專利名稱：診斷或預(yù)測hcv感染的患者中丙型肝炎后果的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及確定被 丙型肝炎感染的受試者對丙型肝炎治療無反應(yīng)的易感性或丙型肝炎自發(fā)清除的易感性的體外方法。
背景技術(shù)：
丙型肝炎病毒(HCV)是慢性感染超過2億人(約占世界人ロ 3 % )的單鏈RNA病毒[1-4]。丙型肝炎病毒(HCV)的急性感染在20-50%的人中導(dǎo)致達到永久控制HCV的廣泛的先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)[5]。不能清除所述病毒導(dǎo)致慢性丙型肝炎。慢性感染伴隨高發(fā)病率和致死率，主要由向肝硬化和肝細胞癌的發(fā)展引起[6]。目前聚こニ醇化干擾素和利巴韋林(PEG-IFN/RBV)的標準療法在30-80%的慢性感染個體中導(dǎo)致持續(xù)的反應(yīng)率[7_9]。更多的證據(jù)表明宿主遺傳因子影響慢性丙型肝炎感染的自然過程和對治療的反應(yīng)[10-13]。在于相似條件下由被單鏈HCV污染的免疫球蛋白制劑感染的兩組懷孕婦女中，一半自發(fā)地清除了所述感染，一半發(fā)展為慢性丙型肝炎[14，15]。在慢性感染的患者中，即使在具有相似HCV-RNA水平和相同基因型的病例之間，對治療的反應(yīng)也不同[6，7，9]。反應(yīng)率與種族和性別強烈相關(guān)[16]。之前的報告掲示了人白細胞抗原(HLA) [10，13]、殺傷免疫球蛋白狀受體(KIR) [17]、細胞因子(W000/08215)、趨化因子和白細胞介素以及干擾素刺激基因[18-22]的遺傳多態(tài)性對HCV感染后果的影響。之前的研究已經(jīng)使用以基因在HCV感染中的可能作用的現(xiàn)有知識為基礎(chǔ)的候選基因方法。然而，之前的數(shù)據(jù)不能精確預(yù)測自發(fā)清除或?qū)χ委煹姆磻?yīng)[13]。盡管有上述方法，仍然強烈需要開發(fā)確定患慢性丙型肝炎的受試者中對抗丙型肝炎治療無反應(yīng)的易感性、或丙型肝炎急性感染的受試者中自發(fā)或非自發(fā)的丙型肝炎清除的易感性的有效預(yù)測方法。迄今，尚未開發(fā)出克服此問題的有效方法或策略。

發(fā)明內(nèi)容
此目的已通過提供確定患丙型肝炎的受試者中對丙型肝炎治療無反應(yīng)的易感性的方法而實現(xiàn)，所述方法包括確定從來自所述受試者的生物樣本中分離的核酸樣本中IL28B/A和/或IL-29基因座內(nèi)至少ー種多態(tài)性標志的存在與否。本發(fā)明另一目的是提供確定丙型肝炎感染受試者中非自發(fā)丙型肝炎清除的易感性的方法，所述方法包括確定從來自所述受試者的生物樣本中分離的核酸樣本中IL28B/A和/或IL-29基因座內(nèi)至少ー種多態(tài)性標志的存在與否。本發(fā)明另一目的是提供治療慢性丙型肝炎患者的方法，包括i)確定至少ー種所述患者的多態(tài)性標志是否位于從來自所述受試者的生物樣本中分離的核酸樣本的IL28B/A和/或IL-29基因座內(nèi)，其中所述至少一種所述患者的多態(tài)性標志選自rsll879005、rsl2975799、 rsll083519, rs955155, rsl2972991, rsl2980275, rs8105790, rsll881222,rsl0853727, rs8109886, rs8113007, rs8099917, rs7248668, rsl6973285, rsl0853728,rs4803223, rsl2980602, rs4803224, rs664893, rs576832, rsll671087, rs251910,rs7359953, rs7359950, rs2099331, rsll665818, rs570880, rs503355,rs30461,rsl94014,rs251903, rsl2979175, rs39587、rs30480 ；ii)基于所述至少一種所述患者的多態(tài)性標志
是否與對丙型肝炎治療無反應(yīng)的易感性增加相關(guān)而治療患者。本發(fā)明又另一目的是治療慢性丙型肝炎患者的方法，包括i)確定至少一種所述患者的多態(tài)性標志是否位于從來自所述受試者的生物樣本中分離的核酸樣本的IL 2 8 B /A和/或IL-29基因座內(nèi)，其中所述至少一種所述患者的多態(tài)性標志選自rsll879005、rsl2975799、 rsll083519, rs955155, rsl2972991, rsl2980275, rs8105790, rsll881222,rsl0853727, rs8109886, rs8113007, rs8099917, rs7248668, rsl6973285, rsl0853728,rs4803223, rsl2980602, rs4803224, rs664893, rs576832, rsll671087, rs251910,rs7359953, rs7359950, rs2099331, rsll665818, rs570880, rs503355, rs30461,rsl94014,rs251903, rsl2979175，rs39587、rs30480 ；ii)確定從來自所述患者的生物樣本中分離的核酸樣本中的HCV病毒基因型；iii)基于所述至少一種所述患者的多態(tài)性標志和HVC基因 型是否與對丙型肝炎治療無反應(yīng)的易感性增加相關(guān)而治療患者。本發(fā)明還提供評估患慢性丙型肝炎的受試者中對丙型肝炎治療無反應(yīng)的易感性的方法，所述方法包括i)通過確定從所述受試者的生物樣本中分離的核酸樣本的IL28B/A和/或IL-29基因座內(nèi)至少一種多態(tài)性標志的存在與否而辨別所述受試者中具有對丙型肝炎治療無反應(yīng)的易感性的患者，所述至少一種多態(tài)性標志的存在是所述受試者具有增加的對丙型肝炎治療無反應(yīng)的易感性的指征；ii)建立丙型肝炎治療方案。本發(fā)明還涉及評估患慢性丙型肝炎的受試者中對丙型肝炎治療無反應(yīng)的易感性的方法，所述方法包括i)通過確定—從來自所述受試者的生物樣本中分離的核酸樣本的IL28B/A和/或IL-29基因座內(nèi)至少一種多態(tài)性標志的存在與否，所述至少一種多態(tài)性標志的存在是所述受試者具有增加的對丙型肝炎治療無反應(yīng)的易感性的指征，和-HCV病毒基因型，基因型I或4的存在是所述受試者具有增加的對丙型肝炎治療無反應(yīng)的易感性的指征，從而辨別所述受試者中具有對丙型肝炎治療無反應(yīng)的易感性的患者；ii)建立丙型肝炎治療方案。本發(fā)明還涉及用于根據(jù)本發(fā)明確定患慢性丙型肝炎的受試者中對丙型肝炎治療無反應(yīng)的易感性的試劑盒，所述試劑盒包含i)用于選擇性檢測從來自所述受試者的生物樣本中分離的核酸樣本中位于IL28B/A和/或IL-29基因座內(nèi)至少一種多態(tài)性標志的存在與否的試劑和ii)使用說明書。本發(fā)明還提供用于根據(jù)本發(fā)明確定丙型肝炎感染受試者中非自發(fā)丙型肝炎清除的易感性的試劑盒，所述試劑盒包含i)用于選擇性檢測從來自所述受試者的生物樣本中分離的核酸樣本中位于IL28B/A和/或IL-29基因座內(nèi)至少一種多態(tài)性標志的存在與否的試劑和ii)使用說明書。


圖I是Manhattan圖。示出了全部2. 5M輸入的單核苷酸多態(tài)性(SNP)的P值(以-IoglO為刻度)。圖2是感染群體中的基因型分布。(A)與慢性感染的個體相比，在HCV自發(fā)清除的個體中含有G-等位基因的基因型減少。(B)在瑞士丙型肝炎群體研究中(Swiss HepatitisC Cohort Study, SCCS)，下面三組患者中的G等位基因的頻率增加自發(fā)病毒清除的患者<治療后清除的患者(即對治療有反應(yīng)者)<對治療無反應(yīng)的患者。圖3是不同SNP的P值的圖示，顯示出在IL28B單倍型域中自發(fā)清除和對治療無反應(yīng)的一致的關(guān)聯(lián)模式。(A)單倍型域。最強的遺傳關(guān)聯(lián)位于最接近IL28B基因的單倍型域中。(B)IL28B/A和IL-29基因座中SNP與HCV的遺傳關(guān)聯(lián)。位于IL28B和IL28A附近的SNP的強關(guān)聯(lián)對于兩個終點——自發(fā)丙型肝炎清除和基于干擾素的治療無反應(yīng)——均存在。
具體實施方式

本發(fā)明涉及確定患丙型肝炎的受試者中對丙型肝炎治療無反應(yīng)的易感性的方法，所述方法包括確定從來自所述受試者的生物樣本中分離的核酸樣本中IL28B/A和/或IL-29基因座內(nèi)至少ー種多態(tài)性標志的存在與否。本發(fā)明還涉及確定丙型肝炎感染受試者中非自發(fā)丙型肝炎清除的易感性的方法，所述方法包括確定從來自所述受試者的生物樣本中分離的核酸樣本中IL28B/A和/或IL-29基因座內(nèi)至少ー種多態(tài)性標志的的存在與否。盡管與本文所述方法和材料類似或等同的方法和材料可用于實施或測試本發(fā)明，下文仍然描述了合適的材料和方法。所有本文提及的出版物、專利申請、專利和其他參考文獻都以引用的方式全文納入本文。提供本文討論的出版物和申請僅由于其公開在本申請?zhí)峤蝗罩啊１疚娜魏蝺?nèi)容都不應(yīng)理解為承認本發(fā)明無權(quán)因現(xiàn)有的發(fā)明而先于這些出版物。此外，所述材料、方法和實例僅為示例而并非意圖進行限制。除非另有指出，否則本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都具有本文主題所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的相同含義。給出本文使用的以下定義以幫助對本發(fā)明的理解。術(shù)語“包含”常用意義包括，即允許一種或多種特征或成分的存在。除非上下文另有明確指出，本說明書和所附權(quán)利要求所用的単數(shù)形式“ a”、“an”、“the”也包括復(fù)數(shù)指代物。本文使用的“持續(xù)的病毒反應(yīng)”被定義為治療終止超過24周后檢測不到的病毒血癥。本文所用的“至少ー種”是指“ー種或多種”。本文所用的術(shù)語“受試者”或“患者”為本領(lǐng)域公知，并在本文中互換使用，是指哺乳動物，包括狗、貓、大鼠、小鼠、猴、奶牛、馬、山羊、綿羊、豬、駱騎，以及最優(yōu)選地，人。在某些實施方案中，所述受試者是需要丙型肝炎治療的受試者。然而，在其他實施方案中，所述受試者可為正常人。術(shù)語“受試者”或“患者”不指示特定年齡或性別。因此，意圖涵蓋不論男女的成人、嬰兒和新生兒受試者?；蛘?，所述受試者或患者被人免疫缺陷病毒(HIV)優(yōu)選HIV-I或HIV-2共感染。本文使用的術(shù)語“易感性”是指所述受試者對丙型肝炎治療無反應(yīng)的可能性或傾向，或者是指所述受試者非自發(fā)丙型肝炎清除的傾向。本文使用的“等位基因”，是指細胞、個體內(nèi)或群體中特定形式的遺傳序列或者遺傳序列(例如基因)內(nèi)的單核苷酸位點，所述特定形式在所述基因的序列內(nèi)的至少ー個且通常多個變體位點的序列上不同于所述相同基因的其他形式。所述序列可能在基因內(nèi)，也可能不在基因內(nèi)。在不同等位基因之間不同的這些變體位點處的序列被稱為“差異(variance) ”、“多態(tài)性(polymorphism) ”或“突變(mutation) ”。在姆個常染色體特定的染色體位置或“基因座”上，個體具有兩個等位基因，一個遺傳自ー個親本，另ー個遺傳自另ー個親本，例如ー個來自母親，另ー個來自父親。本文所用的“多態(tài)性”是指群體中兩種或多種遺傳決定的可選序列的出現(xiàn)?！岸鄳B(tài)性標志”或位點是出現(xiàn)趨異(divergence)的基因座。優(yōu)選的標志具有至少兩種等位基因，每ー種在選定群體中出現(xiàn)的頻率優(yōu)選大于1%，更優(yōu)選大于10%或20%。一個多態(tài)性可包含ー個或多個堿基改變、插入、重復(fù)或缺失。一個多態(tài)基因座可小至ー個堿基對。多態(tài)性標志包括限制性片段長度多態(tài)性、數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)序列(VNTR)、高變區(qū)、小衛(wèi)星序列、ニ核苷酸重復(fù)序列、三核苷酸重復(fù)序列、四核苷酸重復(fù)序列、簡單序列重復(fù)序列、拷貝數(shù)變異(CNV)和插入元件例如Alu。首先識別的等位基因形式被隨意稱作參考形式，其他等位基因形式被稱作可選的或變異的等位基因。在選定群體中最常出現(xiàn)的等位基因形式有時稱為野生型形式。雙等位基因多態(tài)性有兩種形式。三等位基因多態(tài)性有三種形式。兩種核酸之間的多態(tài)性可天然存在，或通過暴露于或接觸化學(xué)品、酶或其他試劑或者暴露于導(dǎo)致核酸破壞的試劑如紫外線照射、誘變劑或致癌物而引起。ー種具體的多態(tài)性，稱為單核苷酸多態(tài)性或SNP，是可見于人DNA序列內(nèi)的微小遺傳改變或變異。遺傳密碼用四個核苷酸“字母”A (腺嘌呤)、C(胞嘧啶)、T (胸腺嘧啶)和G(鳥嘌呤)表示。當單核苷酸例如A取代其他三個核苷酸字母C、G或T之一時出現(xiàn)SNP變異。本文所用的術(shù)語“丙型肝炎病毒”或“HCV”用于定義導(dǎo)致丙型肝炎(也稱為非甲型、非こ型肝炎)的病原菌株的RNA病毒種?；贖CV分離株之間的遺傳差異，所述丙型肝炎病毒種被分為6個基因型(1-6)，每個基因型內(nèi)又分幾個亞型。亞型基于其遺傳多樣性被進ー步分為準種(quasi specie) 0 HVB基因型的優(yōu)勢和分布在全世界范圍內(nèi)有所不同。例如，在北美，基因型Ia占優(yōu)勢，然后依次是lb、2a、2b和3a。在歐洲，基因型Ib占優(yōu)勢，然后依次是2a、2b、2c和3a?；蛐?和5幾乎僅在非洲發(fā)現(xiàn)。在臨床上，所述病毒基因型對于確定對基于干擾素的治療的可能反應(yīng)以及所述治療所需的持續(xù)時間是重要的?；蛐虸和4對基于干擾素的治療的反應(yīng)通常較所述其他基因型(2、3、5和6)為低。應(yīng)注意基因型5和6在群體中很少見。“丙型肝炎”是由丙型肝炎病毒(HCV)引起的感染肝臟的傳染性疾病。所述傳染經(jīng)常無癥狀，但是一旦被感染，慢性丙型肝炎感染可發(fā)展為肝臟的疤痕化(纖維化)以及通常在許多年后才顯現(xiàn)的晩期疤痕化(肝硬化)。在某些病例中，患有肝硬化的患者會繼續(xù)發(fā)展成肝功能衰竭或其他肝硬化的并發(fā)癥，包括肝癌?！奥员透窝住北欢x為持續(xù)超過6個月的丙型肝炎病毒的感染。臨床上，其經(jīng) 常無癥狀(沒有癥狀)并且其大部分是被偶然發(fā)現(xiàn)的。慢性丙型肝炎的自然過程在人與人之間有很大不同。盡管幾乎所有感染HCV的人的肝活組織檢查均有炎癥跡象，然而肝臟疤痕化(纖維化)的發(fā)生率在個體中顯示出顯著差異。由于可用于檢測此病毒的時間有限，因此難以建立對所述風險隨時間的精確評估。丙型肝炎病毒(HCV)被鑒定后不久，用對所述病毒的抗體在人中進行的若干橫斷研究(cross-sectional study)表明某些人似乎表現(xiàn)出“自發(fā)丙型肝炎清除”,而其他人保持病毒血癥狀態(tài)。從那以后，若干研究者盡力表征丙型肝炎感染的發(fā)病機理，包括自發(fā)病毒清除率、時程和預(yù)測物。清除率的估計值的范圍為10-50%，并且在某些病例中清除的持續(xù)時間被發(fā)現(xiàn)長達3年。權(quán)威的臨床綜述通常提到清除率低至10-15%。本文中的“非自發(fā)丙型肝炎清除”是指患者不顯現(xiàn)自發(fā)清除，從而所述感染會發(fā)展為慢性丙型肝炎的情況。出于清楚的目的，其不指治療引起的清除。“IL28B/A和/或IL-29基因座”通常指位于人染色體19長臂中編碼三種細胞因子基因即IL28B、IL28A和IL29(其屬于IFNA家族)的80kb區(qū)域內(nèi)的基因組DNA區(qū)。這三個基因具有數(shù)個外顯子，IL-28(也稱為IFNA 1)5個外顯子，IL_28A(IFNA2)和IL-28B(IFNA3)6個外顯子。它們編碼20kDa的單體分泌蛋白。最近已報道，IL28B、IL28A
和IL29細胞因子可為用于治療對IFN a有抗性或變得有抗性的HCV感染患者的重要IFNa替代物([38])。對于本發(fā)明確定患丙型肝炎的受試者中對丙型肝炎治療無反應(yīng)的易感性的方法，所述至少一種多態(tài)性標志的存在表明所述受試者具有增加的對丙型肝炎治療無反應(yīng)的易感性。另一方面，對于本發(fā)明確定丙型肝炎感染受試者中非自發(fā)丙型肝炎清除的易感性的方法，所述至少一種多態(tài)性標志的存在表明所述受試者具有增加的自發(fā)丙型肝炎清除的易感性。若干方法可用于分析至少一種單核苷酸多態(tài)性(SNP)的存在與否，所述方法可用于從來自所述受試者的生物樣本分離的核酸樣本中的IL28B/A和/或IL-29基因座。用于檢測多態(tài)性或突變的測定分為幾類，包括但不限于直接測序測定、片段多態(tài)性測定、雜交測定和基于計算機的數(shù)據(jù)分析。用于進行這些測定的多種變型的方案以及市售的試劑盒或服務(wù)均可得到。在某些實施方案中，測定結(jié)合或混合進行(例如結(jié)合來自數(shù)種測定的不同試劑或技術(shù)以形成一種測定)。如下測定可用于本發(fā)明，并對于檢測在IL28B/A和/或IL-29基因座中發(fā)現(xiàn)的不同SNP進行了描述。在本發(fā)明的一個方面，使用直接測序技術(shù)來檢測SNP。在這些測定中，首先使用任意合適的方法從受試者中分離DNA樣本。在某些實施方案中，目的區(qū)域被克隆到合適的載體中并通過在宿主細胞(例如細菌)中生長擴增。在其他實施方案中，使用聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增目的區(qū)域中的DNA。擴增后，使用任意合適的方法對目的區(qū)域(例如含有所述SNP的區(qū)域)中的DNA進行測序，包括但不限于使用放射性標記核苷酸的人工測序，或者自動測序。測序結(jié)果使用任意合適的方法顯示。檢查所述序列并確定給定SNP的存在與否。在本發(fā)明的一個方面，使用基于PCR的測定來檢測SNP。在某些實施方案中，所述PCR分析包括使用寡核苷酸引物(“引物”)來擴增含有目的重復(fù)多態(tài)性的片段。靶標多核苷酸序列的擴增可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意方法進行。參見例如[41]和[42]。擴增方法包括但不限于包括實時PCR(RT-PCR)的PCR、鏈置換擴增[43] [44]、使用Phi29DNA聚合酶的鏈置換擴增(美國專利5，001，050)、基于轉(zhuǎn)錄的擴增[45]、自主序列復(fù)制("3SR")[46][47]、Q β復(fù)制酶系統(tǒng)([48] [49])、基于核酸序列的擴增("NASBA" )(_、修復(fù)鏈式反應(yīng)("RCR" ) ([50]，見上文)和回旋鏢(boomerang) DNA 擴增("BDA" ) ([50]) PCR是擴增靶標多核苷酸序列的優(yōu)選方法。PCR可依照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)進行。通常，PCR首先包括用擴增引物對處理核酸樣本(例如在熱穩(wěn)定DNA聚合酶的存在下)。所述引物對中的一條引物與靶標多核苷酸序列的一條鏈雜交。所述引物對中的第二條引物與所述靶標多核苷酸序列的另一條鏈即互補鏈雜交。所述引物與其靶標多核苷酸序列鏈在以下條件下雜交即與每條核酸鏈互補的每條引物的延伸產(chǎn)物被合成。從每條引物合成的延伸產(chǎn)物，當與其互補物分離時，可用作合成另一條引物的延伸產(chǎn)物的模板。在引物延伸后，將所述樣本處理至退火條件以使所述引物延伸產(chǎn)物與其模板分離。循環(huán)重復(fù)這些步驟直至獲得所需程度的擴增。擴增的靶標多核苷酸可用于本文他處記載的檢測測定之一以識別擴增的靶標多核苷酸序列中存在的GT-重復(fù)多態(tài)性。在本發(fā)明的ー個方面，使用片段長度多態(tài)性測定來檢測SNP。在片段長度多態(tài)性測 定中，使用酶(例如限制性核酸內(nèi)切酶)產(chǎn)生基于在一系列位點處切割DNA的獨特DNA帶型模式。來自含有多態(tài)性的樣本的DNA片段與野生型具有不同的帶型模式。在本發(fā)明的一個方面,使用Beckman Coulter CEQ 8000遺傳分析系統(tǒng)-一種本
領(lǐng)域熟知的用于微衛(wèi)星多態(tài)性確定的方法，進行片段大小分析。在本發(fā)明的ー個方面，使用限制性片段長度多態(tài)性測定(RPLP)來檢測SNP。首先使用PCR分離目的區(qū)域。然后將PCR產(chǎn)物用已知限制性內(nèi)切酶切割以得到對于給定多態(tài)性獨特長度的片段。將限制性內(nèi)切酶消化的PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分離并通過溴化こ錠染色可視化并與對照(野生型)比較。在一個方面，使用CLEAVASE 片段長度多態(tài)性(CFLP ;Third Wave Technologies,Madison, Wis. ；see e. g. , US Patent No. 5，888，780)測定來檢測多態(tài)性。此測定是基于以下觀察當DNA的單鏈自身折疊時，其呈現(xiàn)對于所述DNA分子的精確序列高度獨特的更高級的結(jié)構(gòu)。這些ニ級結(jié)構(gòu)包括部分雙鏈化的DNA區(qū)，從而單鏈區(qū)與雙鏈DNA發(fā)夾并置。CLEAVASE I酶是識別并切割這些單鏈和雙鏈區(qū)之間聯(lián)結(jié)區(qū)的結(jié)構(gòu)特異的、熱穩(wěn)定的核酸酶。首先，使用例如PCR分離目的區(qū)域。然后，通過加熱使DNA鏈分開。接著，冷卻所述反應(yīng)以使鏈內(nèi)ニ級結(jié)構(gòu)形成。然后用CLEAVASE I酶處理所述PCR產(chǎn)物以生成一系列對于給定多態(tài)性獨特的片段。將CLEAVASE酶處理的PCR產(chǎn)物分離、檢測(例如通過瓊脂糖凝膠電泳)、可視化(例如通過溴化こ錠染色)并與對照(野生型)比較。在本發(fā)明的其他方面，通過雜交測定來檢測SNP。在雜交測定中，基于來自所述樣本的DNA與互補DNA分子(例如寡核苷酸探針)雜交的能力來確定給定多態(tài)性或突變的存在與否。使用多種雜交和檢測技術(shù)的多種雜交測定是可用的。下面提供對如何選擇測定的描述。在一個優(yōu)選的方面，通過檢測ー種或多種連接于所述樣本核酸的標記來檢測所述雜交的核酸。可通過任意數(shù)量的本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的手段納入所述標記。在一個實施方案中，所述標記在制備所述樣本核酸的擴增步驟中同時納入。因此，例如，使用標記的引物或標記的核苷酸的聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)會提供標記的擴增產(chǎn)物。在另ー實施方案中，使用標記的核苷酸的轉(zhuǎn)錄擴增(例如熒光素標記的UTP和/或CTP)將標記納入所轉(zhuǎn)錄的核酸中?；蛘?，可將標記直接加入原始核酸樣本(例如mRNA、polyA mRNA、cDNA、基因組DNA等)中或在擴增完成后加入擴增產(chǎn)物中。將標記連接到核酸的手段是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，包括，例如，通過激活(kinasing)核酸并隨后連接(聯(lián)結(jié))將所述樣本核酸連接于標記(例如熒光團)的核酸接頭而進行的缺口平移標記或末端標記(例如用標記的RNA)。在另一實施方案中，使用末端脫氧轉(zhuǎn)移酶(TdT)將標記加至片段末端。適用于本發(fā)明的可檢測標記包括任何可通過分光鏡、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)、電學(xué)、光學(xué)或化學(xué)手段檢測的組合物。本發(fā)明可用的標記包括但不限于用于用標記的鏈霉抗生物素蛋白綴合物染色的生物素；抗生物素抗體；磁珠(例如Dynabeads );熒光染料(例如熒光素、Texas Red、羅丹明、綠色熒光蛋白等)；放射標記(例如3H、125I、35S、14C或32P);磷光標記；酶(例如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶和ELISA中常用的其他酶)；以及量 熱標記例如膠體金或有色玻璃或塑料(例如聚苯乙烯、聚丙烯、膠乳等)珠。檢測所述標記的手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。因此，例如，可使用感光膠片或閃爍計數(shù)器來檢測放射標記；可使用光檢測器檢測發(fā)射光來檢測熒光標志物。通常通過提供酶以底物并檢測通過酶對底物的作用產(chǎn)生的反應(yīng)產(chǎn)物來檢測酶標記，以及通過僅可視化有色標記來檢測量熱標記。所述標記可在雜交之前或之后被加至靶標核酸。所謂的“直接標記”是在雜交之前直接連接于或納入靶標核酸的可檢測標記。相反，所謂的“間接標記”在雜交后與雜交雙鏈體結(jié)合。通常，所述間接標記連接于在雜交之前已經(jīng)與靶標核酸連接的結(jié)合部分。因此，例如，所述靶核酸可在雜交前被生物素化。在雜交后，抗生物素蛋白綴合的熒光團會結(jié)合帶有生物素的雜交雙鏈體，從而提供易于檢測的標記。對于標記核酸和檢測標記的雜交核酸的方法的詳細綜述，參見 Ti jssen, 1993, Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology, Vol. 24 !Hybridization with Nucleic Acid Probes,其出于各種目的以引用的方式全文納入本文。在一個方面，通過可視化結(jié)合探針來直接檢測探針與目的序列(例如，諸如SNP的多態(tài)性)的雜交(例如Southern或Northern測定；參見例如Ausabel et al. (Eds. ), 1991,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons, NY)。在這些測定中，從受試者中分離基因組DNA(Southern)或RNA (Northern)。然后用一系列在基因組中切割頻率低并在不靠近任何要測定的標志處切割的限制性內(nèi)切酶切割所述DNA或RNA。然后分離所述DNA或RNA(例如瓊脂糖凝膠電泳)并轉(zhuǎn)移至膜上。然后使對要檢測的突變特異的標記(例如通過納入放射性核苷酸)的一個探針或多個探針在低、中或高嚴格條件下與所述膜接觸。將未結(jié)合的探針除去并通過可視化標記的探針來檢測結(jié)合的存在。在本發(fā)明的一個方面中，使用DNA芯片雜交測定來檢測SNP。在此測定中，一系列寡核苷酸探針被固定在固態(tài)載體上。所述寡核苷酸探針被設(shè)計為對給定的單核苷酸多態(tài)性是獨特的。將所述目的DNA樣本與所述DNA “芯片”接觸并檢測雜交。在某些實施方案中，所述DNA芯片測定是GeneChip (Affymetrix, Santa Clara,Calif ;參見例如美國專利No. 6，045, 996)測定。所述GeneChip技術(shù)使用固定在“芯片”上的微型化的、高密度的寡核苷酸探針陣列。探針陣列由Affymetrix的光引導(dǎo)化學(xué)合成法制造，該方法將固相化學(xué)合成與用于半導(dǎo)體エ業(yè)的光刻技術(shù)結(jié)合。使用一系列光刻掩膜來限定芯片暴露位點，然后進行特定化學(xué)合成步驟，所述方法構(gòu)建寡核苷酸的高密度陣列，每種探針位于所述陣列的預(yù)定位置。多個探針陣列在大玻璃薄片上同時合成。然后將所述薄片切成小塊，將各個探針陣列包裝在注塑成型的塑料盒中，其保護所述陣列與環(huán)境隔離并用作雜交容器。從來自受試者的生物樣本分離要分析的核酸，通過PCR擴增，并用熒光報告基團標記。然后用流控工作站(fluidics station)將所述標記的DNA與所述陣列孵育。然后將所述陣列插入掃描器，在其中檢測雜交模式。以從已經(jīng)納入所述靶標——其結(jié)合于所述探針陣列——的熒光報告基團激發(fā)的光的形式收集雜交數(shù)據(jù)。完美匹配所述靶標的探針通常比錯配的探針產(chǎn)生更強的信號。由于每個探針的序列和在所述陣列上的位置是已知的，因此通過互補性，可確定施加于所述探針陣列的靶標核酸的性質(zhì)。在另一方面，使用含有電子捕獲探針(Nanogen, San Diego, Calif.)的DNA微型芯片(參見例如美國專利6，068，818)。通過使用微電子技木，Nanogen技術(shù)使得帶電分子主動移動并濃縮至其半導(dǎo)體微型芯片上的指定測試位點并從所述位點主動移動并濃縮。對給定的多態(tài)性或突變獨特的DNA捕捉探針通過電子方式位于或定位或“尋址”于所述微型芯片的特定位點。由于DNA具有強負電荷，其可通過電子方式移動至正電區(qū)。首先，所述微型芯片上的一個測試位點或一列測試位點被正電荷通過電子方式激活。接著，將含有所述DNA探針的溶液引至所述微型芯片上。帶負電的探針快速移動到所述帶正電的位點，在那里它們濃縮并化學(xué)地結(jié)合于所述微型芯片上的位點。然后洗滌所述微型芯片，并加入不同DNA探針的另ー種溶液直至特異性結(jié)合DNA探針的陣列完成。然后通過確定哪些DNA捕捉探針雜交測試樣本中的互補DNA (例如PCR擴增的目的基因)來分析所述測試樣本中靶DNA分子的存在。電荷也用于將靶標分子移動并濃縮至所述微型芯片上的一個或多個測試位點。樣本DNA在每個測試位點處的電子濃縮促進樣本DNA與互補捕捉探針的快速雜交(雜交可在數(shù)分鐘內(nèi)發(fā)生)。為從每個位點除去任何未結(jié)合或非特異性結(jié)合的DNA，將所述位點的極性或電荷反轉(zhuǎn)為負，從而迫使任何未結(jié)合或非特異性結(jié)合的DNA離開所述捕捉探針回到溶液中。使用基于激光的熒光掃描器來檢測結(jié)合。在又一方面，使用基于流體通過表面張カ差異在平面(芯片)上分離的陣列技術(shù)(ProtoGene,Palo Alto,Calif.)(參見例如美國專利 6，001, 311)。Protogene 技術(shù)基于以下事實流體可通過已由化學(xué)涂層賦予的表面張カ差異在平面上分離。一旦這樣分離，寡核苷酸探針就通過試劑的噴墨印刷而直接在所述芯片上合成。將具有由表面張カ限定的反應(yīng)位點的陣列安裝在一組四個壓電噴嘴——各自與四種標準DNA堿基分別對應(yīng)——下的X/Y位移平臺上。所述位移平臺沿所述陣列的每ー排移動，并且將合適的試劑遞送至每個反應(yīng)位點。例如，將amidite A僅遞送至amidite A將在該合成步驟中被偶聯(lián)的位點，以此類推。通過沖洗整個表面然后通過旋轉(zhuǎn)除去來遞送共用試劑和洗液。使用PiOtogene技術(shù)將對于目的多態(tài)性獨特的DNA探針固定于所述芯片。然后使所述芯片與PCR擴增的目的基因接觸。雜交后，除去未結(jié)合的DNA并使用任何合適的方法來檢測雜交(例如，通過納入的熒光基團的熒光去猝滅)。在再一方面，使用“珠陣列”來檢測SNP(Illumina，San Diego, Calif ;參見例如PCT公布W099/67641和W000/39587，其各自以引用的方式納入本文)。11 Iumina使用結(jié)合纖維光束與自裝配到陣列中的小珠的珠陣列技術(shù)。根據(jù)纖維光束的直徑，每個纖維光束含有幾千到幾百萬單獨的纖維。所述珠被包覆以對于檢測給定多態(tài)性或突變特異的寡核苷酸。將各批次的珠合并以形成對所述陣列特異的庫。為進行測定，所述珠陣列與制備的受試者樣本(例如DNA)接觸。使用任何合適的方法如雜交的酶檢測來檢測雜交。在本發(fā)明的某些方面，使用通過對特定結(jié)構(gòu)的酶切來檢測雜交的測定產(chǎn)生基因組譜(INVADER測定，Third Wave Technologies ;參見例如美國專利6，001，567)。所述INVADER測定通過使用結(jié)構(gòu)特異的酶來切割通過重疊寡核苷酸探針的雜交形成的復(fù)合物而檢測特異性DNA和RNA序列。提高溫度和所述探針之一過量使得因存在的每個靶標序列多個探針被切割，而無需溫度循環(huán)。然后這些被切割的探針指導(dǎo)第二種標記探針的切割。所述第二種探針寡核苷酸可在5'末端標記以熒光素，所述熒光素被一種內(nèi)部染料猝滅。切割后，所述去猝滅的熒光素標記的產(chǎn)物可使用標準熒光酶標儀檢測。
所述INVADER測定檢測未擴增的基因組DNA中的特定突變和多態(tài)性。使分離的DNA樣品與對多態(tài)性/突變或野生型序列特異的第一種探針接觸并使其雜交。然后對所述第一種探針特異并含有熒光標記的第二種探針雜交并加入酶。使用熒光酶標儀檢測結(jié)合并比較測試樣本與已知的陽性和陰性對照的信號。在某些方面，使用TaqMan 測定(PE Biosystems, Foster City, Calif ;參見例如美國專利No. 5,962, 233)檢測結(jié)合探針的雜交。所述測定在PCR反應(yīng)期間進行。TaqMan測定利用AMPLITAQ GOLD DNA聚合酶的5' -3'核酸外切酶活性。所述PCR反應(yīng)包括對于給定等位基因或突變特異的探針。所述探針由含有5'-報告染料(例如熒光染料)和3'-猝滅染料的寡核苷酸構(gòu)成。在PCR中，如果所述探針與其靶標結(jié)合，那么所述AMPLITAQ GOLD聚合酶的5' -3'核酸水解活性切割所述報告染料與所述猝滅染料之間的探針。所述報告染料與所述淬滅染料的分離導(dǎo)致熒光的增加。所述信號隨每輪PCR逐漸聚積并可用熒光計監(jiān)測。在某些方面,使用MassARRAY系統(tǒng)(Nanogen, San Diego, Calif.)來檢測多態(tài)性(參見例如美國專利6，043，031)。使用標準方法從血樣中分離DNA。接著，通過PCR擴增含有目的多態(tài)性的特定DNA區(qū)域。然后通過一條鏈將所擴增的片段連接于固體表面并通過標準變性和洗滌除去未固定的鏈。然后剩余固定化的單鏈作為自動酶反應(yīng)的模板，所述自動酶反應(yīng)產(chǎn)生對于診斷產(chǎn)物特異的基因型。然后將非常小量(通常5到10納升)的酶產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到SpectroCHIP陣列，用SpectroREADER質(zhì)譜儀進行隨后的自動分析。每個點預(yù)裝以光吸收晶體,所述光吸收晶體與分配的診斷產(chǎn)物形成基質(zhì)。所述MassARRAY系統(tǒng)使用MALDI-T0F (基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight))質(zhì)譜。在稱為解吸附的方法中，用來自激光束的脈沖打擊所述基質(zhì)。所述激光束的能量被轉(zhuǎn)移至所述基質(zhì)中，所述基質(zhì)被蒸發(fā)，導(dǎo)致少量所述診斷產(chǎn)物被排到飛行管中。由于所述診斷產(chǎn)物帶電，因此當隨后施加電場脈沖于所述管時，他們沿飛行管向檢測器發(fā)射。施加電場脈沖和所述診斷產(chǎn)物與檢測器碰撞之間的時間稱為飛行時間。這是產(chǎn)物的分子量的非常精確的度量，因為分子的質(zhì)量直接對應(yīng)飛行時間，小分子比大分子飛得更快。整個測定在小于0. 0001秒內(nèi)完成，使得樣本在總共3-5秒內(nèi)被分析，包括重復(fù)數(shù)據(jù)采集。然后SpectroTYPER軟件以每個樣本3秒的速率計算、記錄、比較和報告所述基因型。
通常，從來自所述受試者的生物樣本分離本發(fā)明的“核酸樣本”，所述生物樣品例如全血、血清、精液、唾液、眼淚、尿液、糞便、汗液、口腔涂片、皮膚以及肌肉、肝、腦組織、神經(jīng)組織和頭發(fā)的活組織檢查。所述核酸樣本可為基因、調(diào)控序列、基因組DNA、cDNA和RNA (包括mi RNA和rRNA)的一部分。通常先對基因組DNA樣本進行擴增，然后再使其與探針接觸。基因組DNA可來自任何生物樣本。如果提供樣本的個體在所述多態(tài)性位點上是純合的，則含有SNP的基因組DNA的擴增生成單種核酸，如果所述個體是雜合的，則生成兩種核酸。RNA樣本通常也進行擴増。在此情況下，擴增前通常進行反轉(zhuǎn)錄。全部表達的mRNA的擴增可如例如在[39]和[40]中所述的進行，所述文獻以引用的方式全文納入本文。如果提供樣本的個體在所表達的RNA內(nèi)出現(xiàn)的多態(tài)性位點上是雜合的，則來自二倍體樣本的 RNA樣本的擴增可生成兩種靶標分子，或者如果所述RNA種類發(fā)生可變剪接，則可能產(chǎn)生更多種靶標分子。擴增通常可使用本領(lǐng)域已知的聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)方法進行。靶標樣本中的核酸可在擴增過程中通過在擴增混合物中包括一種或多種標記的核苷酸而被標記。標記也可在擴增后連接于擴增產(chǎn)物(例如通過末端標記)。根據(jù)在所述擴增反應(yīng)中使用的酶和底物，所述擴增產(chǎn)物可為RNA或DNA。各個多態(tài)性的基因型包含至少兩種等位基因的總和并可為純合的(即包含相同的等位基因)或雜合的(即包含不同的等位基因)。在本發(fā)明的某些方面，本發(fā)明的分離核酸樣本可使用常規(guī)核酸合成法或通過本領(lǐng)域已知的重組核酸方法產(chǎn)生或合成(2001, Molecular Cloning A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York 和 Ausubel et al. 2001, CurrentProtocols in Molecular Biology, Green&ffiley, New York)。出乎意料的，本發(fā)明人已經(jīng)證明，從來自患慢性丙型肝炎的受試者的生物樣本中分離的核酸樣本中IL28B/A和/或IL-29基因座內(nèi)的至少ー種多態(tài)性標志的存在表明所述受試者具有増加的對丙型肝炎治療無反應(yīng)的易感性。出乎意料的，本發(fā)明人還已經(jīng)證明，從來自丙型肝炎感染受試者的生物樣本中分離的核酸樣本中IL28B/A和/或IL-29基因座內(nèi)的至少ー種多態(tài)性標志的存在表明所述受試者具有増加的對非自發(fā)丙型肝炎清除的易感性。優(yōu)選地，本發(fā)明的至少ー種SNP位于人染色體19約80kb的區(qū)域內(nèi)。單倍型域(haplotype blocks)作圖(圖3)顯示出所述SNP i) 一方面與患有丙型肝炎的受試者中的對丙型肝炎治療無反應(yīng)的易感性之間具有強相關(guān)，ii)另ー方面與非自發(fā)丙型肝炎清除的易感性増加之間具有強關(guān)聯(lián)。更優(yōu)選地，本發(fā)明的至少ー種SNP位于基本由選自以下的在SNP兩側(cè)的DNA區(qū)域組成的核酸區(qū)段中SEQ ID No I、SEQ ID No 2、SEQ ID No 3、SEQ ID No 4、SEQ ID No 5、SEQ ID No 6、SEQ ID No7、SEQ ID No 8、SEQ ID No 9、SEQ ID No 10、SEQ ID No IUSEQIDNo 12、SEQ ID No 13、SEQ ID No 14、SEQ ID No 15、SEQ ID No 16, SEQ ID No 17、SEQ IDNo 18、SEQ ID No 19、SEQ ID No 20、SEQ ID No 21、SEQ ID No 22、SEQ ID No 23、SEQ IDNo 24、SEQID No 25、SEQ ID No 26、SEQ ID No 27、SEQ ID No 28、SEQ ID No29、SEQ IDNo 30、SEQ ID No 31、SEQ ID No 32、SEQ ID No 33、SEQ ID No 34(如表 I 中所列)。本發(fā)明還包括確定從來自所述受試者的生物樣本分離的核酸樣本中IL28B/A和/或IL-29基因座內(nèi)至少一種，即如上面定義的一種或多種，即組合的，單核苷酸多態(tài)性(SNP)的存在與否。優(yōu)選地，所述多態(tài)性標志是與至少一種選自以下的SNP相關(guān)的多態(tài)性位點rsll879005、rsl2975799、rsll083519、rs955155、rsl2972991, rsl2980275, rs8105790,rsll881222, rsl0853727, rs8109886, rs8113007, rs8099917, rs7248668, rsl6973285,rsl0853728, rs4803223, rsl2980602, rs4803224, rs664893, rs576832, rsll671087,rs251910, rs7359953, rs7359950, rs2099331, rsll665818, rs570880, rs503355, rs30461,rsl94014, rs251903, rsl2979175, rs39587, rs30480. Most 更優(yōu)選地，所述 SNP 選自rs8099917 的 G/T、rs8099917 的 G/G、rs576832 的 C/G、rs576832 的 C/C、rsl2980275 的 G/A 或 rsl2980275 的 G/G。還優(yōu)選地，所述至少一種多態(tài)性標志是與選自以下的至少一種SNP完全或強烈連鎖不平衡的多態(tài)性位點rsll879005, rsl2975799, rsll083519, rs955155, rsl2972991,rsl2980275, rs8105790, rsll881222, rsl0853727, rs8109886, rs8113007, rs8099917,rs7248668, rsl6973285, rsl0853728, rs4803223, rsl2980602, rs4803224, rs664893,rs576832, rsll671087, rs251910, rs7359953, rs7359950, rs2099331, rsll665818,rs570880, rs503355, rs30461, rsl94014, rs251903,rsl2979175, rs39587,rs30480.例如，當所述rs8099917等位基因G位于一個染色體(或兩個等位基因位置之一)上時，其形成雜合基因型G/T。相反，當位于兩個染色體(或等位基因位置)時，其形成純合基因型G/G。在一個方面，本文所述的可用于確定所述病毒基因型的核酸樣本和可用于確定所述多態(tài)性的核酸樣本是從來自所述受試者的同一生物樣本中分離的。因此制備用于分離核酸樣本的生物樣本，所述核酸樣本一方面可用于確定本發(fā)明的至少一種多態(tài)性標志的存在與否，另一方面用于確定HCV病毒基因型。在另一個方面，本文所述的可用于確定所述病毒基因型的核酸樣本和可用于確定所述多態(tài)性的核酸樣本是從來自所述受試者的兩個不同的生物樣本中分離的。在此情況下，貝1J制備第一生物樣本和第二生物樣本，所述第一生物樣本用于分離可用于確定本發(fā)明的至少一種多態(tài)性標志的存在與否的核酸樣本，所述第二生物樣本可用于分離可用于確定HCV病毒基因型的核酸樣本。這兩種生物樣本可為相同種類(例如在所述兩種情況下均為全血)，也可為不同種類(例如全血和肝活檢組織)。要分析的HCV核酸——通常為RNA——通常被分離、反轉(zhuǎn)錄為cDNA并例如通過PCR擴增，如WO 96/14839和WO 97/01603所述。本領(lǐng)域已知的任何其他技術(shù)均可使用?！斑B鎖不平衡” (LD)描述以下情況，即其中等位基因或遺傳標志的某些組合在群體中的出現(xiàn)頻率高于或低于由等位基因的單倍體型基于其頻率隨機形成所預(yù)期的頻率。當在一個基因座上的某個等位基因被發(fā)現(xiàn)與在第二個基因座上的某一等位基因一塊在相同染色體上時——如果群體中所述兩個基因座獨立地分離，則通常高于預(yù)期——所述基因座是不平衡的。此LD的概念由人們提出的對不平衡的最早度量之一(符號為D)形成。D (與LD的大多數(shù)其他度量相同)將不平衡定量為雙基因座單倍體的實測頻率與在所述等位基 因是隨機分離的時所預(yù)期顯示的頻率之間的差異。采用兩個相鄰的基因座的標準符號——A和B，其中在每個基因座上有兩個等位基因(A，a和B，b)——對由等位基因A和B構(gòu)成的單倍體的實測頻率由PAB表示。假設(shè)所述兩個基因座上的等位基因是獨立分配的，所預(yù)期的單倍體頻率計算為每個所述兩個等位基因的等位基因頻率之積，即PAXPB，其中PA是在第一個基因座上的等位基因A的頻率，PB是在第二個基因座上的等位基因B的頻率。因此，不平衡的最簡單的度量之ー為D = PAB-PAXPB。當新突變在具有附近基因座上的某一等位基因的染色體上發(fā)生并且逐漸通過重組削弱時，就形成LD。反復(fù)發(fā)生的突變也可降低相鄰基因座上的等位基因之間的關(guān)聯(lián)?！斑B鎖”的名稱包含了重組在LD的形成模式中的重要性。群體中LD的程度被預(yù)期隨著時間(t)和標志之間的重組距離(r，或重組率)而降低。理論上，LD依照如下公式隨時間和距離衰變，其中DO是在某個起 點處不平衡的程度，Dt是t代后不平衡的程度Dt = (l-r)tDO。已經(jīng)提出大量統(tǒng)計數(shù)值來度量LD的量，這些LD根據(jù)其情況具有不同的強度。盡管度量D具有LD的直觀概念，然而其數(shù)值對測量LD的強度及比較LD的水平用處不大。這是由于D對等位基因頻率的依賴性。兩個最常用的度量是D’的絕對值和！*2。D’的絕對值在給定兩個基因座上的等位基因頻率的情況下由D除以其最大可能值而確定。D’ = I的情況稱為完全LD。< I的D’值表明原來的完全LD已被破壞。く I的D’值的大小沒有清楚的解釋。D’的估值在少量樣本中被強烈放大。因此，統(tǒng)計上顯著的接近I的D’值可用于指示過去存在微小的重組，但中等值不應(yīng)用于比較研究之間的LD的強度或用于量度LD的程度。度量！·2在某些方面與D’互補。r2等于D2除以兩個基因座上的等位基因頻率的積。Hill和Roberson推導(dǎo)出E[r2] = l/l+4Nc，其中c為以摩為單位的兩個標志之間的重組率，N為有效群體大小。此等式說明LD的兩個重要性質(zhì)。首先，LD的期望水平取決于重組。兩個位點之間的重組越多，其相互移動的程度越高，導(dǎo)致LD降低。第二，LD取決于N，強調(diào)LD是群體特征。在本發(fā)明中，強連鎖不平衡與HapMap European數(shù)據(jù)集中和/或發(fā)明人實驗分析的群體中的所述SNP存在O. 5的IV和/或至少O. 6的稱為r2的相關(guān)性。依照本發(fā)明，如果存在所述rs8099917等位基因G或rs576832C ( 一個或者兩個范例)，這表明患有慢性丙型肝炎的受試者具有増加的對丙型肝炎治療無反應(yīng)的易感性。(分別)與無G或C等位基因相比，rs8099917等位基因G或rs576832C存在兩個范例，而非ー個等位基因，進ー步增加對丙型肝炎治療無反應(yīng)的風險。類似地，如果存在所述rs8099917等位基因G或rs576832C ( 一個或兩個范例)，這表明丙型肝炎感染受試者具有増加的非自發(fā)丙型肝炎清除(或發(fā)展為慢性丙型肝炎)的易感性。(分別)與無G或C等位基因相比，rs8099917等位基因G或rs576832C存在兩個范例，而非ー個等位基因，進ー步増加非自發(fā)丙型肝炎清除的風險。在另一方面，攜帶rs 12980275風險等位基因G的患者比其他患者更可能成為無反應(yīng)者(OR = I. 99,95% Cl I. 57-2. 54,P = I. 74E-8)。此關(guān)聯(lián)在對相關(guān)協(xié)變量(年齡、性別、HCV基因型、纖維化嚴重程度和HCV病毒載量)校正后仍是顯著的(校正的P = 4. 61E-09)。類似地，攜帯A/G和G/G基因型的患者比A/A攜帯者更可能成為無反應(yīng)者(對于A/G，OR =
2.65 [95% Cl 2. 18-3. 18],P = 2. 67E-7，校正的 P = 9. 90E-8 ;對于 G/G，0R = 3. 68，[95%Cl 2. 77-4. 88], P = 4. 05E-6，校正的 P=L 13E-5，使用 A/A 作為參照)。
還已發(fā)現(xiàn)，在HCV單感染和HCV/HIV共感染個體中均觀察到了 SNP的存在與對丙型肝炎治療無反應(yīng)的易感性或非自發(fā)清除的易感性之間的關(guān)聯(lián)。
權(quán)利要求
1.一種確定患慢性丙型肝炎的受試者中對丙型肝炎治療無反應(yīng)的易感性的方法，所述方法包括確定從來自所述受試者的生物樣本中分離的核酸樣本中IL28B/A和/或IL-29基因座內(nèi)至少ー種多態(tài)性標志的存在與否。
2.權(quán)利要求I的方法，其中所述至少一種多態(tài)性標志的存在是所述患者具有增加的對丙型肝炎治療無反應(yīng)的易感性的指征。
3.權(quán)利要求I或2的方法，其中所述至少ー種多態(tài)性標志位于染色體19上約80kb的區(qū)域內(nèi)。
4.權(quán)利要求1-3任一項的方法,其中所述至少一種多態(tài)性標志位于基本由選自SEQIDNo I到SEQ ID No 34的序列構(gòu)成的核酸區(qū)段上。
5.權(quán)利要求1-3任ー項的方法，其中所述至少一種多態(tài)性標志是與選自以下SNP組的至少ー種SNP相關(guān)的多態(tài)性位點 rsll879005, rsl2975799, rsll083519, rs955155, rsl2972991, rsl2980275,rs8105790, rsll881222, rsl083727, rs8109886, rs8113007, rs8099917, rs7248668,rsl6973285, rsl0853728, rs4803223, rsl2980602, rs4803224, rs664893, rs576832,rsll671087, rs251910, rs7359953, rs7359950, rs2099331, rsll665818, rs570880,rs503355, rs30461, rsl94014, rs251903, rsl2979175, rs39587, rs30480.。
6.權(quán)利要求1-4任ー項的方法，其中所述至少一種多態(tài)性標志是與選自根據(jù)權(quán)利要求5的SNP組的至少ー種SNP完全連鎖不平衡或強連鎖不平衡的多態(tài)性位點。
7.權(quán)利要求1-4任ー項的方法，其中所述至少一種多態(tài)性標志是選自根據(jù)權(quán)利要求5的SNP組的至少兩種SNP的組合。
8.權(quán)利要求1-7任ー項的方法，其中所述至少ー種多態(tài)性標志選自rs8099917的G/T、rs8099917 的 G/G、rs576832 的 C/G、rs576832 的 C/C、rsl2980275 的 G/A 或 rsl2980275 的G/G。
9.權(quán)利要求1-8任ー項的方法，其中所述丙型肝炎治療是基于干擾素的治療。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述基于干擾素的治療選自IFNa、IFNA或任何聚こニ醇化干擾素。
11.權(quán)利要求9或10的方法，其中所述基于干擾素的治療與利巴韋林或任何抗蛋白酶藥物或任何抗病毒藥物或其任意組合結(jié)合。
12.權(quán)利要求9-11任ー項的方法，其中所述慢性丙型肝炎由HCV的病毒基因型1、2、3或4導(dǎo)致。
13.權(quán)利要求1-12任ー項的方法，還包括確定從來自所述受試者的生物樣本中分離的核酸樣本的HCV病毒基因型。
14.權(quán)利要求1-13任ー項的方法，其中所述受試者被HIV共感染。
15.一種確定丙型肝炎感染受試者中非自發(fā)丙型肝炎清除的易感性的方法，所述方法包括確定從來自所述受試者的生物樣本中分離的核酸樣本中IL28B/A和/或IL-29基因座內(nèi)至少ー種多態(tài)性標志的存在與否。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述至少一種多態(tài)性標志的存在是所述患者具有增加的非自發(fā)丙型肝炎清除的易感性的指征。
17.權(quán)利要求15或16的方法，其中所述至少ー種多態(tài)性標志位于染色體19上約80kb的區(qū)域內(nèi)。
18.權(quán)利要求15-17任一項的方法,其中所述至少一種多態(tài)性標志位于基本由選自SEQID No I到SEQ ID No 34的序列構(gòu)成的核酸區(qū)段上。
19.權(quán)利要求15-17任ー項的方法，其中所述至少一種多態(tài)性標志是與選自以下SNP組的至少ー種SNP相關(guān)的多態(tài)性位點rsll879005, rsl2975799, rsll083519, rs955155, rsl2972991, rs 12980275，rs8105790, rsll881222, rsl0853727, rs8109886, rs8113007, rs8099917, rs7248668,16973285， rsl0853728, rs4803223, rsl2980602, rs4803224, rs664893, rs576832,rsll671087, rs251910, rs7359953, rs7359950, rs2099331, rsll665818, rs570880,rs503355, rs30461, rsl94014, rs251903, rsl2979175, rs39587, rs30480.。
20.權(quán)利要求15-18任ー項的方法,其中所述至少一種多態(tài)性標志是與選自根據(jù)權(quán)利要求19的SNP組的至少ー種SNP完全連鎖不平衡或強連鎖不平衡的多態(tài)性位點。
21.權(quán)利要求15-18任ー項的方法，其中所述至少一種多態(tài)性標志是選自根據(jù)權(quán)利要求19的SNP組的至少兩種SNP的組合。
22.權(quán)利要求15-18任ー項的方法，其中所述至少ー種多態(tài)性標志選自rs8099917的G/T、rs8099917 的 G/G、rs576832 的 C/G、rs576832 的 C/C、rsl2980275 的 G/A 或rsl2980275的 G/G。
23.權(quán)利要求15-22任ー項的方法，其中所述慢性丙型肝炎由HCV的病毒基因型1、2、3或4導(dǎo)致。
24.權(quán)利要求15-23任ー項的方法，還包括確定從來自所述受試者的生物樣本中分離的核酸樣本的HCV病毒基因型。
25.權(quán)利要求15-24任ー項的方法，其中所述受試者被HIV共感染。
26.一種治療慢性丙型肝炎患者的方法，包括 i)確定至少ー種所述患者的多態(tài)性標志是否位于從來自所述患者的生物樣本中分離的核酸樣本的IL28B/A和/或IL-29基因內(nèi)，其中所述至少一種所述患者的多態(tài)性標志選自 rsll879005, rsl2975799, rsll083519, rs955155, rsl2972991, rsl2980275,rs8105790, rsll881222, rsl0853727, rs8109886, rs8113007, rs8099917, rs7248668,rsl6973285, rsl0853728, rs4803223, rs 12980602， rs4803224, rs664893, rs576832,rsll671087, rs251910, rs7359953, rs7359950, rs2099331, rsll665818, rs570880,rs503355, rs30461, rsl94014, rs251903, rsl2979175, rs39587, rs30480, ii)基于所述至少ー種所述患者的多態(tài)性標志是否與對丙型肝炎治療無反應(yīng)的易感性増加相關(guān)而對所述患者進行治療。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述丙型肝炎治療是基于干擾素的治療。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述基于干擾素的治療選自IFNa、IFNA或任何聚こニ醇化干擾素。
29.權(quán)利要求27或28所述的方法,其中所述基于干擾素的治療與利巴韋林或任何抗蛋白酶藥物或任何抗病毒藥物或其任意組合結(jié)合。
30.一種治療慢性丙型肝炎患者的方法，包括i)確定至少ー種所述患者的多態(tài)性標志是否位于從來自所述患者的生物樣本中分離的核酸樣本的IL28B/A和/或IL-29基因內(nèi)，其中所述至少一種所述患者的多態(tài)性標志選自rsll879005,rsl2975799,rsll083519,rs955155,rs2972991,rsl2980275,rs8105790,rsll881222, rsl0853727, rs8109886, rs8113007, rs8099917, rs7248668, rsl6973285,rsl0853728, rs4803223, rsl2980602, rs4803224, rs664893, rs576832, rsll671087,rs251910, rs7359953, rs7359950, rs2099331,rsll665818,rs570880,rs503355, rs30461,rsl94014, rs251903, rsl2979175, rs39587, rs30480, ii)確定從來自所述患者的生物樣本中分離的核酸樣本中的HCV病毒基因型， iii)并且基于所述至少ー種所述患者的多態(tài)性標志以及HCV病毒基因型是否與對丙 型肝炎治療無反應(yīng)的易感性増加相關(guān)而對所述患者進行治療。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述丙型肝炎治療是基于干擾素的治療。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述基于干擾素的治療選自IFNa,IFNA或任何聚こニ醇化干擾素。
33.權(quán)利要求31或32的方法，其中所述基于干擾素的治療與利巴韋林或任何抗蛋白酶藥物或任何抗病毒藥物或其任意組合結(jié)合。
34.權(quán)利要求30-33任ー項的方法，其中所述受試者被HIV共感染。
35.一種評估患有慢性丙型肝炎的受試者中對丙型肝炎治療無反應(yīng)的易感性的方法，所述方法包括 i)通過確定從所述受試者的生物樣本中分離的核酸樣本的IL28B/A和/或IL-29基因座內(nèi)至少ー種多態(tài)性標志的存在與否而辨別所述受試者中具有對丙型肝炎治療無反應(yīng)的易感性的受試者，所述至少一種多態(tài)性標志的存在是所述受試者具有増加的對丙型肝炎治療無反應(yīng)的易感性的指征， ii)建立丙型肝炎治療方案。
36.權(quán)利要求35的方法，其中所述丙型肝炎治療是基于干擾素的治療。
37.權(quán)利要求36的方法，其中所述基于干擾素的治療選自IFNa、IFNA或任何聚こニ醇化干擾素。
38.權(quán)利要求36或37的方法，其中所述基于干擾素的治療與利巴韋林或任何抗蛋白酶藥物或任何抗病毒藥物或其任意組合結(jié)合。
39.權(quán)利要求35-38任ー項的方法，其中所述受試者被HIV共感染。
40.一種評估患有慢性丙型肝炎的受試者中對丙型肝炎治療無反應(yīng)的易感性的方法，所述方法包括 i)通過確定 —從來自所述受試者的生物樣本中分離的核酸樣本中IL28B/A和/或IL-29基因座內(nèi)至少ー種多態(tài)性標記的存在與否，所述至少一種多態(tài)性標志的存在是所述受試者具有増加的對丙型肝炎治療無反應(yīng)的易感性的指征，和 -HCV病毒基因型，基因型I或4的存在是所述患者具有増加的對丙型肝炎治療無反應(yīng)的易感性的指征， 從而辨別所述受試者中具有對丙型肝炎治療無反應(yīng)的易感性的受試者，ii)建立丙型肝炎治療方案。
41.權(quán)利要求40的方法，其中所述丙型肝炎治療是基于干擾素的治療。
42.權(quán)利要求41的方法，其中所述基于干擾素的治療選自IFNa,IFNA或任何聚こニ醇化干擾素。
43.權(quán)利要求41或42的方法，其中所述基于干擾素的治療與利巴韋林或任何抗蛋白酶藥物或任何抗病毒藥物或其任意組合結(jié)合。
44.權(quán)利要求40-43任ー項的方法，其中所述受試者被HIV共感染。
45.一種用于根據(jù)權(quán)利要求1-14任ー項的方法確定患慢性丙型肝炎的受試者中對丙型肝炎治療無反應(yīng)的易感性的試劑盒，所述試劑盒包含i)用于選擇性檢測從來自所述受試者的生物樣本中分離的核酸樣本中位于IL28B/A和/或IL-29基因座內(nèi)至少ー種多態(tài)性標志的存在與否的試劑和ii)使用說明書。
46.一種用于根據(jù)權(quán)利要求15-25任ー項的方法確定患丙型肝炎的受試者中非自發(fā)丙型肝炎清除的易感性的試劑盒，所述試劑盒包含i)用于選擇性檢測從來自所述受試者的生物樣本中分離的核酸樣本中IL28B/A和/或IL-29基因座內(nèi)至少ー種多態(tài)性標志的存在與否的試劑和ii)使用說明書。
47.權(quán)利要求45或46的試劑盒，其中所述試劑還包含g在檢測所述病毒基因型的另ー引物、引物組或引物陣列。
48.權(quán)利要求45-47任ー項的方法，其中所述受試者被HIV共感染。
全文摘要
本發(fā)明涉及確定被丙型肝炎感染的受試者中對丙型肝炎治療無反應(yīng)的易感性或丙型肝炎自發(fā)清除的易感性的體外方法。所述方法是基于檢測IL28A、IL28B和/或IL-29基因座內(nèi)的患者基因型。
文檔編號C12Q1/68GK102665753SQ201080043661
公開日2012年9月12日 申請日期2010年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月31日
發(fā)明者A·勞赫, P-Y·博丘德 申請人:伯爾尼大學(xué), 佛多斯大學(xué)醫(yī)學(xué)研究中心