專利名稱：：用于從木素纖維素原料產生trichodiene的絲狀真菌和方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及使用生物質原料如木素纖維素原料從絲狀真菌產生trichodiene。具體而言，本發(fā)明涉及具有單端孢霉烯(trichothecenes)途徑的絲狀真菌,和使用生物質原料產生trichodiene的方法,其中所述真菌是不具有或具有低Tri4表達,或Tri4抑制,和Tri5>Tri6或TrilO中至少一種的表達增加的突變體真菌。
背景技術：
：目前世界對于使用石油燃料用于運輸的依賴性呈現以增加的CO2水平的形式的對全球環(huán)境的威脅和許多國家的能源安全性減少。從植物材料產生液體運輸燃料提供了對于基于石油的燃料的可再生的備選形式。隨著過去數年中生物燃料工業(yè)的發(fā)展，顯然對于可持續(xù)性和經濟可行性的兩個關鍵要素是原料的選擇和產生的燃料的性質。例如，在美國，由于利益競爭，將玉米用作供燃料乙醇生產的原料被視為對食物和飼料商品價格具有直接和間接的負面作用。這些作用加速了開發(fā)非食物相關原料如木素纖維素以供生物燃料生產的努力。對于生物燃料的主要研究和開發(fā)在于乙醇生產，盡管將木素纖維素用于乙醇生產的重要技術和經濟障礙尚未得到角軍決(remainunadressed)。還公認選擇的生物燃料的化學性質可對生物燃料的經濟學有顯著影響。如此，仍有對乙醇的備選燃料的商業(yè)需求，所述燃料在加工方面需要較低能量輸入，更加適于管道運輸，且與石油運輸燃料具有更佳的相容性。trichodiene是最初從真菌粉紅單端孢霉(Trichotheciumroseum)分離的環(huán)烴[S.Nozoe和Y.Machida,Tetrahedron28:5105-5111(1972)]。目前供大規(guī)模通過真菌產生trichodiene和其他職類化合物(terpenoids)的技術常常涉及導入異源生物合成途徑或使用祀向或非祀向的遺傳改變機理通過誘變來操縱天然途徑。然而，大量產生trichodiene先前在經濟上是不可行的。能夠累積大量倍半職烴類如trichodiene的真菌，代表了供商業(yè)產生生物燃料和其他有價值的類異戊二烯如類胡蘿卜素的有吸引力的系統。已經對于幾種鐮孢屬(Fusarium)菌種如擬分枝抱鍵抱(Fusariumsporotrichioides)、禾本科鍵抱(Fusariumgraminearum)和接骨木鐮孢(Fusariumsambucinum)觀察到了大量倍半職真菌毒素如單端孢霉烯的產生。其中最多產之一的是擬分枝孢鐮孢，據報道，其產生多至2.9g單端孢霉烯/升培養(yǎng)基(FusariumsporotrichioidesCurr.Genet.24:291-295)。在單端抱霉烯途徑中設計用于抑制途徑中第二個酶步驟或導致其喪失功能(Tri4基因產物)的化學或遺傳阻斷的引入導致倍半萜烴trichodiene的累積。Tri4基因產物的幾種化學抑制齊U，包括植物生長調節(jié)化合物卩密唳醇(ancymidol),已知導致trichodiene累積，而來源于NRRL3299(NRRL18340)(MB5493)(T-0927)的擬分枝孢鐮孢的突變株僅產生trichodiene而不產生其他單端孢霉烯途徑中間物。通過導致Tri4功能喪失的分子遺傳方法在擬分枝孢鐮孢中破壞Tri4基因,亦導致trichodiene的累積。
發(fā)明內容本發(fā)明涉及下述發(fā)現具有Tri4基因本身降低、不發(fā)揮功能或受(化學或生物)抑制并具有一種或多種來自Tri5，Tri6和TrilO的組的基因產物升高的單端孢霉烯生物合成途徑的絲狀真菌產生trichodiene產生的改進，并改進生物質原料利用的效率，即產生酶，減少成本，并提供小規(guī)模生產的機會。因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，存在產生trichodiene的突變體絲狀真菌，其具有單端孢霉烯途徑，所述途徑包含a)經破壞的Tri4基因或具有低P450單加氧酶產生的突變體Tri4基因；和b)經修飾的核酸序列,其編碼至少一種選自下組的基因Tri5,Tri6和TrilO,所述序列經修飾使得所述絲狀真菌與親本絲狀真菌細胞相比，當在相同條件下培養(yǎng)時，多產生至少10%的trichodiene。在本發(fā)明的另一個實施方案中，公開了產生trichodiene的突變體絲狀真菌,其具有單端孢霉烯途徑，所述途徑包含a)經修飾的核酸序列,其編碼至少一種選自下組的基因Tri5,Tri6和TrilO,所述序列經修飾而增加基因產物的產生；和b)足以抑制至少一部分Tri4基因產物的Tri4抑制劑的存在；其中所述絲狀真菌與親本絲狀真菌細胞相比，當在相同條件下培養(yǎng)時，多產生至少10%的trichodiene。還在本發(fā)明的另一個實施方案中，公開了產生trichodiene的方法,包括a)選擇突變體絲狀真菌，其具有單端孢霉烯途徑，所述途徑包含i.一種或多種經破壞的Tri4基因，具有低P450單加氧酶產生的突變體Tri4基因，以及所述真菌，與Tri4基因產物抑制劑組合；ii.修飾的核酸序列,其編碼至少一種選自下組的基因Tri5,Tri6和TrilO,所述序列經修飾而增加基因產物的產生；b)使用選自下組的生長培養(yǎng)基培養(yǎng)所述突變體絲狀真菌糖、淀粉、纖維素和半纖維素；和c)從生長培養(yǎng)基分離trichodiene,其中所述絲狀真菌與親本絲狀真菌相比，當在相同條件下使用相同生長培養(yǎng)基培養(yǎng)時，多產生至少10%的trichodiene。圖I是供產生異戊烯焦磷酸(“IPP”)的甲羥戊酸(“MEV”)途徑的概略表示。圖2是在Tri4突變體中將異戊烯焦磷酸(“IPP”)轉化為法尼焦磷酸(“FPP”)和trichodiene的概略表不。圖3顯示表達質?；虻膱D譜。圖4顯示表達質粒pD0R311的圖譜。圖5顯示表達質粒pD0R312的圖譜。圖6顯示表達質粒pD0R313的圖譜。圖6顯示表達質粒pD0R313的圖譜。圖8顯示表達質粒pD0R315的圖譜。本發(fā)明的詳述盡管本發(fā)明具有多種不同形式的實施方案，其示于附圖并在本文中在具體特定實施方案中描述，應理解此類實施方案的本公開應視為原理的實例，而并非旨在將本發(fā)明限制于顯示并描述的特定實施方案。在下文描述中，使相同的參照數字(referencenumeral)用于在附圖的多幅圖像中描述相同、類似或對應的部分。該具體描述限定本文中使用的術語的意義，并具體描述了實施方案使得本領域技術人員實施本發(fā)明。定義術語“一個”或“一種”(“aoran”)，如用于本文，定義為一個(種)或多于一個(種)。術語“復數(Plurality)”，如用于本文，定義為兩個(種)或大于兩個(種)。術語“另一個(種)(another)”，如用于本文，定義為至少第二或第更多個(種)。術語“含有(including)”和/或“具有(having)”如用于本文,定義為包含/包括(comprising)(即開放式語言)。術語“偶聯的(coupled)”如用于本文，定義為連接的，盡管無需直接連接且無需機械連接。本文全文中對“一個實施方案(oneembodiment)“某些實施方案(certainembodiments)”和“一個實施方案(anembodiment)”或類似的術語意指針對該實施方案所述的具體特征、結構或特性包含于本發(fā)明的至少一個實施方案中。因此，在本說明書中在多處此類短語的出現并不需要均指同一個實施方案。此外，可以以任何合適的方式在一個或多個實施方案中不加限制地組合所述具體特征、結構和特性。術語“或”，如用于本文，應解釋為包含性(inclusive)，或意指任一或任意組合。因此，“A、B或C”意指任何下述含義中:“A；B；C；A和B;A和C；B和C;A、B和C”。僅當要素、功能、步驟或作用的組合在一些方面固有地相互排斥時，才會出現對該定義的例外。附圖中顯示的圖僅為說明本發(fā)明的某些方便的實施方案的目的，且不應視作對其的限制。術語“手段(means)”之前為動作的現在分詞時，表示期望的功能，且存在一種或多種實施方案，即一種或多種方法、裝置(device)或設備(apparatus),以供實現該期望的功能，且本領域技術人員可根據本文的公開來從這些或其等同方式選擇，而且，術語“手段”的使用并非意欲為限制性的。術語“可操作地連接”指在同一DNA分子上生物組件的并置，處于允許它們以它們的意欲連接方式起作用的關系。例如，當啟動子影響核苷酸序列的轉錄或表達時，該啟動子可操作地連接于該核苷酸序列。術語“突變體”指通過涉及單端孢霉烯產生的一種或多種基因的修飾(例如破壞或缺失Tri4基因使得Tri4基因不再起作用)而與親本細胞相關的細胞。適于本發(fā)明目的的物理或化學誘變劑的實例包括紫外線(UV)照射，羥胺，N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)，0_甲基羥胺，亞硝酸，甲磺酸乙酯(EMS)，亞硫酸氫鈉，甲酸和核苷酸類似物。當使用此類試劑時，誘變通常通過將待誘變的親本細胞在所選誘變劑存在下在合適條件下溫育，并選擇呈現基因表達減少或無基因表達的突變體細胞來進行。基因的修飾或失活亦可通過在基因或其轉錄或翻譯所需的調節(jié)元件中導入、取代或去除一個或多個核苷酸來達成。例如，可插入或去除核苷酸從而導致終止密碼子的導入，起始密碼子的去除或開讀框的改變。此種修飾或失活可依照本領域已知方法通過定位誘變或PCR生成的誘變來達成。雖然原理上修飾可在體內進行，即直接對表達待修飾的基因的細胞進行，但優(yōu)選該修飾如下文例示在體外進行?；蛘?，基因的修飾或失活可通過已確立的反義技術使用與所述基因核酸序列互補的核苷酸序列來進行。更具體而言，絲狀真菌細胞對該基因的表達可通過導入與所述基因的核酸序列互補的核苷酸序列(其可在細胞中轉錄，并能夠與細胞中產生的mRNA雜交)來減少或消除。在允許互補的反義核苷酸序列與mRNA雜交的條件下，翻譯得到的蛋白的量由此減少或消除。術語“絲狀真菌”包括真菌門(Eumycota)和卵菌門(Oomycota)亞門的所有絲狀形式(如由Hawksworth等，于AinsworthandBisby'sDictionaryofTheFungi,第8版，1995，CABInternational,UniversityPress,Cambridge,UK所定義)。絲狀真菌通常的特征在于由殼多糖(chitin)、纖維素、葡聚糖、殼聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它復雜多糖組成的菌絲體壁。通過菌絲延伸進行營養(yǎng)生長，而碳分解代謝是專性需氧的。相反，酵母例如釀酒酵母的營養(yǎng)生長通過單細胞菌體的出芽生殖(budding)進行，而碳分解代謝可以是發(fā)酵的。在本發(fā)明的方法中，所述絲狀真菌細胞可為野生型細胞或其突變體。此外，所述絲狀真菌細胞可為不產生任何可檢測的單端孢霉烯，但含有編碼單端孢霉烯的基因的細胞。優(yōu)選地，所述絲狀真菌細胞為枝頂孢霉屬(Acremonium)、曲霉屬(Aspergillus)、短梗霉屬(Aureobasidium)、隱球菌屬(Cryptococcus)、Filibasidium、鍵孢屬(Fusarium)(例如禾本科鐮孢、擬分枝孢鐮孢、鑲片鐮孢)、赤霉屬(Gibberella)、腐質霉屬(Humicola)、梨抱菌屬(Magnaporthe)、毛霉屬(Mucor)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、漆斑菌屬(Myrothecium)、新考瑪脂霉屬(Neocallimastix)、脈抱菌屬(Neurospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(Penicillium)、瘤胃壺菌屬(Piromyces)、葡萄穗霉屬(Stachybotrys)、裂裙菌屬(Schizophyllum)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭抱殼屬(Thielavia)、彎頸霉屬(Tolypocladium)、木霉屬(Trichoderma)、或單端抱霉(Trichothecium)屬細胞。術語“單端孢霉烯”在本文中定義為通過一系列加氧、異構化、環(huán)化和酯化從trichodiene得到更復雜的單端孢霉烯而產生的倍半職環(huán)氧化物家族。單端孢霉烯包括但不限于2_輕基trichodiene,12,13-環(huán)氧-9,10-trichoene-2-醇、isotrichodiol、isotrichotriol、trichotriol、isotrichodermol、isotrichodermin、15—decalonectrin、3,15-didecalonectrin、脫氧雪腐鐮孢烯醇(deoxynivalenol)、3-乙酰脫氧雪腐鐮孢烯醇、calonectrin、3,15-二乙酰氧薦草鐮孢烯醇(3,15-diacetoxyscirpenol)、3，4,15-三乙酰氧薦草鐮孢烯醇(3，4，15-triacetoxyscirpenol)、4，15-二乙酰氧薦草鐮孢烯醇(4,15-diacetoxyscirpenol)、3_乙酰新爺病鐮孢烯醇(3-acetyIneosolaniol)、乙酰T-2毒素和T-2毒素；及其衍生物。單端孢霉烯生物合成途徑顯示于圖2(Microbiol.Rev.,57:595-604)。術語“組成型活性”指表達的且未知其受調節(jié)而完全停止表達的啟動子，即其總是開啟的，且并不完全依賴于被某些其他生物系統的激活。術語“誘導型”或“誘導型活性”指其活性水平響應于用外源信號或試劑的處理而增加的啟動子。術語“不可回復的位點選擇缺失(nonrevertablesite-selecteddeletion)”指缺失顯著量的Tri4DNA序列使得生物無法回復至野生型。對于，回復是以天然出現或誘導的點突變存在的隨時間的有限可能性，其中單個突變可容易地在用于產生活性基因產物的產生過程中天然突變回來(mutateback)。本發(fā)明的缺失包括大缺失或活性位點缺失，后者涉及活性位點殘基的單個密碼子。術語“基因產物”指由DNA編碼的RNA(或反之)，或者由RNA或DNA編碼的蛋白，其中基因通常會包含一個或多個編碼蛋白的核苷酸序列，且亦可包含內含子和其他非編碼核苷酸序列。術語“多至少10%的trichodiene”指當將修飾的菌株與親本株或野生型株相比時，如通過化學分析方法測量并表示為克trichodiene每升培養(yǎng)物或克trichodiene每克真菌培養(yǎng)物干重的由真菌細胞產生的trichodiene的量的增加。術語“酶或催化活性”指Tri4基因產物催化用于產生加氧的trichodiene產物所需的trichodiene化學轉化的能力。術語“低P450單加氧酶產生”指使得與通過化學分析在相同生長條件下在親本株或野生型株中觀察到的水平相比，產生的trichodiene的水平高超過10%的在Tri4突變株或Tri4抑制株中產生的具有酶活性的Tri4基因產物的量。術語“自主維持(autonomousmaintenance)”指在絲狀真菌細胞內獨立于染色體DNA而復制的DNA或載體。對于自主復制，所述DNA或載體可進一步包含使得載體能夠在討論的絲狀真菌細胞中自主復制的復制起點。術語“啟動子”指含有基因的DNA序列中提供RNA聚合酶結合和轉錄起始的部分，且因此指能夠控制編碼序列或功能性RNA的表達的DNA序列。啟動子序列通常但非總是見于基因的5’非編碼區(qū)，在編碼多肽的一個或多個開讀框上游。在啟動子內在轉錄起始中發(fā)揮功能的序列元件通常由共有核苷酸序列所表征。啟動子序列可包含近端和更遠端的上游元件。啟動子可例如為組成型、誘導型或環(huán)境應答的(environmentallyresponsive)。術語“終止子”指由絲狀真菌細胞識別以終止轉錄的序列。Tri5終止子序列可操作地連接于編碼Tri6或TrilO多肽的核酸序列的3’端。任何在絲狀真菌細胞中起作用的終止子可用于本發(fā)明。就本發(fā)明而言，術語“抑制劑”指由于該物質與酶相互作用從而減少反應速率而阻止酶過程的物質。術語“單端孢霉烯途徑”在本文中用于指將法尼焦磷酸(FPP)轉化為單端孢霉烯的生物合成途徑。單端孢霉烯途徑的最先兩步概略性圖示于圖2。術語“葡萄糖當量”用于描述淀粉或纖維素水解為葡萄糖單體的水解程度或已經或潛在地可轉化為還原糖的總固形物的百分比。術語“生物質”指任何可用于生物燃料或生物產品工業(yè)工藝的生物材料，包括但不限于木素纖維素、藻類、藻工藝廢物、殼多糖、殼聚糖、果膠(包括甜菜工藝殘余物)和蛋白(包括油籽壓榨殘余物)。其他材料在本領域中是已知的，且可由本領域技術人員鑒定。術語“木素纖維素原料”指使用由木素纖維素(纖維素、半纖維素和木質素)組成的植物生物質作為原料以供生物燃料和生物產品工業(yè)工藝。木素纖維素(纖維素和半纖維素)的糖聚合物緊密結合于木質素，并不易受酶水解接近。木素纖維素原料包括但不限于農業(yè)殘余物(包括玉米秸桿、麥桿和甘蔗渣)，能量作物(包括高粱、柳枝稷和芒草屬)、木質殘余物(包括鋸木廠和造紙廠丟棄物)、林業(yè)廢物、工業(yè)廢物(包括造紙廠污泥(papersludge))和城市紙和園林廢物(municipalpaperandlandscapewaste)。其他材料是已知的，且可由本領域技術人員鑒定。術語“載體”指轉導、轉化或感染宿主株，由此導致細胞產生除了對于細胞是天然的那些之外的核酸和/或蛋白，或以對于細胞非天然的方式表達核酸和/或蛋白的核酸序列或分子(例如質粒)。或者，所述載體可含有其他核酸序列以供指導通過同源重組整合入絲狀真菌細胞的基因組。所述其他的核酸序列使得載體能夠在染色體上的精確位置整合入基因組。為了增加在精確位置處整合的可能性，整合元件應優(yōu)選含有合適數量的核酸，如100至1500堿基對，優(yōu)選400至1500堿基對，且最優(yōu)選800至1500堿基對，其與對應的靶序列高度同源以增強同源重組的可能性。所述整合元件可為任何與絲狀真菌細胞基因組中的靶序列同源的序列。此外，所述整合元件可為非編碼或編碼核酸序列。另一方面，所述載體可通過非同源重組整合入細胞基因組。術語“生長培養(yǎng)基培養(yǎng)”指在適于使用本領域已知方法產生trichodiene的營養(yǎng)培養(yǎng)基中進行的培養(yǎng)。例如，所述細胞可用合適的培養(yǎng)基和在允許分泌和/或分離trichodiene的條件下通過搖瓶培養(yǎng),或者在實驗室或工業(yè)發(fā)酵器中的小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補料分批或固態(tài)發(fā)酵)進行培養(yǎng)。包含碳源和氮源和無機鹽的合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基和無機鹽可從商業(yè)供應商獲得，或可使用生物質作為培養(yǎng)基碳源來制備。根據本發(fā)明，本領域技術人員可使用最少的實驗產生適當的培養(yǎng)物。術語“親本株”指經突變、電穿孔，或者以其他方式改變以提供本發(fā)明的株或宿主株的微生物株，或者在經突變、電穿孔，或者以其他方式改變以提供本發(fā)明的株或宿主株的株原先的株。術語“修飾核酸序列”指從天然存在的基因分離，或經修飾而含有以自然界中本不存在的方式缺失、組合和/或并置的核酸區(qū)段的單鏈或雙鏈核酸分子。詞語“焦磷酸”在本文中可與“二磷酸”互換使用。術語“親本株”在本文中用于指可插入或已經插入異源核酸的任何古菌(archae)、細菌或真核活細胞。該術語亦指起始細胞的后代，其可能由于天然的、偶然的或故意的突變而無需在形態(tài)或基因組或總DNA互補方面與起始親本完全相同。術語“轉化”指在導入新核酸之后在細胞中誘導的永久性或暫時性遺傳變化。遺傳變化(“修飾”)可通過將新DNA并入宿主株的基因組，或通過將新DNA作為附加體元件暫時或穩(wěn)定維持來達成。在真核細胞中，永久性遺傳變化一般通過將DNA導入細胞基因組來達成。絲狀真菌中的單端孢霉烯生物合成途徑對于本領域技術人員是較為公知的。圖I和圖2的描述概述了單端孢霉烯合成途徑以及其在類異戊二烯合成途徑中的位置。圖2亦描述了使用本文關注的途徑的已知燃料產物生產。該途徑存在于多種絲狀真菌，包括但不限于如枝頂孢霉屬(Acremonium)、曲霉屬(Aspergillus)、短梗霉屬(Aureobasidium)Jil球菌屬(Cryptococcus)、Filibasidium、鍵抱屬(Fusarium)、赤霉屬(Gibberella)、腐質霉屬(Humicola)、梨抱菌屬(Magnaporthe)、毛霉屬(Mucor)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、漆斑菌屬(Myrothecium)、新考瑪脂霉屬(Neocallimastix)、脈抱菌屬(Neurospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(Penicillium)、瘤胃壺菌屬(Piromyces)、葡萄穗霉屬(Stachybotrys)、裂裙菌屬(Schizophyllum)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭抱殼屬(Thielavia)、彎頸霉屬(Tolypocladium)、木霉屬(Trichoderma)、或單端抱屬(Trichothecium)的種。在一個實施方案中，所述絲狀真菌是擬分枝孢鐮孢如NRRL3299。在該途徑中，法尼焦磷酸的產生在這些真菌中是保守的，而Tri5基因產物,trichodiene合酶,在該途徑中負責將FPP轉化為trichodiene。trichodiene是C-15(15個碳原子)的二環(huán)烴類,其若以大于0.lg、0.22g或0.25g每克消耗的葡萄糖或葡萄糖當量的充足量產生，可考慮用作C-15烴燃料的商業(yè)來源。在一個實施方案中，所述C-15燃料是柴油和/或噴氣燃料。Tri5基因產物的產生至少部分是由Tri6基因產物調節(jié)的，后者是在類異戊二烯途徑中控制FPP合酶和Tri5基因產物的表達的正轉錄因子。TrilO基因產生對于類異戊二烯途徑中的Tri5、Tri6和FPP合酶為正調節(jié)劑的產物。Tri6和TrilO兩者表現對FPP合酶、HMGCoA還原酶合酶和甲羥戊酸激酶和其余類異戊二烯途徑的途徑酶的表達的控制，并負責中間產物進入單端孢霉烯途徑的流動的上調。此外，Tri6和TrilO均已知具有調節(jié)Tri4和Tri5的活性。將這些基因的多個拷貝導入天然株背景導致“單端孢霉烯”的高水平產生，而在本發(fā)明之前未顯示Tri6、Tri5和TrilO基因的中斷或增強，更不用說顯示其與Tri4突變體的組合。在本發(fā)明之前，并未表明這些修飾的組合會共同作用，更不用說產生對trichodiene產生的改善的或協同的效果。Tri4基因編碼在單端孢霉烯生物合成途徑中用于從trichodiene轉化為2_輕基trichodiene的酶的產生。酶P450單加氧酶成為trichodiene轉化中的限速步驟。Tri4基因還由Tri6和TrilO調節(jié)。Tri4、Tri5、Tri6和TrilO的分離和表征顯示其均位于擬分枝孢鐮孢中的基因簇中的IOkbDNA片段上。已知其位于與其他產生單端孢霉烯的絲狀真菌中的類似位置處。本發(fā)明涉及在具有類異戊二烯途徑的絲狀真菌中以足以具有商業(yè)意義的量產生C-15烴(其可用于噴氣燃料和柴油燃料生產)。通過將Tri4的(生物或化學)破壞或部分阻斷與導致增加的trichodiene產生或減少的trichodiene轉化為2_輕基trichodiene(通過減少Tri6或TrilO對Tri4的調節(jié))Tri5、Tri6或TrilO中的至少一種其他修飾相組合，可在絲狀真菌中產生并分離商業(yè)量的trichodiene用于類異戊二烯途徑。該修飾可為基因全部或部分的添加或缺失，其他基因的取代，例如，發(fā)現具有組成型活性的基因或其他任何本領域中已知的根據需要增加基因的產生或活性或其他性質的修飾。然后，該菌種中的產生會代表相對于生產細菌或其他物種的巨大改善，因為其可在有氧條件下進行，且燃料產物與水發(fā)生相分離，使該工藝在配置于小規(guī)模生產設施如農場中(on-farm)的trichodiene生產設施或糖或木素纖維素材料(生物質)所處于的其他位置時更加合算。此外，由于這些真菌菌種的大多數能夠利用多種不同生物質原料如纖維素、半纖維素糖源、藻類蛋白、藻類多糖等以供產生，其代表允許使用木素纖維素原料而無需通常使得其他工藝過于昂貴和費力的大量添加加工酶以供向組分糖或木素纖維素原料的轉化的實際改善。絲狀真菌生產系統即使未消除，也極大地減少了對酶的需求，因此提供了燃料的生物生產的新型實際方案，因為其可以以小規(guī)模在當地生產，且其可方便地提供對于原料運輸成本和后勤問題的有效解決方案，所述問題對于任何方法在一些情況下可為比燃料生產自身更大的障礙。本發(fā)明的絲狀真菌具有經修飾以減少或消除Tri4基因產物P450單加氧酶產生的Tri4基因。若無該酶，trichodiene即無法在轉化步驟的下一步中轉化。顯然阻斷該酶的效用或其產生的化學修飾會實現相同目的，并視作用于阻斷酶產生或活性的手段的部分。然后將Tri4修飾/處理與至少一種對Tri5、Tri6或TrilO基因/基因產物的修飾相組合，使得可產生甚至更大量的trichodiene。已確定至少雙重突變體與任何單一突變體相比產生更多trichodiene,且在一些情況下為協同增加。產生這些突變體是困難的，且除非申請人公開，不會有人得知可獲得此類突變體，不會有人付出勞動以將trichodiene產生改善至商業(yè)水平。顯然，同樣可組合基因中的多重突變以給出甚至更高的trichodiene產生。對Tri4基因的修飾是已知的。對其他基因序列的修飾可通過任何已知用于基因修飾以增加或減少基因產物等的活性的方法來獲得。具有產生雙重突變體的知識的本領域技術人員可容易地制備此類雙重突變體而無需不必要的實驗?，F參見附圖。圖2是選擇在具有類異戊二烯產生途徑的絲狀真菌中trichodiene產生途徑的流程圖。由其可見，法尼焦磷酸僅由Tri5基因產物反應以產生trichodiene。然后Tri4基因產物與trichodiene反應以產生2-輕基trichodiene,其進一步被代謝為單端孢霉烯。Tri6和TrilO基因產物在該途徑中作為調節(jié)控制起作用，并因此其與對Tri4產物的產生的修飾的組合導致產生了商業(yè)數量的trichodiene。在圖I中，為類異戊二烯生物合成途徑的一般流程圖。盡管在該途徑中產生了汽油、柴油、噴氣燃料，本發(fā)明主要涉及柴油和噴氣燃料的產生。實施例列出了下述實施例以提供本領域一般技術人員如何制備和使用本發(fā)明的完整公開和描述，且并不旨在限制發(fā)明人認為是其發(fā)明的范圍，亦不旨在代表下述實驗是進行的所有或僅有的實驗。進行了努力以確保對于使用的數字(例如量、溫度等)的精確度，然而應允許一些實驗誤差和偏差。除非另行指明，份是重量份，分子量是重均分子量，溫度是。C，壓力是大氣壓或接近大氣壓。可使用標準縮寫，例如bp，堿基對；kb，千堿基；pl,皮升；s或sec,秒min,分鐘；h或hr,小時；aa,氨基酸；nt,核苷酸；i.m.，肌肉內；i.p.,腹膜內；s.c.,皮下；等等。實施例I選擇了具有Tri4序列缺失的絲狀真菌擬分枝孢鐮孢NRRL3299，因此其無法產生Tri4基因產物。觀察到了trichodiene的累積。處理該生物體以修飾Tri6基因以具有組成型活性，因此增加FPP的產生和進一步增加trichodiene產生。實施例2再次修飾NRRL3299，這次修飾了Tri6和TrilO基因使得Tri5基因產物的產生增力口。在相關的實施例中，使得Tri6、TrilO或兩種基因組成型活化。實施例3絲狀真菌擬分枝孢鐮孢NRRL18340是Tri4突變體,并累積trichodiene。處理該生物體以修飾Tri6以具有組成型活性，由此增加FPP的產生,并進一步增加trichodiene產生。實施例4再次修飾NRRL18340，這次修飾了Tri6和TrilO基因使得Tri5基因產物的產生增加。在相關的實施例中，使得Tri6、TrilO或兩種基因組成型活化。實施例5再次修飾NRRL3299，這次修飾了Tri6和TrilO基因，并導入了一個或多個額外的Tri5拷貝使得Tri5基因產物的產生增加。在相關的實施例中，使得Tri6、TrilO或兩種基因組成型活化。實施例6再次修飾NRRL3299，這次使用來自另一個真菌菌種的Tri6和/或Tri10基因。修飾了Tri6和TrilO基因兩者使得Tri5基因產物的產生增加。在相關的實施例中，使得Tri6、TrilO或兩種基因組成型活化。實施例7生成編碼Tri6_PK和TrilO-Pl的表達質粒通過將Tri6-PK-ThlO_Pl基因片段插入pDORlOl載體來生成表達質粒pD0R311。通過將包含Hyg-Pl基因的DNA合成構建體插入pUC57(GenBank登錄號Y14837)的EcoRV限制位點來生成載體PD0R101(圖3)。Hyg-Pl由三個基因元件組成(表I)，包括具有異旋抱腔菌(Cochliobolusheterostrophus)Pl啟動子序列(GenBank登錄號CCLPR0AREGION:I..645)和玉米赤霉(Gibberellazeae)Ti5終止子序列(GenBank登錄號AF359361REGION:32132..32484)的編碼大腸桿菌潮霉素磷酸轉移酶(GenBank登錄號VO1499)的潮霉素抗性選擇性標記基因。Ti6-PK基因(SEQIDNO:I)通過DNA合成生成，并作為鈍端片段克隆入PUC57的EcoRV限制位點以生成pD0R102。Th6_Pl由玉米赤霉，Tri6編碼區(qū)(GenBank登錄號AF359361REGION:27401..28057)，玉米赤霉Th5終止子序列，和玉米赤霉丙酮酸激酶啟動子序列(GenBank登錄號FG10743.IREGION:3790933..3792134)組成。TrilO-Pl基因(SEQIDNO:2)通過DNA合成生成，并作為鈍端片段克隆入pUC57的EcoRV限制位點以生成PD0R103。TMlO-Pl由玉米赤霉，TrilO編碼區(qū)(GenBank登錄號AF359361REGION:32799..34151)，玉米赤霉Tri5終止子序列，和異旋孢腔菌Pl啟動子序列組成，其中在所述TrilO編碼區(qū)中在編碼序列的位置570和771導入兩個保守的C至T核苷酸變化，設計用于消除兩個共有Tri6DNA結合位點(YNAGGCC)，認為其在TrilO基因表達的負調節(jié)中起作用(Tag,AG.,Gaifullina.G.F.,Peplow,A.ff.,AkeJr,C;PhiIlips,T.D.,Hohn,T.M.&Beremand,M.N.(2001)ANovelRegulatoryGene,TrilO,ControlsTichotheceneToxinProductionandGeneExpression,Appl.Environ.Microbiology,67:5294-5302)。為了構建Tri6-PK-TilO-Pl片段，用限制酶XbaI和MluI將pD0R102DNA消化至完全，并通過凝膠電泳解析反應混合物，并凝膠提取I.7kbTri6-PK片段。將分離的片段與經限制酶SpeI和MluI消化的pD0R103DNA相連接以生成質粒pD0R203。用限制酶XhoI和NheI將pD0R203DNA消化至完全，并通過凝膠電泳解析反應混合物，并凝膠提取4.9kbTri6-PK-TriIO-Pl片段。將分離的片段連接入經XhoIXbaI消化的pDORlOl，得到表達質粒PD0R311。PD0R311的核苷酸序列在SEQIDNO:3中給出，而質粒圖在圖4中給出。表I表達質?；蛟蛟碓確_GenBank登錄號_啟動子I異旋孢腔菌組成型啟動子_CCLPROAREGION:1-645FgTriS終止子禾本科鐮孢Tri5轉錄終止_AF359361REGION:32132..32491FgTri6CDS禾本科嫌孢Tri6編碼序則_AF359361REGION:27401..28057HygCDS大腸桿菌潮霉素B磷酸轉移_V01499REGION:231..1256__編碼序列__FgTrilOCDS禾本科嫌抱■TriiO編碼序列_AF35936IREGION:32799..341SIFgPK啟動子禾本科鐮孢丙酮酸激酶啟動子FGI0743.1REGION:3790934.3792134FsTriS基因擬分枝孢鐮孢trichodiene合酶基因AF359360REGION:268Q9..2%42通過去除pD0R311中的TrilO-Pl基因來生成表達質粒pD0R312。用SpeI和XbaI限制酶將PD0R311質粒DNA消化至完全，通過凝膠過濾解析反應混合物，并凝膠提取7.3kb片段。分離的片段自連接得到表達質粒PD0R312。PD0R312的核苷酸序列在SEQIDNO:4中給出，而質粒圖在圖5中給出。通過去除pD0R311中的Tri6_PK基因來生成表達質粒pD0R313。用HpaI限制酶將PD0R311質粒DNA消化至完全，通過凝膠過濾解析反應混合物，并凝膠提取7.2kb片段。分離的片段自連接得到表達質粒PD0R313。PD0R313的核苷酸序列在SEQIDN0:5中給出，而質粒圖在圖6中給出。通過將Tri6-Pl基因(SEQIDNO:6)插入pDORlOl載體來生成表達質粒pD0R314。使用引物D0R123(SEQIDNO:7)和D0R107(SEQIDNO:8)通過從質粒pD0R102中的合成Tri6-PK基因進行PCR擴增來生成Tri6_Pl基因(圖3)。用于擴增Tri6編碼序列的上游引物包括第二個氨基酸的密碼子中的變化(從Ile殘基變?yōu)閂al)，并導入了NcoI限制位點。使用NcoI和BsrGI限制酶將PCR產物消化至完全，通過凝膠過濾解析反應混合物，凝膠提取I.OkbDNA片段，并將分離的DNA片段連接入pD0R103的NcoIBsrGI限制酶位點以生成質粒PD0R202。用限制酶SpeI和SacI將pD0R202DNA消化至完全，并通過凝膠過濾解析反應混合物，并凝膠提取I.7kbTri6-Pl片段。將分離的片段連接入XbaISacI消化的pDORlOl，得到表達載體pD0R314。pD0R314的核苷酸序列在SEQIDN0:9中給出，而質粒圖在圖7中給出。通過將編碼擬分枝孢鐮孢trichodiene合成酶基因(Tri5)的核苷酸序列插入表達質粒PD0R312來生成表達質粒pD0315。所述Tri5基因包括Tri5啟動子、編碼序列和終止子序列，且會預期其復制增加trichodiene產生中此關鍵酶的表達。使用引物D0R121(SEQIDNO:10)和D0R122(SEQIDNO:11)通過從擬分枝孢鐮孢T-0926(NRRL3299，從PennsylvaniaStateUniversity,FusariumResearchCenter獲得)基因組DNAPCR擴增Tri5基因(GenBank登錄號AF359360REGI0N:26809..29642)來生成Tri5基因片段。上游引物構建了NheI限制位點，而下游引物構建了XmaI限制位點。使用NheI和XmaI限制酶將PCR產物消化至完全，通過凝膠過濾解析反應混合物，凝膠提取2.8kbDNA片段，并將分離的DNA片段連接入表達質粒pD0R313的AvrIIXmaI限制酶位點。pD0R315的核苷酸序列在SEQIDNO:12中給出，而質粒圖在圖8中給出。實施例8該實施例描述了可用于本發(fā)明的擬分枝孢鐮孢宿主株的生成。通過用實施例I的表達質粒之一轉化擬分枝孢鐮孢T-0927(NRRL18340，從PennsylvaniaStateUniversity,FusariumResearchCenter獲得)親本細胞來構建宿主株。DNA介導的進入擬分枝孢鐮孢T-0927原生質體的轉化是使用由(Royer,J.C，Moyer,D.L.，Reiwitch,S.G.，Madden,M.S.，Jensen,E.B.，Brown,S.H.，Yonker，CCjJohnstone,J.A.，Golightly,E.J.，Yoder,W.T.和Shuster，J.R.1995.FusariumgraminearumA3/5asanovelhostforheterologousproteinproduction.NatureBiotechnology13:1479-1483)所述的聚乙二醇方法進行的。轉化的宿主細胞起初在瓊脂培養(yǎng)基(0.1%酪蛋白酶水解物，0.1%酵母提取物，I.6%瓊脂和IM蔗糖)培養(yǎng)皿中生長，并在24小時之后，添加含有50iig/mL抗生素潮霉素的1%水瓊脂覆蓋物(overlay)以選擇整合了表達質粒DNA的轉化體。將在3至10日之后生長穿過覆蓋物的單菌落轉移至含有潮霉素(150yg/mL)的V8汁液瓊脂(juiceagar)(每升180mLV8汁液,800mL水,2gCaC03和15g細菌用瓊脂)，并將培養(yǎng)物在28°C生長7至10日，然后在滅菌水中收獲分生孢子。將分生孢子在冷凍小瓶中以由200iiL滅菌50%甘油和800uL分生孢子懸液制成的ImL儲備等分試樣儲藏于_80°C。轉化體中的所有基因整合通過表型分析和基因組DNA對于代表整合的基因元件的DNA片段的聚合酶鏈式反應(“PCR”)分析來確證。表達質粒pD0R311、pD0R312、pD0R313、pD0R314、pD0R315使用pUC57載體構建，并概略性描述于圖4-8和表I。質粒DNA的繁殖在大腸桿菌菌株DH5a中進行。實施例9該實施例說明親本株擬分枝孢鐮孢T-0926中trichodiene的產生相對于宿主株擬分枝孢鐮孢T-0927增加。擬分枝孢鐮孢T-0927是來源于分離株擬分枝孢鐮孢T-0926的UV突變株(Tri4_)，其在單端孢霉烯途徑的Tri4步驟中阻斷,并累積trichodiene。在V8瓊脂培養(yǎng)基上構建擬分枝孢鐮孢菌株T-0926和菌株T-0927的接種培養(yǎng)物。在7日之后，使用細胞刮具收獲分生孢子，并用于以IxlO5個孢子/mL的起始數接種于各含有45mL的GYEP培養(yǎng)基(0.1%細菌用酵母提取物，0.1%細菌用蛋白胨和5%葡萄糖)的250mL燒瓶中。將培養(yǎng)物在28°C以200RPM在旋轉振蕩器上溫育24小時，在此時點將其用5mL十二烷覆蓋。在48小時，添加0.45ml的YEP培養(yǎng)基(5%細菌用蛋白胨和1%細菌用酵母提取物)，并在120小時之后將培養(yǎng)材料轉移至50mL離心管,并在5000xg離心5分鐘,之后對有機覆蓋物層進行取樣。確定真菌菌絲體的干重量，即在預干燥和預稱重的過濾器上過濾培養(yǎng)材料，其在80°C干燥3日并稱重以生成培養(yǎng)物干重(CDW)。在分析之前，將體積為4iiL的有機覆蓋物樣品添加至干凈玻璃小瓶中作為內標的996uL含有0-或反式石竹烯(Sigma-Aldrich,St.Louis,Mo.)的異丙醇。將樣品在偶聯于配有7683系列注入器和自動取樣器的5973質量選擇性檢測器，和配有ZebronZB-WaxPlus臘毛細管柱(0.25mmi.d.x30m,具有0.25mm薄膜)(可從AgilentTechnologies獲得)的Hewlett-Packard6890氣相色譜上進行分析。對于所有實驗,針取樣深度設為8mm。將GC以2mLmiiT1的He流速進行操作，并將MSD在70eV進行操作。以250°C的注入器溫度進行無分流注入(2yL)。對GC設置下述程序起始加熱器(oven)溫度為50°C(5分鐘維持)，然后增加10°CmiiT1至180°C(4分鐘維持)，然后以100°CmirT1急速上升(ramp)直至240°C(I分鐘維持)。在獲得MS數據之前包括了8.5分鐘的溶劑延遲。通過使用EnhancedChemstation(版本B.01.00，AgilentTechnologies)峰面積積分來對產物峰進行定量?；谄涔_的trichodiene質量片段化譜(DesjardinsAE,PlattnerRD&BeremandMN.(1987)AncymidolblockstrichothecenebiosynthesisandleadstoaccumulationoftrichodieneinFusariumsporotrichioidesandGibberellapulicaris.Appl.Environ.Microbiol.,53:1860-1865)鑒定trichodiene,且其使用該GC實驗方案具有18.48分鐘的保留時間。石竹烯用作定量標樣，并具有15.92分鐘的保留時間?；贕C峰面積/mg/mL確立了對石竹烯的響應因子(responsefactor),其中對應于I.Omg/mL的濃度的石竹烯峰面積等于I.OCP單位。trichodiene效價計算為trichodiene的峰面積對石竹烯響應因子的峰面積的比例，并以CP單位報道。在120小時生長之后，發(fā)現兩個擬分枝孢鐮孢T-0927培養(yǎng)物產生11和17CP單位trichodiene/gCDff,并發(fā)現兩個擬分枝孢鐮孢T-0926培養(yǎng)物均產生0.00CP單位trichodiene/gCDW0實施例10該實施例說明了表達Tri6-PK和TrilO-Pl的宿主株中trichodiene的產生相對于親本株擬分枝孢鐮孢T-0927的產生增加。通過將每種株的儲備物等分試樣在含潮霉素(150yg/mL)的V8瓊脂培養(yǎng)基上生長7至10日來建立宿主株BOl和B07(表2)的接種培養(yǎng)物。使用細胞刮具從接種培養(yǎng)物收獲分生孢子，并用于以IxlO5個孢子/mL的起始數接種于不同的含有45mL的GYEP培養(yǎng)基(0.1%細菌用酵母提取物，0.1%細菌用蛋白胨和5%葡萄糖)的250mL燒瓶中。將培養(yǎng)物在28°C以200RPM在旋轉振蕩器上溫育24小時，在此時點將其用5mL十二烷覆蓋。在48小時，添加0.45ml的YEP培養(yǎng)基(5%細菌用蛋白胨和1%細菌用酵母提取物)，并在120小時之后將培養(yǎng)材料轉移至50mL離心管，并在5000xg離心5分鐘，之后對有機覆蓋物層進行取樣。確定真菌菌絲體的干重量，即在預干燥和預稱重的過濾器上過濾培養(yǎng)材料，其在80°C干燥3日并稱重以生成培養(yǎng)物干重(CDW)。在分析之前，將體積為4iiL的有機覆蓋物樣品添加至干凈玻璃小瓶中作為內標的996iiL含有石竹烯的異丙醇。將稀釋的有機覆蓋物樣品如實施例3中所述在Hewlett-Packard6890氣相色譜/質譜儀(GC/MS)上進行分析。對每個宿主株使用兩次重復進行實驗，并將結果平均。在120小時生長之后，發(fā)現宿主株BOl和B07產生IllCP單位trichodiene/gCDfftrichodiene和103CP單位trichodiene/gCDW。發(fā)現親本株擬分枝抱鍵抱T-0927培養(yǎng)物產生14CP單位trichodienegCDff0表2宿主株質粒來源宿主株親本株表達質粒真菌抗生素選擇BOl擬分枝孢鐮孢T-0927PD0R311潮霉素B07擬分枝孢鐮孢T-0927pD0R311潮霉素G08擬分枝孢鐮孢T-0927pD0R312潮霉素H03擬分枝孢鐮孢T-0927pD0R313潮霉素H07擬分枝孢鐮孢T-0927pD0R313潮霉素JOl擬分枝孢鐮孢T-0927PD0R314潮霉素JlO擬分枝孢鐮孢T-0927PD0R314潮霉素IOl擬分枝孢鐮孢T-0927PD0R315潮霉素實施例11該實施例說明了表達Tri6_PK的宿主株中trichodiene的產生相對于親本株擬分枝孢鐮孢T-0927的產生增加。通過將每種株的儲備等分試樣在含潮霉素(150i!g/mL)的V8瓊脂培養(yǎng)基上生長7至10日來建立宿主株G08的接種培養(yǎng)物。使用細胞刮具從接種培養(yǎng)物收獲分生孢子，并用于以IxlO5個孢子/mL的起始數接種于不同的含有62.5mL的GYEP培養(yǎng)基(0.1%細菌用酵母提取物，0.1%細菌用蛋白胨和5%葡萄糖)的125mL燒瓶中。將培養(yǎng)物在28°C以200RPM在旋轉振蕩器上溫育24小時，在此時點將其用6.25mL十二烷覆蓋。在168小時之后，將45mL富集了有機層的培養(yǎng)材料轉移至50mL離心管，并在5000xg離心5分鐘，之后對有機覆蓋物層進行取樣。確定真菌菌絲體的干重量，即在預干燥和預稱重的過濾器上過濾培養(yǎng)材料，其在80°C干燥3日并稱重以生成培養(yǎng)物干重(CDW)。在分析之前，將體積為L的有機覆蓋物樣品添加至干凈玻璃小瓶中作為內標的996iiL含有石竹烯的異丙醇。將稀釋的有機覆蓋物樣品如實施例3中所述在Hewlett-Packard6890氣相色譜/質譜儀(GC/MS)上進行分析。在168小時生長之后，發(fā)現宿主株G08產生268CP單位trichodiene/gCDW。發(fā)現親本株擬分枝孢鐮孢T-0927培養(yǎng)物產生27CP單位trichodienegCDW。實施例12該實施例說明了表達TrilO-Pl的宿主株中trichodiene的產生相對于親本株擬分枝孢鐮孢T-0927的產生增加。通過將每種株的儲備等分試樣在含潮霉素(150Ug/mL)的V8瓊脂培養(yǎng)基上生長7至10日來建立宿主株H03和H07的接種培養(yǎng)物。使用細胞刮具從接種培養(yǎng)物收獲分生孢子，并用于以IxlO5個孢子/mL的起始數接種于不同的含有62.5mL的GYEP培養(yǎng)基(0.1%細菌用酵母提取物，0.1%細菌用蛋白胨和5%葡萄糖)的125mL燒瓶中。將培養(yǎng)物在28°C以200RPM在旋轉振蕩器上溫育24小時，在此時點將其用6.25mL十二烷覆蓋。在168小時之后，將45mL富集了有機層的培養(yǎng)材料轉移至50mL離心管,并在5000xg離心5分鐘,之后對有機覆蓋物層進行取樣分析。確定真菌菌絲體的干重量，即在預干燥和預稱重的過濾器上過濾培養(yǎng)材料，其在80°C干燥3日并稱重以生成培養(yǎng)物干重(CDW)。在分析之前，將體積為L的有機覆蓋物樣品添加至干凈玻璃小瓶中作為內標的996iiL含有石竹烯的異丙醇。將稀釋的有機覆蓋物樣品如實施例3中所述在Hewlett-Packard6890氣相色譜/質譜儀(GC/MS)上進行分析。在168小時生長之后，發(fā)現宿主株H03和H07產生143CP單位trichodiene/gCDff和150CP單位trichodiene/gCDW。發(fā)現親本株擬分枝孢鐮孢T-0927培養(yǎng)物產生27CP單位trichodienegCDW。實施例13該實施例說明了表達TrilO-Pl和多個Tri5的宿主株中trichodiene的產生相對于親本株擬分枝孢鐮孢T-0927的產生增加。通過將每種株的儲備等分試樣在含潮霉素(150yg/mL)的V8瓊脂培養(yǎng)基上生長7至10日來建立宿主株JOl和JlO的接種培養(yǎng)物。使用細胞刮具從接種培養(yǎng)物收獲分生孢子，并用于以Ixio5個孢子/mL的起始數接種于不同的含有45mL的GYEP培養(yǎng)基(0.1%細菌用酵母提取物，0.1%細菌用蛋白胨和5%葡萄糖)的250mL燒瓶中。將培養(yǎng)物在28°C以200RPM在旋轉振蕩器上溫育24小時，在此時點將其用5mL十二烷覆蓋。在48小時，添加0.45ml的YEP培養(yǎng)基(5%細菌用蛋白胨和1%細菌用酵母提取物)，并在120小時之后將培養(yǎng)材料轉移至50mL離心管,并在5000xg離心5分鐘,之后對有機覆蓋物層進行取樣分析。確定真菌菌絲體的干重量，即在預干燥和預稱重的過濾器上過濾培養(yǎng)材料，其在80°C干燥3日并稱重以生成培養(yǎng)物干重(CDW)。在分析之前，將體積為L的有機覆蓋物樣品添加至干凈玻璃小瓶中作為內標的996iiL含有石竹烯的異丙醇。將稀釋的有機覆蓋物樣品如實施例3中所述在Hewlett-Packard6890氣相色譜/質譜儀(GC/MS)上進行分析。對每個宿主株使用兩次重復進行實驗，并將結果平均。在120小時生長之后，發(fā)現宿主株JOl和JlO產生141CP單位trichodiene/gCDW和151CP單位trichodiene/gCDW。發(fā)現親本株擬分枝孢鐮孢T-0927培養(yǎng)物產生14CP單位trichodienegCDW。實施例14該實施例說明了表達Tri6_Pl的宿主株中trichodiene的產生相對于親本株擬分枝孢鐮孢T-0927的產生增加。通過將每種株的儲備等分試樣在含潮霉素(150yg/mL)的V8瓊脂培養(yǎng)基上生長7至10日來建立宿主株IOl的接種培養(yǎng)物。使用細胞刮具從接種培養(yǎng)物收獲分生孢子，并用于以IxlO5個孢子/mL的起始數接種于不同的含有62.5mL的GYEP培養(yǎng)基(0.1%細菌用酵母提取物，0.1%細菌用蛋白胨和5%葡萄糖)的125mL燒瓶中。將培養(yǎng)物在28°C以200RPM在旋轉振蕩器上溫育24小時，在此時點將其用6.25mL十二烷覆蓋。在168小時之后，將45mL富集了有機層的培養(yǎng)材料轉移至50mL離心管，并在5000xg離心5分鐘，之后對有機覆蓋物層進行取樣。確定真菌菌絲體的干重量，即在預干燥和預稱重的過濾器上過濾培養(yǎng)材料，其在80°C干燥3日并稱重以生成培養(yǎng)物干重(CDW)。在分析之前，將體積為L的有機覆蓋物樣品添加至干凈玻璃小瓶中作為內標的996iiL含有石竹烯的異丙醇。將稀釋的有機覆蓋物樣品如實施例3中所述在Hewlett-Packard6890氣相色譜/質譜儀(GC/MS)上進行分析。在168小時生長之后，發(fā)現宿主株IOl產生117CP單位trichodiene/gCDW。發(fā)現親本株擬分枝孢鐮孢T-0927培養(yǎng)物產生27CP單位trichodienegCDW。權利要求1.一種產生trichodiene的突變體絲狀真菌,其具有單端孢霉烯途徑,所述途徑包含a)經破壞的Tri4基因或具有低P450單加氧酶產生的突變體Tri4基因；和b)經修飾的核酸序列，其編碼至少ー種選自下組的基因Tri5,Tri6和TrilO,所述序列經修飾使得所述絲狀真菌與親本絲狀真菌細胞相比，當在相同條件下培養(yǎng)時，多產生至少10%的trichodiene。2.權利要求I的突變體真菌，其中Tri5、Tri6或TrilO核酸序列中的至少ー種經修飾而給予所述基因在產生基因產物方面的組成型活性。3.權利要求I的突變體絲狀真菌，其中所述絲狀真菌選自下組枝頂孢霉屬(Acremonium)、曲霉屬(Aspergillus)、短梗霉屬(Aureobasidium)、隱球菌屬(Cryptococcus)、Filibasidium、祿抱屬(Fusarium)、赤霉屬(Gibberella)、腐質霉屬(Humicola)、梨抱菌屬(Magnaporthe)、毛霉屬(Mucor)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、漆斑菌屬(Myrothecium)、新考瑪脂霉屬(Neocallimastix)、脈抱菌屬(Neurospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(Penicillium)、瘤胃壺菌屬(Piromyces)、葡萄穗霉屬(Stachybotrys)、裂裙菌屬(Schizophyllum)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭抱殼屬(Thielavia)、彎頸霉屬(Tolypocladium)、木霉屬(Trichoderma)、或單端抱屬(Trichothecium)菌株。4.權利要求3的突變體絲狀真菌，其中所述絲狀真菌是錸孢屬菌種。5.權利要求4的突變體絲狀真菌,其中所述錸孢屬菌種是擬分枝孢錸孢(Fusariumsporotrichioides)NRRL3299。6.權利要求I的突變體絲狀真菌，其中Tri5、Tri6或TrilO核酸序列中的至少兩個經修飾。7.權利要求I的突變體絲狀真菌，其中編碼Tri4的核酸的部分或全部經非回復性位點選擇性缺失使得Tri4基因失活。8.權利要求I的突變體絲狀真菌，其中編碼Tri4的核酸的部分或全部經非回復性位點選擇性缺失或修飾，使得在相同條件下與親本株相比，Tri4基因產物的酶或催化活性減少至少10%。9.權利要求I的突變體絲狀真菌，其中b)的修飾序列包含多于ー個拷貝的編碼至少ー種選自Tri5、Tri6和TrilO的基因的核酸序列。10.權利要求9的突變體絲狀真菌，其中至少ー個額外拷貝的編碼至少一種選自Tri5、Tri6和TrilO的基因的核酸序列處于能夠在所述絲狀真菌中自主維持的載體中。11.權利要求I的突變體絲狀真菌，其中b)的經修飾的序列包含可操作連接于來自組成型活性的絲狀真菌基因的啟動子的基因的編碼。12.—種產生trichodiene的突變體絲狀真菌,其具有單端孢霉烯途徑,所述途徑包含a)經修飾的核酸序列,其編碼至少ー種選自下組的基因Tri5,Tri6和TrilO,所述序列經修飾而增加基因產物的產生；和b)足以抑制至少一部分Tri4基因產物的Tri4抑制劑的存在；其中所述絲狀真菌與親本絲狀真菌細胞相比，當在相同條件下培養(yǎng)時，多產生至少10%的trichodiene。13.權利要求I或12的突變體絲狀真菌，其中所述Tri5、Tri6或TrilO基因經修飾而增加FPP的產生。14.權利要求I或12的突變體絲狀真菌，其中所述Tri5、Tri6或TrilO基因經修飾而增加FPP至trichodiene的轉化。15.權利要求I或12的突變體絲狀真菌，其中所述Tri6和/或TrilO基因經修飾以至少減少Tri4基因產物的產生。16.產生trichodiene的方法,包括a)選擇突變體絲狀真菌，其具有單端孢霉烯途徑，所述途徑包含i.ー種或多種經破壞的Tri4基因，具有低P450單加氧酶產生的突變體Tri4基因，以及所述真菌，與Tri4基因產物抑制劑組合；ii.修飾的核酸序列，其編碼至少ー種選自下組的基因Tri5,Tri6和TrilO,所述序列經修飾以增加基因產物的產生；b)使用選自下組的生物質生長培養(yǎng)基培養(yǎng)所述突變體絲狀真菌糖、淀粉、纖維素和半纖維素；和c)從生長培養(yǎng)基分離trichodiene,其中所述絲狀真菌與親本絲狀真菌細胞相比，當在相同條件下培養(yǎng)時，多產生至少10%的trichodiene。17.權利要求16的產生trichodiene的方法,其中所述生物質生長培養(yǎng)基選自下組果膠、半乳糖醛酸、糖、淀粉、纖維素和半纖維素。18.權利要求16的方法，其中所述方法基本上是在生長培養(yǎng)基的產生源處進行。19.權利要求16的方法,其中所述絲狀真菌產生至少0.25gtrichodiene姆克消耗的葡萄糖或葡萄糖當量。20.權利要求16的方法，其中所述培養(yǎng)基包含木素纖維素原料。21.權利要求16的方法,其中所述絲狀真菌選自下組枝頂孢霉屬(Acremonium)、曲霉屬(Aspergillus)、短梗霉屬(Aureobasidium)、隱球菌屬(Cryptococcus)、Filibasidium、祿抱屬(Fusarium)、赤霉屬(Gibberella)、腐質霉屬(Humicola)、梨抱菌屬(Magnaporthe)、毛霉屬(Mucor)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、漆斑菌屬(Myrothecium)、新考瑪脂霉屬(Neocallimastix)、脈抱菌屬(Neurospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(Penicillium)、瘤胃壺菌屬(Piromyces)、葡萄穗霉屬(Stachybotrys)、裂裙菌屬(Schizophyllum)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭孢殼屬(Thielavia)、彎頸霉屬(Tolypocladium)、木霉屬(Trichoderma)、或單端孢屬(Trichothecium)菌株。22.權利要求20的方法，其中所述絲狀真菌是擬分枝孢錸孢NRRL3299。全文摘要本發(fā)明涉及從木素纖維素或其他原料產生C-15燃料。特別是具有類異戊二烯途徑的絲狀真菌的至少雙重突變體導致trichodiene以商業(yè)量產生。本發(fā)明的一個實施方案涉及在木素纖維素原料的原位產生燃料以減少運輸原料的成本。文檔編號C12P7/00GK102695787SQ201080044654公開日2012年9月26日申請日期2010年8月5日優(yōu)先權日2009年8月5日發(fā)明者T·M·霍恩申請人:諾維信公司