專利名稱：用于改進(jìn)重組蛋白表達(dá)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明借助于增加載體上的選擇壓力，從而增加載體相關(guān)的異源蛋白表達(dá)，在真核細(xì)胞中的重組蛋白表達(dá)領(lǐng)域中具有實(shí)際應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在重組蛋白產(chǎn)生領(lǐng)域中，增加轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)是細(xì)胞系發(fā)育期間的基本首要工作。改進(jìn)轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白質(zhì)折疊和分泌是增加異源蛋白效價(jià)的密集研究的所有目標(biāo)。無論過去所用方法如何，本領(lǐng)域中需要提供增加所需蛋白的產(chǎn)率的較好的用于重組蛋白產(chǎn)生的方法。

發(fā)明內(nèi)容
一方面，本發(fā)明提供一種用于增加宿主細(xì)胞中的異源蛋白表達(dá)的方法，所述方法包括以下步驟在允許蛋白表達(dá)的條件下培養(yǎng)包含編碼所述異源蛋白的第一異源多核苷酸序列的宿主細(xì)胞，所述第一多核苷酸在載體上編碼，所述宿主細(xì)胞進(jìn)一步包含具有針對(duì)選擇標(biāo)記蛋白的蛋白編碼序列的第二多核苷酸序列，所述第二多核苷酸與編碼所述選擇標(biāo)記蛋白的野生型多核苷酸相比具有序列修飾，所述序列修飾降低由所述第二多核苷酸編碼的mRNA的翻譯效率，具有所述序列修飾的所述第二多核苷酸和所述野生型多核苷酸編碼針對(duì)所述選擇標(biāo)記蛋白的相同氨基酸序列。一方面，所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸在單個(gè)載體中，且在這方面的一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一多核苷酸和第二多核苷酸各自受不同啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制。在其它方面，所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸在獨(dú)立載體中。另一方面，所述第一多核苷酸和第二多核苷酸受相同啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制。在所述方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述修飾在編碼所述選擇標(biāo)記蛋白的第二多核苷酸的非翻譯區(qū)中，且在某些方面，所述修飾在5'非翻譯區(qū)中和/或所述修飾在3'非翻譯區(qū)中。在所述方法的另一實(shí)施方案中，所述修飾在編碼所述選擇標(biāo)記蛋白的基因的蛋白編碼區(qū)中。一方面，所述修飾在針對(duì)選擇標(biāo)記基因編碼序列的蛋白編碼區(qū)的起始密碼子的25、20、15、10或5個(gè)密碼子中。在所述方法的另一方面，第二多核苷酸序列中的蛋白編碼序列包含至少一個(gè)被修飾的密碼子，所述密碼子并非編碼所述選擇標(biāo)記蛋白的野生型多核苷酸中的野生型密碼子，所述被修飾的密碼子作為密碼子，并非是針對(duì)所述宿主細(xì)胞編碼的所述氨基酸的偏好密碼子。一方面，第二多核苷酸序列中的蛋白編碼序列包含至少一個(gè)被修飾的密碼子，所述密碼子并非編碼所述選擇標(biāo)記蛋白的野生型多核苷酸中的野生型密碼子，所述被修飾的密碼子作為密碼子，是針對(duì)所述宿主細(xì)胞編碼的所述氨基酸的最不偏好密碼子。
在所述方法的另一方面，第二多核苷酸序列中的蛋白編碼序列包含至少一個(gè)被修飾的密碼子，所述密碼子并非編碼所述選擇標(biāo)記蛋白的野生型多核苷酸中的野生型密碼子，且所述修飾在所述mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)中引入了降低所述mRNA的翻譯效率的變化。在所述方法的一個(gè)實(shí)施方案中，第二多核苷酸序列中的蛋白編碼序列包含至少一個(gè)被修飾的密碼子，所述密碼子并非編碼所述選擇標(biāo)記蛋白的野生型多核苷酸中的野生型密碼子，且所述修飾增加mRNA中的密碼子配對(duì)。在所述方法的另一實(shí)施方案中，第二多核苷酸序列中的蛋白編碼序列包含至少一個(gè)被修飾的密碼子，所述密碼子并非編碼所述選擇標(biāo)記蛋白的野生型多核苷酸中的野生型密碼子，且所述修飾改變mRNA的G+C含量。在多個(gè)方面，所述修飾增加mRNA的G+C含量，且在多個(gè)方面，G+C含量增加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、
14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、
39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、 71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%。在其它方面，G+C 含量增加超過 100%。在所述方法的另一方面，第二多核苷酸序列中的蛋白編碼序列包含至少一個(gè)被修飾的密碼子，所述密碼子并非編碼所述選擇標(biāo)記蛋白的野生型多核苷酸中的野生型密碼子，且所述修飾可改變mRNA的A+T含量。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述修飾降低mRNA的A+T含量，且在某些方面，A+T 含量降低 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、
20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%。在所述方法的其它方面，在編碼所述選擇標(biāo)記蛋白的第二多核苷酸蛋白編碼序列中至少1%、至少2%、至少3%、至少4%、至少5%、至少6%、至少7%、至少8%、至少9%、至少10%、至少11%、至少12%、至少13%、至少14%、至少15%、至少16%、至少17%、至少18%、至少19%、至少20%、至少21%、至少22%、至少23%、至少24%、至少25%、至少26%、至少27%、至少28%、至少29%、至少30%、至少31%、至少32%、至少33%、至少34%、至少35%、至少36%、至少37%、至少38%、至少39%、至少40%、至少41%、至少42%、至少43%、至少44%、至少45%、至少46%、至少47%、至少48%、至少49%、至少50%、至少51%、至少52%、至少53%、至少54%、至少55%、至少56%、至少57%、至少58%、至少59%、至少60%、至少61%、至少62%、至少63%、至少64%、至少65%、至少66%、至少67%、至少68%、至少69%、至少70%、至少71%、至少72%、至少73%、至少74%、至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的密碼子為被修飾的密碼子。在所述方法的其它方面，選擇標(biāo)記蛋白是選自由以下組成的組新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(npt II)、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(hpt)、二氫葉酸還原酶(dhfr)、硫酸博來霉素(zeocin)、腐草霉素(phleomycin)、博來霉素抗性基因ble、慶大霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶、鏈霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶、乙酰乳酸合酶突變形式(als)、溴苯腈水解酶、草胺膦乙酰基轉(zhuǎn)移酶(bar)、烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸(EPSP)合酶(aro A)、肌肉特異性酪氨酸激酶受體分子(MuSK-R)、銅鋅超氧化物岐化酶(sodl)、金屬硫蛋白(cupl，MTl)、^ -內(nèi)酰胺酶(BLA)、嘌呤霉素N-乙?；?轉(zhuǎn)移酶(pac)、殺稻瘟菌素乙?；D(zhuǎn)移酶(bis)、殺稻瘟菌素脫氨酶(bsr)、組氨醇脫氫酶(HDH)、N-琥珀酰-5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸(SAICAR)合成酶(adel)、精氨基琥珀酸裂解酶(arg4)、￠-異丙基蘋果酸脫氫酶(leu2)、轉(zhuǎn)化酶(suc2)、乳清酸核苷-5’ -磷酸(OMP)脫羧酶(ura3)和這些標(biāo)記蛋白中任一者的直系同源物。在所述方法的多個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，宿主細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，宿主細(xì)胞是人細(xì)胞，宿主細(xì)胞是中國(guó)倉(cāng)鼠細(xì)胞，宿主細(xì)胞是中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞，宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞，宿主細(xì)胞是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)細(xì)胞,宿主細(xì)胞是畢赤酵母(Pichia pastoris)細(xì)胞,宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞,宿主細(xì)胞是大腸桿菌(Escherichia coli)細(xì)胞，宿主細(xì)胞是昆蟲細(xì)胞，宿主細(xì)胞是草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細(xì)胞,宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞，或宿主細(xì)胞是真菌細(xì)胞。 在所述方法的一方面，表達(dá)載體是(中國(guó)倉(cāng)鼠延伸因子I(CHEFl)表達(dá)載體。另一方面，所述方法利用包含圖2中展不的多核苷酸的第二多核苷酸,且在一個(gè)實(shí)施方案中,所述第二多核苷酸在(中國(guó)倉(cāng)鼠延伸因子I (CHEFl)表達(dá)載體中包含圖2中展示的多核苷酸。


圖IA為編碼DHFR的多核苷酸且圖IB為與小家鼠(Mus musculus) cDNABC005796相同的用于密碼子去優(yōu)化的DHFR多肽序列。圖2顯示密碼子去優(yōu)化的DHFR序列(稱為弱化(cr)和最差(wst))的DNA序列。圖3顯示與野生型(wt)序列對(duì)準(zhǔn)的去優(yōu)化的DHFR(最差的，wst和弱化的，cr)。指示了核苷酸變化(*)，包括倉(cāng)鼠最不偏好密碼子(參見表4)和新的串聯(lián)密碼子對(duì)(以粗體表示；參見表5)。簡(jiǎn)并符號(hào)為B(C或G或T)、D(A或G或T)、H(A或C或T)、V(A或C或G)。圖4顯示具有野生型(WT)DHFR的CHEFl表達(dá)載體pDEF38。密碼子去優(yōu)化的DHFR置換WT DHFR來制備pDEF81 (弱化DHFR)和pDEF82 (最差DHFR)。報(bào)告基因FIGI克隆至IjXhoI-XbaI 克隆位點(diǎn)中以制備 pDEF38: FIGI、pDEF81: FIGI 和 pDEF82: FIGI0圖5顯示使用密碼子去優(yōu)化的DHFR使得蛋白表達(dá)增加。CHO細(xì)胞用共表達(dá)目標(biāo)蛋白(FIGI)的野生型(wt)和密碼子去優(yōu)化的(弱化，pDEF81:FIGI和最差，pDEF82:FIGI)DHFR來轉(zhuǎn)染。由蛋白A HPLC測(cè)定并以U g/ml報(bào)告的效價(jià)值是兩次獨(dú)立轉(zhuǎn)染的平均值，每次轉(zhuǎn)染重復(fù)測(cè)量三次(總共6次產(chǎn)生測(cè)定)。結(jié)果指示密碼子去優(yōu)化的DHFR的所選轉(zhuǎn)染池的表達(dá)效價(jià)相對(duì)于野生型DHFR池具有明顯改進(jìn)。圖6展示轉(zhuǎn)染池分批補(bǔ)料產(chǎn)生模型在密碼子去優(yōu)化的細(xì)胞系中提供改進(jìn)的產(chǎn)生率。這一實(shí)驗(yàn)是在50ml離心管中用匯集的轉(zhuǎn)染子進(jìn)行12天；野生型(pDEF38:FIGI，藍(lán)色)和密碼子去優(yōu)化的(pDEF81:FIGI，紫色和pDEF82:FIGI，粉紅色)DHFR共表達(dá)目標(biāo)蛋白FIGI。兩個(gè)轉(zhuǎn)染池(A和B)重復(fù)進(jìn)行兩次。密碼子去優(yōu)化的池顯示比野生型樣品大的產(chǎn)生率。圖7顯示密碼子去優(yōu)化的DHFR的所選細(xì)胞的DHFR降低和目標(biāo)蛋白表達(dá)增加。CHO細(xì)胞用共表達(dá)目標(biāo)蛋白FIGI的野生型(T462)和密碼子去優(yōu)化的(pDEF81:FIGI，T463和pDEF82:FIGI，T464)DHFR來轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染池用熒光甲氨蝶呤(F-MTX)染色以檢測(cè)DHFR，并用熒光標(biāo)記的抗體染色以識(shí)別FIGI (RPE)。染色的細(xì)胞通過在FACSCalibur上進(jìn)行的流式細(xì)胞術(shù)來分析。圖7A顯示來自每次轉(zhuǎn)染的10，OOO個(gè)個(gè)別細(xì)胞的雙重染色FACS概況，對(duì)合并的DHFR (F-MTX)和FIGI (RPE = FIGI)表達(dá)繪圖。圖7B顯示來自兩個(gè)10，000個(gè)細(xì)胞的群體的對(duì)每次轉(zhuǎn)染取平均值所得到的平均F-MTX(DHFR)和RPE熒光強(qiáng)度。這些結(jié)果指示，與野生型細(xì)胞相比時(shí)，兩個(gè)密碼子去優(yōu)化的DHFR池的DHFR都降低并且FIGI產(chǎn)生都增加。圖8展示密碼子去優(yōu)化 的DHFR克隆的DHFR降低并且目標(biāo)蛋白表達(dá)增加。CHO細(xì)胞轉(zhuǎn)染池(野生型T462、弱化T463和最差T464)通過限制性稀釋來克隆，并且每次轉(zhuǎn)染擴(kuò)增23個(gè)確認(rèn)的單克隆細(xì)胞系?？寺〖?xì)胞用熒光甲氨蝶呤(DHFR RFU)染色以檢測(cè)DHFR，并用RPE標(biāo)記的抗FIGI熒光抗體(FIGI RFU)染色。來自每個(gè)克隆群體的總共10，000個(gè)染色的細(xì)胞通過在FACSCalibur上進(jìn)行的流式細(xì)胞術(shù)來分析。圖8A顯示F-MTX染色的細(xì)胞的平均熒光。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)是個(gè)別克隆。克隆按從低到高的平均熒光排序。圖SB顯示RPE染色的細(xì)胞的平均熒光。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)是個(gè)別克隆?？寺“磸牡偷礁叩钠骄鶡晒馀判?。圖9顯示與野生型克隆相比，密碼子去優(yōu)化的克隆具有改進(jìn)的產(chǎn)生率?？寺⌒r(jià)通過對(duì)在第8天從6孔產(chǎn)生模型采集的上清液進(jìn)行蛋白A HPLC來測(cè)定?？寺“磸母叩降偷男r(jià)排序。與野生型DHFR克隆(pDEF38:FIGI)相比，密碼子去優(yōu)化的克隆pDEF81 :FIGI和pDEF82:FIGI顯示較大的FIGI產(chǎn)生率。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供一種新的產(chǎn)生表達(dá)載體的方法和其用途，它們改進(jìn)重組蛋白產(chǎn)率。本發(fā)明的載體允許增加宿主細(xì)胞中目標(biāo)基因(GOI)的表達(dá)和降低共轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)記的翻譯效率，從而增加選擇嚴(yán)格度。選擇標(biāo)記用于轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中以補(bǔ)足宿主細(xì)胞蛋白缺陷或?qū)α硗獾亩拘詣┵x予抗性，從而選擇目標(biāo)共轉(zhuǎn)化基因的存在(表達(dá))。設(shè)計(jì)提供選擇標(biāo)記蛋白的降低的翻譯效率的載體，使得編碼所述選擇標(biāo)記蛋白的多核苷酸關(guān)于一個(gè)或多個(gè)參數(shù)“去優(yōu)化”。所提供載體在實(shí)踐用于增強(qiáng)重組蛋白表達(dá)的材料和方法中的使用是違反直覺的。實(shí)際上，改進(jìn)的蛋白表達(dá)通常受“優(yōu)化”編碼目標(biāo)蛋白的多核苷酸的作用，從而增加翻譯效率和蛋白表達(dá)。通過延伸，將以相同方式優(yōu)化針對(duì)選擇標(biāo)記基因的蛋白編碼區(qū)。然而，本文中意外地顯示修飾編碼選擇標(biāo)記基因序列的多核苷酸使其不優(yōu)選用于翻譯(與在目標(biāo)基因中進(jìn)行類似變化無關(guān))，允許分離用編碼GOI的多核苷酸和編碼選擇標(biāo)記的多核苷酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，其中由GOI編碼的蛋白以意外的較高水平表達(dá)。因此，本文關(guān)于多核苷酸所用的術(shù)語“去優(yōu)化”意指多核苷酸已以某一方式被修飾，使得由所述多核苷酸編碼的蛋白的翻譯不優(yōu)選用于已經(jīng)引入所述多核苷酸的宿主細(xì)胞。多核苷酸以多種方式去優(yōu)化，且本發(fā)明不受本文所示例的方法限制。用于密碼子優(yōu)化的方法已經(jīng)由他人描述(Itakura 1987, Kotula 1991, Holler1993, Seed 1998)。然而，關(guān)于密碼子去優(yōu)化效用的實(shí)例很有限。一個(gè)這種實(shí)例是將病毒基因去優(yōu)化以通過并入最不偏好密碼子或非隨機(jī)化密碼子對(duì)來降低復(fù)制適應(yīng)性(Burns2006, Mueller 2006, Coleman2008, Kew 2008)。本文描述了通過并入物種特異性最不偏好密碼子和串聯(lián)密碼子對(duì)來降低用于宿主細(xì)胞的dhfr基因的翻譯效率的方法考慮。所提供的方法通?？蛇m用于針對(duì)物種特異性宿主來去優(yōu)化編碼任何選擇標(biāo)記的多核苷酸中的密碼子。不受任何特定作用機(jī)制的限制，減少選擇標(biāo)記的翻譯可導(dǎo)致經(jīng)由除翻譯外的替代路徑的同種蛋白質(zhì)產(chǎn)生的補(bǔ)償性增加，例如但不限于增加的轉(zhuǎn)錄或分泌，以使得具有無效基因的細(xì)胞能夠存活。因此，能夠克服標(biāo)記基因的無活力并因此存活的宿主細(xì)胞也可以增加的速率表達(dá)G0I。不考慮精確的機(jī)制，本文意外地顯示與傳統(tǒng)認(rèn)知相反，以降低翻譯效率的方式修飾選擇標(biāo)記基因的多核苷酸序列由于某種原因增加共轉(zhuǎn)化的編碼GOI的基因的表達(dá)。本發(fā)明的載體和方法可與提供陽性選擇的任何選擇標(biāo)記基因一起使用。示例性選擇標(biāo)記包括但不限于抗生素抗性基因編碼的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(npt II)、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(hpt)、二氫葉酸還原酶(dhfr)、硫酸博來霉素、腐草霉素、博來霉素抗性基因ble (未知 酶)、慶大霉素乙?；D(zhuǎn)移酶、鏈霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶、乙酰乳酸合酶突變形式(als)、溴苯腈水解酶、草胺膦乙?；D(zhuǎn)移酶(bar)、烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸(EPSP)酶(aro A)、肌肉特異性酪氨酸激酶受體分子(MuSK-R)、銅鋅超氧化物岐化酶(sodl)、金屬硫蛋白(cupl, MTl)、
內(nèi)酰胺酶(BLA)、嘌呤霉素N-乙?；?轉(zhuǎn)移酶(pac)、殺稻瘟菌素乙?；D(zhuǎn)移酶(bis)、殺稻瘟菌素脫氨酶(bsr)、組氨醇脫氫酶(HDH)、N_琥珀酰-5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸(SAICAR)合成酶(adel)、精氨基琥拍酸裂解酶(arg4)、P _異丙基蘋果酸脫氫酶(leu2)、轉(zhuǎn)化酶(suc2)和乳清酸核苷_5’ -磷酸(OMP)脫羧酶(ura3)。本領(lǐng)域中眾所周知的是，遺傳密碼陳述的密碼子指導(dǎo)在所翻譯的多肽中添加特定氨基酸。本領(lǐng)域中也眾所周知的是，20種天然存在的氨基酸是由不同數(shù)目的密碼子編碼，這些數(shù)目對(duì)于每種氨基酸來說在I到6個(gè)不同密碼子的范圍變動(dòng)。如本文所用，編碼相同氨基酸的不同密碼子被稱為“同義密碼子”。這些同義密碼子陳述于下表I中。表I-遺傳密碼
權(quán)利要求
1.一種用于增加宿主細(xì)胞中異源蛋白表達(dá)的方法，所述方法包括以下步驟在允許蛋白表達(dá)的條件下培養(yǎng)包含編碼所述異源蛋白的第一異源多核苷酸序列的所述宿主細(xì)胞，所述第一多核苷酸在載體上編碼，所述宿主細(xì)胞進(jìn)一步包含具有針對(duì)選擇標(biāo)記蛋白的蛋白編碼序列的第二多核苷酸序列，所述第二多核苷酸與編碼所述選擇標(biāo)記蛋白的野生型多核苷酸相比具有序列修飾，所述序列修飾降低由所述第二多核苷酸編碼的mRNA的翻譯效率，所述序列修飾、具有所述序列修飾的所述第二多核苷酸和所述野生型多核苷酸編碼針對(duì)所述選擇標(biāo)記蛋白的相同氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸在單個(gè)載體中。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述第一多核苷酸和第二多核苷酸各自受不同啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法,其中所述第一多核苷酸和第二多核苷酸各自受單個(gè)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸在獨(dú)立載體中。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述修飾在編碼所述選擇標(biāo)記蛋白的所述第二多核苷酸的非翻譯區(qū)中。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述修飾在5'非翻譯區(qū)中。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述修飾在3'非翻譯區(qū)中。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述修飾在編碼所述選擇標(biāo)記蛋白的所述基因的蛋白編碼區(qū)中。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述修飾具有針對(duì)所述選擇標(biāo)記基因的所述蛋白編碼區(qū)的起始密碼子的25、20、15、10或5個(gè)密碼子。
11.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述第二多核苷酸序列中的所述蛋白編碼序列包含至少一個(gè)被修飾的密碼子，所述密碼子并非編碼所述選擇標(biāo)記蛋白的野生型多核苷酸中的野生型密碼子，所述被修飾的密碼子作為密碼子，并非是針對(duì)所述宿主細(xì)胞編碼的所述氨基酸的偏好密碼子。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述第二多核苷酸序列中的所述蛋白編碼序列 含至少一個(gè)被修飾的密碼子，所述密碼子并非編碼所述選擇標(biāo)記蛋白的野生型多核苷酸中的野生型密碼子，所述被修飾的密碼子作為密碼子，是針對(duì)所述宿主細(xì)胞編碼的所述氨基酸的最不偏好密碼子。
13.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述第二多核苷酸序列中的所述蛋白編碼序列包含至少一個(gè)被修飾的密碼子，所述密碼子并非編碼所述選擇標(biāo)記蛋白的野生型多核苷酸中的野生型密碼子，且所述修飾在所述mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)中引入了降低所述mRNA的翻譯效率的變化。
14.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述第二多核苷酸序列中的所述蛋白編碼序列包含至少一個(gè)被修飾的密碼子，所述密碼子并非編碼所述選擇標(biāo)記蛋白的野生型多核苷酸中的野生型密碼子，且所述修飾增加所述mRNA中的密碼子配對(duì)。
15.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述第二多核苷酸序列中的所述蛋白編碼序列包含至少一個(gè)被修飾的密碼子，所述密碼子并非編碼所述選擇標(biāo)記蛋白的野生型多核苷酸中的野生型密碼子，且所述修飾改變所述mRNA的G+C含量。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述修飾增加所述mRNA的G+C含量。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述G+C含量被改變1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%。
18.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述第二多核苷酸序列中的所述蛋白編碼序列包含至少一個(gè)被修飾的密碼子，所述密碼子并非編碼所述選擇標(biāo)記蛋白的野生型多核苷酸中的野生型密碼子，且所述修飾改變所述mRNA的A+T含量。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述修飾降低所述mRNA的A+T含量。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述A+T含量被改變1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%。
21.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述第二多核苷酸蛋白編碼序列中的至少1%、至少2%、至少3%、至少4%、至少5%、至少6%、至少7%、至少8%、至少9%、至少10%、至少11%、至少12%、至少13%、至少14%、至少15%、至少16%、至少17%、至少18%、至少19%、至少20%、至少21%、至少22%、至少23%、至少24%、至少25%、至少26%、至少27%、至少28%、至少29%、至少30%、至少31%、至少32%、至少33%、至少34%、至少35%、至少36%、至少37%、至少38%、至少39%、至少40%、至少41%、至少42%、至少43%、至少44%、至少45%、至少46%、至少47%、至少48%、至少49%、至少50%、至少51%、至少52%、至少53%、至少54%、至少55%、至少56%、至少57%、至少58%、至少59%、至少60%、至少61%、至少62%、至少63%、至少64%、至少65%、至少66%、至少67%、至少68%、至少69%、至少70%、至少71%、至少72%、至少73%、至少74%、至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的密碼子是被修飾的密碼子。
22.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述選擇標(biāo)記蛋白是選自由以下組成的組新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(npt II)、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(hpt)、二氫葉酸還原酶(dhfr)、硫酸博來霉素、腐草霉素、博來霉素抗性基因ble (未知酶)、慶大霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶、鏈霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶、乙酰乳酸合酶突變形式(als)、溴苯腈水解酶、草胺膦乙酰基轉(zhuǎn)移酶(bar)、烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸(EPSP)合酶(aro A)、肌肉特異性酪氨酸激酶受體分子(MuSK-R)、銅鋅超氧化物岐化酶(sodl)、金屬硫蛋白(cupl,MTl)、^ -內(nèi)酰胺酶(BLA)、嘌呤霉素N-乙酰基-轉(zhuǎn)移酶(pac)、殺稻瘟菌素乙?；D(zhuǎn)移酶(bis)、殺稻瘟菌素脫氨酶(bsr)、組氨醇脫氫酶(HDH)、N-琥珀酰-5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸(SAICAR)合成酶(adel)、精氨基琥珀酸裂解酶(arg4)、0 -異丙基蘋果酸脫氫酶(leu2)、轉(zhuǎn)化酶(suc2)和乳清酸核苷_5’_磷酸(OMP)脫羧酶(ura3)。
23.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞。
24.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞。
25.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌。
26.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞是釀酒酵母。
28.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞是畢赤酵母。
29.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞是昆蟲細(xì)胞。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞是草地貪夜蛾。
31.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞。
32.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞是原生動(dòng)物細(xì)胞。
33.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
34.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞是人細(xì)胞。
35.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞是中國(guó)倉(cāng)鼠細(xì)胞。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞是中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞。
37.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述表達(dá)載體是中國(guó)倉(cāng)鼠延伸因子I(CHEFl)表達(dá)載體。
38.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述第二多核苷酸包含圖2中展示的多核苷酸。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述表達(dá)載體是中國(guó)倉(cāng)鼠延伸因子I(CHEFl)表達(dá)載體。
全文摘要
本發(fā)明提供允許增加重組宿主細(xì)胞中目標(biāo)轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)的材料和方法。
文檔編號(hào)C12P21/06GK102648285SQ201080044475
公開日2012年8月22日 申請(qǐng)日期2010年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月6日
發(fā)明者豪爾·羅伯特·葛萊罕·克拉克 申請(qǐng)人:Cmc依科斯生技制品公司