以形成特異的結(jié)合對。此處使用的“配體”術(shù)語指的是其受體自然存在或可制備的任何有機(jī)化合物。配體術(shù)語也包含配體類似物，即被修飾過的配體，通常是分子量大于100，且能與類似的配體競爭受體的有機(jī)自由基或分析物類似物，這種修飾是將配體類似物加到其它分子上。配體類似物更多是通過氫鍵替換不同于配體，氫鍵將配體類似物連接到一個樞紐或標(biāo)簽上，但不是必需的。配體類似物可類似于配體結(jié)合到受體上。例如，類似物可以是直接抗配體抗體獨(dú)特位點(diǎn)的抗體，。此處使用的“受體”或“抗配體”指的是可識別分子上特定空間及極點(diǎn)的任何化合物或組分，如表位或決定簇。闡述的受體包含自然發(fā)生的受體，如甲狀腺素結(jié)合球蛋白，抗體，酶，F(xiàn)ab片段，凝集素，核酸，核酸適配體，抗生物素蛋白A，barstar，補(bǔ)體Clq等等。此處使用的“特異結(jié)合”術(shù)語指的是通過不能充分識別其它分子的比較，兩個不同分子間的特異識別?？偟膩碚f，分子表面或凹陷處有區(qū)域以產(chǎn)生兩個分子間的特定識別。特異識別的典型例子是抗體-抗原相互作用，酶-底物相互作用，核苷酸相互作用等等。此處使用的的“抗體”術(shù)語指的是免疫球蛋白，它可特異結(jié)合另一個分子的特異空間及極點(diǎn)，從而被定義為與這個分子互補(bǔ)?？贵w可以是單克隆，多克隆或重組抗體，并能通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)制備，如宿主的免疫和血清(多克隆)的收集，或制備雜交細(xì)胞株，克隆免疫球蛋白基因和收集分泌的蛋白(單克隆)，或者克隆和表達(dá)核苷酸序列，基因突變克隆自然抗體特定位點(diǎn)所需的氨基酸序列。抗體或許包括完整的免疫球蛋白或片段，這些免疫球蛋白包括各種亞型，如Iga, IgD, IgE, IgGU IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgY等等。片段或許包括Fab、Fv和F(ab' ). sub. 2,Fab'、scFv等。此外，免疫球蛋白或它們片段的聚合物和共軛物可被使用，且和特定分子的親和力一樣保持適當(dāng)。此處使用的“連接”術(shù)語指的是通過共價鍵將DNA分子結(jié)合的過程。例如，DNA連接產(chǎn)生一個核苷酸的3'羥基和另一個核苷酸的5'磷酸之間的磷酸二酯鍵。連接更要在連接酶存在的4-37°C下實(shí)行。合適的連接酶包括嗜熱連接酶，嗜水生連接酶，大腸桿菌連接酶，jM連接酶及焦連接酶。此處使用的“特異的”，“特異地”，“特異性”指的是兩個分子間的識別，接觸及形成穩(wěn)定的復(fù)合體，形成復(fù)合體后大幅度降低這兩個分子與其它分子識別，接觸及形成穩(wěn)定復(fù)合物的能力。特異結(jié)合的典型例子是抗體-抗原相互作用，分子受體-配體相互作用，聚核苷酸雜交，酶-底物相互作用等。此處使用的涉及復(fù)合物組分的“特異的”術(shù)語指的是特異復(fù)合物與其組分唯一相關(guān)。此處使用的與聚核苷酸相關(guān)的“特異的”術(shù)語指的是單個聚核苷酸與其互補(bǔ)序列唯一相關(guān)。此處使用的作為復(fù)合物或分子組分的“標(biāo)簽”及“標(biāo)簽分子”指的是可用于檢測的分子，包括，但不限于，放射性的同位素，熒光，化學(xué)發(fā)光染料，酶，酶的底物，酶的輔助因子， 酶抑制劑，染料，金屬離子，納米粒子，金屬溶膠，配位體(如生物素，親和，鏈或半抗原)等等?！盁晒狻毙g(shù)語指的是一種在檢測中可發(fā)熒光的物質(zhì)或一部分。作為結(jié)果，此處使用的“標(biāo)簽信號”指的是標(biāo)簽釋放信號以檢測標(biāo)簽，包括，但不限于，熒光，化學(xué)發(fā)光，酶反應(yīng)產(chǎn)生的化合物產(chǎn)物等?！皺z測性標(biāo)記”是指一個片段或寡核苷酸包含一個放射性核苷酸，或熒光分子，或其它能引發(fā)物理或化學(xué)反應(yīng)并能通過肉眼或并不限于，閃爍計(jì)數(shù)器，色度計(jì)，紫外分光光度儀等儀器觀察到的分子類型。此處使用的“l(fā)abel”或“tag”指的是一個附加的分子通過共價鍵或雜交或者其它方式結(jié)合到另一個分子上，如聚核苷酸或聚核苷酸片段或其它分子， 以提供或增強(qiáng)檢測這個分子的手段。當(dāng)在不同波長下，一個熒光或熒光標(biāo)記在特定的波長會發(fā)出可檢測的光。一個放射性標(biāo)簽放出可被儀器檢測到的放射性顆粒，如，并不限于，閃爍計(jì)數(shù)器。其它信號產(chǎn)生檢測方法包括化學(xué)發(fā)光，電化學(xué)發(fā)光，拉曼光譜，色度，雜交保護(hù)檢測，質(zhì)譜。此處使用的“適體”指分離的核酸分子，并高特異及高親和地結(jié)合目標(biāo)物，如蛋白質(zhì)。在特定結(jié)構(gòu)中，適體具有三維結(jié)構(gòu)，提供化學(xué)接觸以高特異地結(jié)合目標(biāo)物。雖然適體是核酸基分子，但是適配和其他核酸分子，如基因和mRNA之間是有根本區(qū)別。在后者，核酸結(jié)構(gòu)通過其線性堿基序列編碼信息，從而此序列對于信息儲存功能至關(guān)重要。完全相反，基于特異結(jié)合目標(biāo)分子的適體功能并不完全依靠保守的線性堿基序列(非編碼序列)，而是特異的二級/三級/四級結(jié)構(gòu)。適體具有的任何編碼潛力是完全偶然的，且在結(jié)合相近目標(biāo)物時不起任何作用。適體必須也與結(jié)合特定蛋白的自然產(chǎn)生的核酸序列不同。這些后來序列是包含在有機(jī)體基因組內(nèi)自然發(fā)生的核酸序列，并結(jié)合到參與轉(zhuǎn)錄，翻譯，運(yùn)輸自然發(fā)生的核酸的蛋白質(zhì)的特異位點(diǎn)上，如核酸-結(jié)合蛋白。在另一方面，適體是短的，獨(dú)立的，非自然發(fā)生的核酸分子。結(jié)合核酸-結(jié)合蛋白的適體可被識別，而在自然界大多數(shù)情況下這些適體只有一點(diǎn)或沒有可被核酸-結(jié)合蛋白識別的序列特性。更重要的是，實(shí)質(zhì)上適體可結(jié)合任何蛋白(不僅僅是核酸-結(jié)合蛋白)，幾乎任何目標(biāo)物，如小分子，碳水化合物，肽段等。對于多數(shù)目標(biāo)物，甚至蛋白來說，不存在其結(jié)合的自然發(fā)生的核酸序列。對于那些確實(shí)有這段序列的目標(biāo)物來說，如核酸-結(jié)合蛋白，與具有強(qiáng)親和力的適體相比，這些序列由于具有相對低親和力而與適體不相同。適體可特異結(jié)合被篩選出來的目標(biāo)物，并調(diào)節(jié)目標(biāo)物的活性或結(jié)合相互作用，如， 通過結(jié)合，適體可阻斷目標(biāo)物的功能活性。這種特異結(jié)合目標(biāo)物的功能特性是適體內(nèi)在的特性。一個典型的適體是6_35kDa大小(20-100個核苷酸)，以微摩爾至子納摩爾親和力結(jié)合目標(biāo)物，可排斥緊密相關(guān)的目標(biāo)物(如，適體可選擇性結(jié)合來自同一個基因家族的相關(guān)蛋白)。適體能夠利用常見的分子間的相互作用，如氫鍵，靜電的互補(bǔ)性，疏水性接觸，立體排斥以結(jié)合一個特異的目標(biāo)物。適體具有許多可用于治療與診斷的特性，如高特異性和高親和力，低免疫原性，生物有效性，以及優(yōu)良的藥代動力學(xué)性質(zhì)?！癉NA”指的是以單鏈或雙鏈螺旋形式存在的脫氧核苷酸聚合形式(腺嘌呤，鳥嘌呤，胸腺嘧啶，胞嘧啶)。這個術(shù)語僅僅指的是分子的一級和二級結(jié)構(gòu)，且不限于任何特異三級結(jié)構(gòu)。因此，這個術(shù)語包括發(fā)現(xiàn)于線性DNA分子(如限制性片段)，病毒，質(zhì)粒和染色體的除其他外的雙鏈DNA。在討論特異雙鏈DNA分子的結(jié)構(gòu)中，此處描述的序列順序是按照正常慣例僅僅從非轉(zhuǎn)錄DNA鏈(即序列同源的mRNA鏈)的5'端開始至3'端方向。此處使用的“寡核苷酸”和“聚核苷酸”術(shù)語一般指的是任何聚核糖核酸或聚脫氧核糖核酸，這些聚核糖核酸或聚脫氧核糖核酸可能是不被修飾的RNA或DNA，或者被修飾的 RNA或DNA。因此，例如，此處使用的聚核苷酸指的是單鏈及雙鏈DNA，具有單鏈和雙鏈區(qū)域的DNA，單鏈及雙鏈RNA，具有單鏈和雙鏈區(qū)域的RNA，可能是單鏈，或是更典型的雙鏈，或是具有單鏈和雙鏈區(qū)域的DNA和RNA雜交分子。按上述定義，“核酸”，“核酸序列”，或“寡核苷酸”術(shù)語也包括聚核苷酸。典型上，適體是單鏈的。此處使用的“糖基化位點(diǎn)”術(shù)語指的是多肽上的一個位點(diǎn)，可被多肽上糖基鏈附著的位點(diǎn)。這個“位點(diǎn)”或許是一個氨基酸側(cè)鏈，或多個側(cè)鏈(或者是序列上相鄰的連續(xù)氨基酸形成的與至少一條糖基鏈有關(guān)的特異位點(diǎn)。)此處使用的“雜交”術(shù)語指的是兩條核酸鏈的結(jié)合過程，并通過兩條核酸鏈的殘基間氫鍵形成反平行雙鏈。在聚核苷酸方面，“雜交”和“結(jié)合”被互換使用。此處使用的“特異地雜交”，“特異的雜交”和“選擇性雜交”指的是在嚴(yán)格條件下，一個核酸分子優(yōu)先結(jié)合，雙聯(lián)，雜交到一個特異核苷酸序列上。從說明書或權(quán)利要求書的目的來說，“互補(bǔ)性”或“互補(bǔ)”術(shù)語是指足夠數(shù)量的互補(bǔ)堿基對核苷酸與目標(biāo)核酸序列特異結(jié)合以擴(kuò)增或檢測。如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，雜交的高特異性及高靈敏度需要一個高程度的互補(bǔ)，即使不需要100%。因此，例如，在核苷酸序列上與此處揭示的寡核苷酸相同的寡核苷酸，除了個別堿基突變或替換，其功能與揭示的寡核苷酸功能相同。一個“互補(bǔ)DNA”或“CDNA”基因包括信使RNA( “mRNA”)反轉(zhuǎn)錄合成的重組基因。“循環(huán)聚合酶介導(dǎo)的反應(yīng)”指的是一個生物化學(xué)反應(yīng)。在這個反應(yīng)里，一個模板分子或多個模板分子定期反復(fù)地被復(fù)制以產(chǎn)生一個或多個互補(bǔ)模板分子，從而隨著時間推移逐漸增加模板數(shù)量。此處使用的“DNA擴(kuò)增”指的是通過酶解擴(kuò)增核酸序列增加特異DNA序列數(shù)量的任何過程。很多過程是為人所熟知的。最為常用的是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，其將會在以下部分被定義及描述。穆利斯聚合酶鏈反應(yīng)過程闡述于美國，專利號為4683195和4683202。PCR 需要耐熱DNA聚合酶，已知序列的引物，循環(huán)加熱，以分離復(fù)制中的脫氧核糖核酸(DNA)，鏈及成指數(shù)擴(kuò)增目的基因。任何PCR類型，如定量PCR，RT-PCR,熱啟動PCR，LAPCR，多重PCR， 降落PCR等或許被使用。有利地，實(shí)時PCR被使用。總的來說，PCR擴(kuò)增過程涉及制備特定核酸序列指數(shù)數(shù)量的酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。它需要少量序列以啟動鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和雜交于序列的寡核苷酸引物。在PCR中，引物退火，核酸變性，并通過誘導(dǎo)劑(酶)和核苷酸延伸，產(chǎn)生新合成的擴(kuò)增產(chǎn)物。由于這些新合成的序列成為引物的模板，變性，引物退火及延伸的不斷循環(huán)導(dǎo)致被擴(kuò)增的特異序列成指數(shù)增加。鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物將會是端點(diǎn)與特異引物端點(diǎn)相對應(yīng)的分散性核酸雙鏈。對于說明書或權(quán)利要求書的目的來說，“酶解擴(kuò)增”或“擴(kuò)增”是指DNA擴(kuò)增，即一個核酸序列成數(shù)量級擴(kuò)增的過程?，F(xiàn)有幾種酶解擴(kuò)增核酸序列的方法。當(dāng)前，最為常用的方法是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。其它的擴(kuò)增方法包括LCR (連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))，這個過程需要DNA連接酶，包含與待擴(kuò)增DNA互補(bǔ)的DNA片段的探針，QB復(fù)制酶，核糖核酸(RNA)序列模板，其中這個模板結(jié)合與用于制備互補(bǔ)RNA指數(shù)產(chǎn)物的DNA模板互補(bǔ)的探針；鏈置換擴(kuò)增 (SDA) ;Q@復(fù)制酶擴(kuò)增(Q3RA);持續(xù)自我復(fù)制(3SR);核酸序列擴(kuò)增(NASBA)，這些方法可用于RNA或DNA擴(kuò)增核酸序列。“固定于固體支持物”是指一個片段，引物或寡核苷酸結(jié)合到基質(zhì)的特定位置上。 并且，在這種方式中，包含被固定的片段，引物或寡核苷酸的體系也許需要洗滌或其它物理或化學(xué)處理，但這些序列并不會從支持物上脫落。在藝術(shù)上，很多用于固定包含核苷酸的分子的固體支持物和手段對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的。任何這些支持物和手段也許在這個發(fā)明的方法中被使用。一個“引物”是一個寡核苷酸，其至少一部分序列是與待擴(kuò)增或待復(fù)制的DNA模板的一部分序列互補(bǔ)。典型上，引物用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。引物與DNA模板雜交(或 “退火”)，并通過聚合酶作為復(fù)制/擴(kuò)增過程的起始點(diǎn)?！盎パa(bǔ)”是指引物與模板能形成穩(wěn)定的氫鍵復(fù)合體，即引物可通過至少10個連續(xù)堿基對的形成雜交或退火到模板上。此處被篩選出的模板可與特異目標(biāo)DNA的不同鏈大幅度互補(bǔ)。這意味著引物必須足夠互補(bǔ)地與它們對應(yīng)的鏈雜交。例如，一個非互補(bǔ)核苷酸片段也許結(jié)合到引物5’端，余下與模板互補(bǔ)的引物序列。另外，非互補(bǔ)的堿基或更長序列可插入引物內(nèi)，使得引物序列有足夠的互補(bǔ)性，從而形成模板以合成擴(kuò)增產(chǎn)物。描述本發(fā)明為樣品中的目標(biāo)分析物提供了檢測方法。該方法至少利用了分析物上的兩個不同位點(diǎn)，或兩個相鄰但接觸的分子的兩個位點(diǎn)配對。這些不同位點(diǎn)或許，但不是必須的，歸功于目標(biāo)分析物分析的結(jié)構(gòu)。例如，一個可檢測位點(diǎn)或許是一個肽段序列的一個或多個氨基酸的結(jié)合。這些氨基酸在序列上或許相鄰，或許由于多肽的三維結(jié)構(gòu)彼此相近。它也被猜想至少一個可檢測位點(diǎn)通過更大分子修飾而形成。例如，小分子，如，但不限于，磷酸基團(tuán)，糖基化基團(tuán)等或許結(jié)合到目標(biāo)分析物上以形成可被特異探針識別并結(jié)合的結(jié)構(gòu)。這種小分子可以是標(biāo)簽，如，但不限于，可被探針識別的染料或地高辛。如圖3所示，如通過酶反應(yīng)，小分子標(biāo)簽可結(jié)合到潛在分析物上。例如，但不限于，通過激酶，磷酸基團(tuán)可結(jié)合到目標(biāo)分析物上，如圖4所示。此處揭示的這些方法中的探針每個都包含一個可識別和特異結(jié)合目標(biāo)分析物位點(diǎn)的基團(tuán)。這個基團(tuán)被連接到更可能含有三個區(qū)域的寡核苷酸上。第一個區(qū)域，接近分析物結(jié)合基團(tuán)，是一段足夠長的，作為寡核苷酸擴(kuò)增引物唯一互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)的核苷酸序列。第二個相鄰區(qū)域是編碼條形碼的，唯一與探針的分析物結(jié)合基有關(guān)的核苷酸序列。例如，在文獻(xiàn) Xu et al.，(2009) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 :2289-2294 中描述條形碼寡核苷酸的合成，在此通過引用整體上并入本文中。寡核苷酸尾巴的第三個區(qū)域是與連接器寡核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。通過本發(fā)明的這些方法檢測分析物需要第一探針和第二探針，每個探針特異地識別目標(biāo)分析物的位點(diǎn)。在第一探針中，寡核苷酸尾巴通過寡核苷酸5’端被連接到分析物結(jié)合基上。在第二探針中，寡核苷酸尾巴通過寡核苷酸3’端被連接到分析物結(jié)合基上。目標(biāo)分析物結(jié)合基或許是可特異識別并結(jié)合分析物一個位點(diǎn)的任何分子。據(jù)猜想，一個結(jié)合基或許是，但不限于，一個保留分析物結(jié)合活性的片段的抗體(IgA，IgE, IgG 或IgM)。目標(biāo)物-特異適體，小配體分子，或可特異結(jié)合分析物區(qū)域的受體蛋白也可以是合適的結(jié)合基。而且，已知在自然條件下與目標(biāo)多肽分析物形成復(fù)合物的多肽也許作為探針的分析物-特異基團(tuán)使用。因此，本發(fā)明的這些方法的起始步驟要求懷疑含有目標(biāo)分析物的樣品至少被摻入上面所提的第一和第二探針，且這些探針能結(jié)合到目標(biāo)分析物的相應(yīng)位點(diǎn)上。通過這樣，它們的寡核苷酸尾巴更加接近。然后，樣品在有利于寡核苷酸退火條件下與高摩爾濃度的連接器寡核苷酸孵育，這個連接器寡核苷酸的一個區(qū)域補(bǔ)充第一探針的寡核苷酸尾巴的自由端，連接器的余下序列補(bǔ)充第二探針的尾巴的自由端。因此，如圖I所示，一個尾巴的末端堿基是與另一個尾巴相鄰，并被定位以通過連接反應(yīng)將一個尾巴連接到另一個尾巴上。隨著兩個寡核苷酸尾巴連接，來自分析物結(jié)合基的整個結(jié)構(gòu)延伸可通過熟知方法和利用引物補(bǔ)充與兩個分析物結(jié)合基相鄰的尾巴區(qū)域的手段擴(kuò)增。然后，PCR產(chǎn)物可被雜交到寡核苷酸芯片上，其中每個陣列點(diǎn)包含一個目標(biāo)寡核苷酸，這個寡核苷酸具有兩個條形碼序列，其中一個條形碼與第一探針條形碼互補(bǔ)，另一個條形碼與第二探針條形碼互補(bǔ)。在雜交發(fā)生的地方，如圖Figs. 1-5所示，補(bǔ)充連接器寡核苷酸的尾巴區(qū)域現(xiàn)形成單鏈環(huán)結(jié)構(gòu)，但沒有自由端。在另一方面，在PCR產(chǎn)物有條形碼區(qū)域時，只有其中一個區(qū)域結(jié)合到特異陣列位點(diǎn)上，PCR產(chǎn)物多余部分將會是具有自由端的單鏈序列。芯片分析的特異性要求這個方法的下一步，這個步驟是用特異單鏈的核酸外切酶處理芯片(這個核酸外切酶活性不會切割PCR產(chǎn)物的兩個條形碼區(qū)域結(jié)合到芯片位點(diǎn)上時形成的環(huán)形結(jié)構(gòu))。因此，核酸外切酶活性是除去未結(jié)合的條形碼區(qū)域及相鄰的連接器特異區(qū)域。隨著核酸酶反應(yīng)，在PCR反應(yīng)產(chǎn)物的兩個條形碼區(qū)域與單個芯片靶點(diǎn)雜交處，只有與芯片相關(guān)的單鏈核苷酸區(qū)域形成環(huán)形。然后，環(huán)形單鏈與芯片雜交，接著用被標(biāo)記的，補(bǔ)充連接器部分序列的寡核苷酸探針檢測。最后，檢測探針上的標(biāo)簽以達(dá)到檢測目標(biāo)分析物的目的。
因此，這個發(fā)現(xiàn)的方法提供了鄰位連接反應(yīng)產(chǎn)物的芯片法檢測手段。添加單鏈核酸酶切割步驟可使兩個探針結(jié)合到相同分析物上，然后再結(jié)合到含使兩個條形碼特異結(jié)合的寡核苷酸的芯片位點(diǎn)上，消除假陽性結(jié)果，保證檢測的特異性。據(jù)猜測，本發(fā)明的方法對多種分析類型均可用。例如，但不限于，這些檢測的體現(xiàn)包括(a)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用第一探針特異地識別及結(jié)合第一個多肽位點(diǎn)，第二探針特異地識別及結(jié)合第二個多肽的位點(diǎn)。起始的鄰位連接反應(yīng)只有在第一個和第二個多肽形成復(fù)合物時才會發(fā)生。通過使用一個特異于第一個目標(biāo)多肽的第一探針和多個特異于多個多肽的第二探針，使檢測和鑒別與第一個多肽形成復(fù)合物的多肽成為可能。此外，多個第一與第二探針一起可用于鑒別多個能與其它成員形成復(fù)合物的多肽或肽段。(b)蛋白質(zhì)表達(dá)使用發(fā)現(xiàn)的方法可鑒別來自多肽混合物的單個目標(biāo)分析物多肽，在這里第一探針及第二探針可獨(dú)立識別并結(jié)合到相同蛋白質(zhì)的位點(diǎn)上。(C)蛋白質(zhì)修飾來自多個未經(jīng)修飾多肽中的一個被修飾多肽可被發(fā)現(xiàn)的方法鑒別，在這里第一探針特異地識別目標(biāo)多肽分析物的位點(diǎn)，第二探針可特異地識別并結(jié)合連接多肽的修飾基團(tuán)。據(jù)猜測，修飾基團(tuán)可以是，如，但不限于，磷酸基團(tuán)，糖基化基團(tuán)，修飾后的氨基酸或多肽內(nèi)的突變位點(diǎn)。(d)核酸-多肽相互作用本發(fā)明的方法可以鑒別核酸，DNA或RNA，可識別并結(jié)合目標(biāo)多肽。在這些方法中，第一探針也許識別并結(jié)合目標(biāo)多肽的一個位點(diǎn)，且第二探針的結(jié)合基是被懷疑結(jié)合多肽的寡核苷酸。(e)蛋白質(zhì)-小分子相互作用本發(fā)明的方法也許鑒別可識別并結(jié)合目標(biāo)多肽的小分子。在這些方法中，第一探針也許識別并結(jié)合目標(biāo)多肽的一個位點(diǎn)，第二探針可特異識別并結(jié)合被懷疑結(jié)合多肽的配體小分子。因此，本發(fā)明的一方面包括檢測目標(biāo)分析物的方法的實(shí)施例，包括步驟(i)獲得懷疑含有目標(biāo)分析物的樣品；(ii)將樣品與第一和第二探針結(jié)合，且第一和第二探針分別含有一個可特異結(jié)合目標(biāo)分析物或標(biāo)簽的結(jié)合基，及一個寡核苷酸尾巴。所說的寡核苷酸尾巴包含一個與目標(biāo)分析物結(jié)合基相鄰的PCR啟動子，一個僅僅與目標(biāo)分析物結(jié)合基有關(guān)的條形碼區(qū)域，一個與連接器寡核苷酸區(qū)域互補(bǔ)的連接器-雜交區(qū)域，且連接器-雜交區(qū)域遠(yuǎn)離目標(biāo)分析物結(jié)合基，從而在樣品中捕獲目標(biāo)分析物；(iii)雜交連接器寡核苷酸到第一和第二探針的連接器-雜交區(qū)域上；(iv)連接第一探針的連接器-雜交區(qū)域到第二探針的連接器-雜交區(qū)域，從而將第一和第二探針的寡核苷酸尾巴連接；(V)擴(kuò)增第一 PCR啟動子區(qū)域之間的寡核苷酸尾巴區(qū)域；(vi)用基質(zhì)固定的寡核苷酸雜交擴(kuò)增產(chǎn)物，且基質(zhì)固定的寡核苷酸包含一個互補(bǔ)于僅與第一探針目標(biāo)分析物結(jié)合基有關(guān)的條形碼區(qū)域的第一區(qū)域，及一個互補(bǔ)于僅與第二探針目標(biāo)分析物結(jié)合基有關(guān)的條形碼區(qū)域的第二區(qū)域。(vii)將步驟(V)產(chǎn)物和可特異切割單鏈DNA分子或區(qū)域的核酸酶連接，且此單鏈DNA有一個非堿基配對的3’端或一個5’端；(viii)將信號寡核苷酸與步驟(vi)產(chǎn)物雜交，這個信號寡核苷酸包含一個互補(bǔ)于第一，第二探針連接器-雜交區(qū)域，或是第一及第二探針連接器-雜交區(qū)域結(jié)合體的核苷酸序列，且包含一個標(biāo)簽；(ix)檢測標(biāo)簽；從而檢測樣品中分析物的存在。在本發(fā)明的這方面的實(shí)施例中，目標(biāo)分析物是從肽段，多肽，蛋白質(zhì)或修飾物中篩選出來的。在本發(fā)明的這方面的實(shí)施例中，第一探針的結(jié)合基或許是從抗體，抗體片段，適體，肽段，多肽，生物受體，及可結(jié)合生物分子的配體中篩選出來的。在本發(fā)明的這方面的實(shí)施例中，第二探針的結(jié)合基或許是從抗體，抗體片段，適體，肽，多肽，生物受體，及可結(jié)合生物分子的配體中篩選的。在本發(fā)明的這方面的實(shí)施例中，樣品或許與標(biāo)簽連接，從而連接一個標(biāo)簽到目標(biāo)分析物上，且第一探針的結(jié)合基特異地結(jié)合目標(biāo)分析物的一個位點(diǎn)，及第二探針的結(jié)合基特異地結(jié)合一個標(biāo)簽。在本發(fā)明的這方面的實(shí)施例中，標(biāo)簽或許是從染料，熒光染料及地高辛中篩選出來的。在本發(fā)明的這方面的實(shí)施例中，第二探針的結(jié)合基可特異地結(jié)合多肽的修飾位點(diǎn)。在本發(fā)明的這方面的實(shí)施例中，多肽的修飾位點(diǎn)是從磷酸化位點(diǎn)，糖基化位點(diǎn)，及多肽氨基酸序列的突變位點(diǎn)中篩選出來的。在本發(fā)明的這方面的實(shí)施例中，目標(biāo)分析物可以是至少兩個多肽的結(jié)合體，其中第一探針的結(jié)合基特異地結(jié)合第一個多肽區(qū)域，第二探針的結(jié)合基特異地結(jié)合第二個多肽區(qū)域，及在步驟(iii)中當(dāng)?shù)谝粋€多肽與第二個多肽混合在一起時，一個連接器寡核苷酸與第一及第二探針的連接器-雜交區(qū)域雜交。在本發(fā)明的這方面的實(shí)施例中，可特異地切割單鏈DNA分子或區(qū)域的核酸酶可從 Rec J，核酸外切酶II，小腿脾磷酸二酯酶，核酸外切酶I (磷酸)，蛇毒磷酸和核酸外切酶 VII篩選出來。本發(fā)明的另一方面包括用于檢測目標(biāo)分析物的系統(tǒng)，包括第一探針及第二探針， 其中第一探針和第二探針各自包含一個可特異結(jié)合目標(biāo)分析物或標(biāo)簽的結(jié)合基，及一個寡核苷酸尾巴。所述的寡核苷酸尾巴包含一個鄰近目標(biāo)分析物結(jié)合基的第一 PCR啟動子，一個僅與目標(biāo)分析物結(jié)合基有關(guān)的條形碼區(qū)域，一個遠(yuǎn)離目標(biāo)分析物結(jié)合基的連接器-雜交區(qū)域；和一個微陣列，其中這個陣列至少包含一個互補(bǔ)于第一及第二探針條形碼區(qū)域的寡核苷酸。在本發(fā)明的這方面的實(shí)施例中，第一探針的結(jié)合基可連接到寡核苷酸尾巴的5’端上，及第二探針的結(jié)合基連接到寡核苷酸尾巴的3’端上。在本發(fā)明的這方面的實(shí)施例中，這個體系可以進(jìn)一步包含一個互補(bǔ)于第一探針 PCR啟動子區(qū)域的寡核苷酸及一個互補(bǔ)于第二探針PCR啟動子區(qū)域的寡核苷酸。然而，本發(fā)明的另一個方面包括探針，這些探針包含一個可特異結(jié)合目標(biāo)分析物或其上的標(biāo)簽的結(jié)合基，及一個寡核苷酸尾巴。所述的寡核苷酸尾巴包含一個鄰近目標(biāo)分析物結(jié)合基的PCR啟動子區(qū)域，一個唯一與目標(biāo)分析物結(jié)合基有關(guān)的條形碼區(qū)域，一個連接器-雜交區(qū)域，其中連接器-雜交區(qū)域遠(yuǎn)離于目標(biāo)分析物結(jié)合基，并且其中所述探針被配置為用在根據(jù)本發(fā)明的方法和系統(tǒng)中。以下具體例子只是作為說明解釋，并不是以任何方式限制本發(fā)明的其余部分。沒有進(jìn)一步說明，相信在此處描述的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以最大限度地利用本發(fā)明。在此引用的所有出版物被全部通過引用由此被并入。
應(yīng)該強(qiáng)調(diào)，本發(fā)明的實(shí)施例，尤其任何“較優(yōu)的”的實(shí)施例，只是可能的實(shí)施方式的例子，只是為清楚理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)提出的。也可以對本發(fā)明的上述實(shí)施例做出許多變化和修改，而不實(shí)質(zhì)上偏離本發(fā)明的精神和實(shí)質(zhì)。所有這些修改及變化在此意在包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)，并且本發(fā)明由下面的權(quán)利要求保護(hù)。提出以下的例子以便提供給本領(lǐng)域普通技術(shù)人員如何執(zhí)行方法及使用此處公開和要求的成分和化合物的完全的公開和說明。已做出努力以確保數(shù)字的準(zhǔn)確性(如數(shù)量， 溫度等)，但一些錯誤及偏離應(yīng)該被計(jì)入。除非另有說明，部分是按重量計(jì)算的組成部分，溫度是以。C為單位，壓力是或接近大氣壓。標(biāo)準(zhǔn)的溫度和壓力被定義為20°C和一個大氣壓。應(yīng)該注意到，此處的比率、濃度、數(shù)量、及其它數(shù)值數(shù)據(jù)可以用范圍的格式表達(dá)。使用這樣的范圍格式是為了簡潔及方便，這是可以理解的。因此，這樣的范圍格式應(yīng)以靈活方式解釋為不僅包括明確引用作為范圍限制的數(shù)值，也包括所有獨(dú)立的數(shù)值或包括在此范圍內(nèi)的子范圍，仿佛每個數(shù)值和子范圍都被明確地引用。為了說明，“約0. 1%至約5%”的濃度范圍應(yīng)被解釋為不僅包括被明確引用的約0. 1 〖％至約5 〖％濃度，也包括獨(dú)立濃度(如 1%,2%,3%,4% )及指定范圍內(nèi)的子范圍(如0. 5%、1. 1%、2. 2%,3. 3%,4. 4% ) 術(shù)語 “約”可包括 ±1*%、±2*%、±3*%、±4*%、±5*%、±6*%、±7*%、±8*%、±9%或 ±10%,或者更多被修改的數(shù)值。例子例子I抗體和寡核苷酸的鏈接配對的抗體識別同一個蛋白的不同位點(diǎn)，并可通過良好的記錄免疫分析鑒別。 cDNA連接抗體可通過巰基-cDNA與磺酸基-GMBS處理的抗體的簡單連接而產(chǎn)生?？贵w結(jié)合抗原的能力將通過ELISA法測定。方法使用來自Solulink Conjugation公司的試劑盒。SoluLink蛋白-寡核苷酸共軛試劑盒采用了生物耦合的方法，以三個步驟制備蛋白質(zhì)-寡核苷酸連接物(i)使用 S-HyNic交聯(lián)劑(琥珀6-肼基煙丙酮腙)的抗體蛋白修飾；(ii)使用4FB的寡核苷酸修飾；(iii)兩個修飾過的生物分子的連接。(a)抗體的脫鹽/緩沖液交換抗體必須完全脫鹽進(jìn)入修飾緩沖液內(nèi) (IOOmMphosphate,150mM NaCl,pH 7.4)。(b)通過操作指示用S-HyNic修飾抗體。(c)將 HyNic 修飾的 IgG 脫鹽到共輒緩沖液中(IOOmM phosphate, 150mM NaCl,pH
6.0)。(d)使用5K MWCO VivaSpin滲濾器將寡核苷酸脫鹽到無核酸酶水中。(e)通過操作指示用4FB修飾氨基酸寡核苷酸。(f)用4FB修飾的寡核苷酸混合HyNic修飾的蛋白質(zhì)(2個相同的寡核苷酸/共軛寡核苷酸)。(g)加入1/10體積10倍的TutboLink催化劑緩沖液到共軛溶液中。(h)室溫孵育混合物2小時(通過消除等分及凝膠電泳分析，或者通過用 NanoDrop分光光度計(jì)檢測A354處形成的有色共軛鍵的吸光度，共軛反應(yīng)可“視化”)。(i)用柱子將共軛脫鹽。
可選方法I (自組裝策略)
(a)鏈霉親和素和生物素標(biāo)記的寡核苷酸形成的鏈霉親和素-寡核苷酸。
(b)通過被納入此文參考文獻(xiàn)中的Darmanis et al. , (2007)BioTechniques43 443-450方法，用鏈霉親和素-寡核苷酸將生物素-抗體連接到自組裝鄰位探針上。
可選方法2
(a)用磺酸基-GMBS連接抗體。
(b)用超過PD-10色譜柱去除未處理的磺酸基-GMBS。
(c)磺酸基-GMBS-被激活的抗體與5’巰醇DNA連接在一起。
(d)使用Superdex-200陰離子交換層析純化連接DNA的抗體。
例子2
通過配對抗體與DNA連接捕獲目標(biāo)分子
(i)用緩沖液A稀釋測試樣品。
(ii)使用0. 2ml厚度PCR管。例如50L，加入
IL測試樣品(在緩沖液A中)
5L 20pM配對的寡核苷酸DNA鏈接的抗體對(在緩沖液B中)
45L混合物(在0. 5ml管內(nèi)預(yù)先混合，如下)
Ix緩沖液C
0. 4單位T4DNA連接酶
400nM連接器寡核苷酸
0. 2mM dNTPs
0. 5M正向引物
0. 5M反向引物
I. 5單位Taq DNA聚合酶
(iii)將管子放置在PCR基因擴(kuò)增儀上。
&)25°〇孵育5分鐘，以致
(a)配對抗體特異捕捉目標(biāo)分子
(b)寡核苷酸和連接器與連接抗體的寡核苷酸的鄰位5’和3’端退火
(c)T4DNA連接這兩端
例子3
PCR擴(kuò)增
步驟I.初始變性95°C，5分鐘
步驟2.變性95°C，5秒
步驟3.退火55°C，20秒
步驟4.延伸:72。。，45秒
重復(fù)步驟2-435次
步驟5.最后延伸72°C，3分鐘
例子4
PCR產(chǎn)物與陣列化的條形碼寡核苷酸雜交
(i)在PCR基因擴(kuò)增儀上95°C加熱PCR產(chǎn)物5分鐘以使PCR產(chǎn)物雙鏈DNA變性成為單鏈DNA。
(ii)立即冰上冷卻管子3分鐘。
(iii)離心管子數(shù)秒。
(iv)用100L I倍DNA雜交緩沖液42°C預(yù)雜交芯片20分鐘。
(V)去除I倍DNA雜交緩沖液。
(vi)用I倍DNA雜交緩沖液稀釋PCR變性產(chǎn)物到100L，并加到芯片上。
(vii)在密閉濕槽內(nèi)42°C孵育I小時。
(viii)用I倍洗滌液(1XSSC，0. 1% SDS)洗滌3次。
(ix)用I倍核酸外切酶反應(yīng)緩沖液洗滌I次。
例子5
自由的單鏈DNA裂解
(i)加入50L I倍核酸外切酶反應(yīng)緩沖液。
(ii)加入，如核酸外切酶VII。(表I核酸外切酶篩選)
表I.鄰位連接反應(yīng)潛在的單鏈DNA核酸外切酶
權(quán)利要求
1.一種檢測目標(biāo)分析物的方法，包括(i)獲取懷疑包含一個目標(biāo)分析物的樣品；( )用第一探針和第二探針連接樣品，其中第一探針和第二探針單獨(dú)包含一個可特異結(jié)合目標(biāo)分析物或標(biāo)簽的結(jié)合基，及一個寡核苷酸尾巴。所述的寡核苷酸尾巴包含一個相鄰目標(biāo)分析物結(jié)合基的PCR啟動子區(qū)域，一個僅與目標(biāo)分析物結(jié)合基有關(guān)的條形碼區(qū)域， 及一個互補(bǔ)于連接器寡核苷酸的連接器-雜交區(qū)域，其中這個連接器-雜交區(qū)域遠(yuǎn)離于目標(biāo)分析物結(jié)合基，從而捕捉樣品中的目標(biāo)分析物；(iii)將連接器寡核苷酸雜交到所述第一探針及第二探針的連接器-雜交區(qū)域上；(iv)將第一探針的連接器-雜交區(qū)域連接到所述第二探針的連接器-雜交區(qū)域上，從而連接所述第一探針及第二探針的寡核苷酸尾巴；(ν)擴(kuò)增第一 PCR啟動子區(qū)域間連接的所述寡核苷酸尾巴區(qū)域；(vi)用基質(zhì)固定的寡核苷酸雜交擴(kuò)增產(chǎn)物，其中基質(zhì)固定的寡核苷酸包含一個互補(bǔ)于僅與第一探針目標(biāo)分析物結(jié)合基有關(guān)的條形碼的第一區(qū)域，及一個互補(bǔ)于僅與第二探針目標(biāo)分析物結(jié)合基有關(guān)的條形碼的第二區(qū)域；(vii)將步驟(ν)產(chǎn)物與可特異切割單鏈DNA分子或區(qū)域的核酸酶連接，其中單鏈DNA 有一個非堿基對3’端或一個5’端；(viii)將信號寡核苷酸雜交到步驟(vi)產(chǎn)物上，其中信號寡核苷酸包含一個核苷酸序列，這個核苷酸序列互補(bǔ)于第一探針，第二探針連接器-雜交區(qū)域的一個核苷酸序列，或者互補(bǔ)于第一探針及第二探針連接器-雜交區(qū)域的結(jié)合體，甚至包含一個標(biāo)簽；(ix)檢測標(biāo)簽；從而檢測樣品中分析物的存在。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述目標(biāo)分析物是從肽段，多肽，蛋白質(zhì)或被修飾物中篩選出來的。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中每個第一探針和第二探針的結(jié)合基是從抗體，抗體片段，適體，肽段，多肽，生物受體及可結(jié)合生物分子的配體中篩選出來的。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中樣品與標(biāo)簽結(jié)合，從而連接一個標(biāo)簽到目標(biāo)分析物上，并且其中第一探針的結(jié)合基特異地結(jié)合目標(biāo)分析物的一個位點(diǎn)，及第二探針的結(jié)合基特異地結(jié)合標(biāo)簽。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中標(biāo)簽是從染料，熒光染料及地高辛中篩選出來的。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中第二探針的結(jié)合基特異地結(jié)合多肽的一個修飾位點(diǎn)ο
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中多肽的修飾位點(diǎn)是從磷酸位點(diǎn)，糖基位點(diǎn)及多肽氨基酸序列的突變位點(diǎn)中篩選出來的。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中目標(biāo)分析物是至少兩個多肽的結(jié)合體，并且其中第一探針的結(jié)合基特異地結(jié)合第一個多肽的一個區(qū)域，第二探針的結(jié)合基特異地結(jié)合第二個多肽的一個區(qū)域，并且其中在步驟(iii)中當(dāng)?shù)谝粋€多肽和第二多肽混合在一起時，連接器寡核苷酸與第一探針，第二探針的連接器-雜交區(qū)域雜交。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其中可特異切割單鏈DNA分子或區(qū)域的核酸酶是從Rec J，核酸外切酶II，小牛脾磷酸二酯酶，核酸外切酶(磷酸)，蛇毒磷酸和核酸外切酶VII中篩選出來的。
10.一種用于檢測目標(biāo)分析物的系統(tǒng)包括第一探針和第二探針，其中每個第一探針和第二探針獨(dú)立包含一個可特異結(jié)合為目標(biāo)分析物或在其上的標(biāo)簽的結(jié)合基，及一個寡核苷酸尾巴。所述的寡核苷酸尾巴包含一個相鄰目標(biāo)分析物結(jié)合基的第一 PCR啟動子區(qū)域，一個僅與目標(biāo)分析物結(jié)合基有關(guān)的條形碼區(qū)域，及一個遠(yuǎn)離于目標(biāo)分析物結(jié)合基的連接器-雜交區(qū)域；和一個微陣列，其中所述陣列至少包含一個互補(bǔ)于第一探針及第二探針條形碼區(qū)域的寡核苷酸。
11.如權(quán)利要求10所述的系統(tǒng)，其中第一探針的結(jié)合基結(jié)合寡核苷酸尾巴的5’端，并且其中第二探針的結(jié)合基結(jié)合寡核苷酸尾巴的3’端.
12.如權(quán)利要求10所述的體系，進(jìn)一步包含一個互補(bǔ)于第一探針PCR啟動子區(qū)域的寡核苷酸，及一個互補(bǔ)于第二探針PCR啟動子區(qū)域的寡核苷酸。
13.一種探針，包含一個可特異結(jié)合目標(biāo)分析物或標(biāo)簽的結(jié)合基，及一個寡核苷酸尾巴；所述的寡核苷酸尾巴包含一個相鄰目標(biāo)分析物結(jié)合基的第一 PCR啟動子區(qū)域，一個僅與目標(biāo)分析物結(jié)合基有關(guān)的條形碼區(qū)域，及一個連接器-雜交區(qū)域，其中所述連接器-雜交區(qū)域遠(yuǎn)離于目標(biāo)分析物結(jié)合基，并且其中所述探針被配置為使用在根據(jù)權(quán)利要求1的所述方法中。
全文摘要
本發(fā)明的實(shí)施方式包括檢測樣品中目標(biāo)分析物的方法，系統(tǒng)及探針。此方法利用對同一個分析物分子中的至少兩個不同位點(diǎn)檢測，或者兩個相鄰和接觸分子的兩個不同位點(diǎn)配對。這些不同位點(diǎn)是一單個分子不可缺少的一部分，或者由于多肽三維結(jié)構(gòu)而彼此相近。通過一個更大分子修飾可形成至少一個可檢測位點(diǎn)。檢測一個目標(biāo)分析物的方法包括將樣品與一對探針結(jié)合，每個探針包含一個可特異結(jié)合目標(biāo)分析物或標(biāo)簽的結(jié)合基，及一個寡核苷酸尾巴。這個寡核苷酸尾巴包含一個接近目標(biāo)分析物結(jié)合基的PCR啟動子區(qū)域，一個唯一與目標(biāo)分析物結(jié)合基有關(guān)的條形碼區(qū)域，一個互補(bǔ)于連接器寡核苷酸一個區(qū)域的連接器-雜交區(qū)域；將連接器寡核苷酸與探針上的連接器-雜交區(qū)域雜交，連接探針間的連接器-雜交區(qū)域；PCR擴(kuò)增已連接的寡核苷酸尾巴；用基質(zhì)固定的與探針條形碼互補(bǔ)的寡核苷酸雜交擴(kuò)增產(chǎn)物；消化任何DNA單鏈分子；用一個信號寡核苷酸雜交前一步驟的產(chǎn)物；檢測信號，從而檢測出樣品中的分析物。
文檔編號C12Q1/68GK102549170SQ201080045313
公開日2012年7月4日 申請日期2010年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月18日
發(fā)明者黃若磐 申請人:廣州瑞博奧生物科技有限公司