專利名稱：在洗滌劑中具有改善穩(wěn)定性的蛋白酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有在洗滌劑組合物中改善穩(wěn)定性的蛋白酶。本發(fā)明還涉及編碼所述蛋白酶的分離多核苷酸、核酸構(gòu)建體、重組表達載體、包含所述核酸構(gòu)建體的宿主細(xì)胞和用于生產(chǎn)和使用本發(fā)明蛋白酶的方法。此外，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明蛋白酶的清潔組合物和洗滌劑組合物以及涉及所述蛋白酶在洗滌劑組合物中的用途。發(fā)明背景
在洗滌劑工業(yè)中，向洗滌配方中添加酶的應(yīng)用已超過30年。用于此類配方的酶包括蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纖維素酶、甘露糖苷酶以及其它酶或其混合物。商業(yè)上最重要的酶是蛋白酶。在本領(lǐng)域內(nèi)，例如在EP 130756 (GENENTECH)(對應(yīng)于美國再公告專利號34，606(GENENCOR)) ；EP 214435(HENKEL) ；W0 87/04461(AMGEN) ；W0 87/05050(GENEX)；EP 260105 (GENENCOR) ;Thomas、Russell 和 Fersht (1985) Nature 318 375-376 ;Thomas、RusselI 和 Fersht(1987)J. Mol.Biol. 193803-813 ;Russel 和 Fersht Nature 328496-500(1987) ；W0 88/08028 (Genex) ；W0 88/08033(Amgen) ；W0 95/27049 (SOLVAYS. A.) ；W0 95/30011 (PROCTER&GAMBLE 公司)；W0 95/30010 (PROCTER&GAMBLE 公司)；W095/29979 (PROCTER&GAMBLE 公司)；US 5. 543. 302 (SOLVAY S. A.) ；EP 251 446 (GENENCOR)；WO 89/06279 (N0V0ZYMES A/S) ；W0 91/00345 (N0V0ZYMES A/S) ；EP 525 610 Al (SOLVAY)；WO 94/02618 (GIST-BROCADES N. V.)公開了為數(shù)眾多的此類蛋白酶變體。WO 89/06270 (Novozymes A/S)公開了包含有限底物特異性蛋白酶的洗滌劑組合物，其中所述蛋白酶是能夠斷裂賴氨酸或精氨酸的C-末端側(cè)肽鍵的胰蛋白酶樣蛋白酶。而WO 94/25583公開了編碼鐮孢霉屬(Fusarium)胰蛋白酶樣蛋白酶DNA序列的克隆并且從所述DNA序列中獲得了活性胰蛋白酶樣蛋白酶的表達。然而，即便已經(jīng)描述了眾多有用的蛋白酶和蛋白酶變體，但是為了眾多的工業(yè)用途仍需要進一步改善蛋白酶或蛋白酶變體。具體而言，由于洗滌劑中存在的物質(zhì)往往會降低蛋白酶的穩(wěn)定性，所以蛋白酶在洗滌劑中的穩(wěn)定性問題已經(jīng)變得尤其明顯。因此，本發(fā)明的目標(biāo)是提供改良的蛋白酶，所述蛋白酶適用于例如洗衣房和/或硬質(zhì)表面清潔的洗滌劑中。發(fā)明簡沭本發(fā)明在第一個方面涉及具有在洗滌劑中穩(wěn)定性改善的蛋白酶，所述蛋白酶選自a.具有與如SEQ ID NO: 2的第1_266位氨基酸所示氨基酸序列至少73%同一性的氨基酸序列的蛋白酶；
b.由在低嚴(yán)格條件下與下列序列雜交的核酸序列所編碼的蛋白酶(i)如SEQ ID NO:1的第127-804位核苷酸所示的核酸序列的互補鏈，或(ii)至少100個核苷酸的⑴的亞序列；以及c.與如SEQ ID NO:2的第1_266位氨基酸所示氨基酸序列相比具有1_50、優(yōu)選1-40或1-30、更優(yōu)選1-20、最優(yōu)選1-10個氨基酸替代的蛋白酶。本發(fā)明在第二個方面涉及包含編碼本發(fā)明蛋白酶的核酸序列的分離多核苷酸。本發(fā)明在第三個方面涉及編碼蛋白酶的分離多核苷酸，所述多核苷酸選自a.具有與如SEQ ID NO:1的第52-804位核苷酸所示核酸序列至少80%同一性的核酸序列；和b.在低嚴(yán)格條件下與下列序列雜交的核酸序列 (i)如SEQ ID NO:1的第52-804位核苷酸所示核酸序列的互補鏈；或(ii)至少100個核苷酸的⑴的亞序列。本發(fā)明在第四個方面涉及包含本發(fā)明核酸序列的核酸構(gòu)建體，其中所述核酸序列與能夠指導(dǎo)蛋白酶在適宜宿主中表達的一種或多種控制序列有效連接。本發(fā)明在第五個方面涉及包含本發(fā)明核酸構(gòu)建體、啟動子和轉(zhuǎn)錄終止信號及翻譯終止信號的重組表達載體。本發(fā)明在第六個方面涉及包含本發(fā)明核酸構(gòu)建體的重組宿主細(xì)胞。本發(fā)明在第七個方面涉及生產(chǎn)本發(fā)明蛋白酶的方法，所述方法包括(a)在誘導(dǎo)產(chǎn)生所述蛋白酶的條件下培養(yǎng)本發(fā)明重組宿主細(xì)胞；和(b)回收蛋白酶。本發(fā)明在第八個方面涉及包含本發(fā)明蛋白酶的清潔組合物或洗滌劑組合物、優(yōu)選衣物洗滌組合物或洗碟組合物。本發(fā)明的另一些方面涉及本發(fā)明蛋白酶在清潔組合物或洗滌劑組合物中的用途；用于清潔或洗滌硬質(zhì)表面或衣物的方法，所述方法包括將硬質(zhì)表面或衣物與本發(fā)明組合物接觸。定義在更詳細(xì)討論本發(fā)明之前，首先定義如下術(shù)語和慣例。氨基酸的命名A = Ala =丙氨酸V = Val =纈氨酸L = Leu =亮氨酸I = Ile =異亮氨酸P = Pro =脯氨酸F = Phe =苯丙氨酸W = Trp =色氨酸M = Met =甲硫氨酸G = Gly =甘氨酸S = Ser =絲氨酸T = Thr =蘇氨酸
C = Cys =半胱氨酸Y = Tyr =酪氨酸N = Asn =天冬酰胺Q = Gln =谷氨酰胺D = Asp =天冬氨酸E = Glu =谷氨酸K = Lys =賴氨酸R = Arg =精氨酸H = His =組氨酸X = Xaa =任意氨基酸核酸的命名A =腺嘌呤G=鳥嘌呤C =胞卩密唳T =胸腺嘧啶(僅在DNA中)U =尿嘧啶(僅在RNA中)蛋白酶將斷裂蛋白質(zhì)底物中酰胺鍵的酶歸類為蛋白酶或(可互換地為)肽酶(見Walsh，1979, Enzymatic Reaction Mechanisms, ff. H. Freeman and Company, San Francisco,第 3章)。絲氨酸蛋白酶絲氨酸蛋白酶是催化肽鍵水解并且在酶的活性位點內(nèi)存在一個必需絲氨酸殘基的酶(White, Handler 和 Smith, 1973, “Principles of Biochemistry”,第五版，McGraw-Hi 11 Book Company, NY,第 271-272 頁)。細(xì)菌絲氨酸蛋白酶的分子量范圍為20，000-45, 000道爾頓。它們可被二異丙基氟磷酸抑制。細(xì)菌絲氨酸蛋白酶水解單純末端酯并且其活性類似于同樣為絲氨酸蛋白酶的真核胰凝乳蛋白酶。更狹義的術(shù)語堿性蛋白酶則含蓋一個亞類，其反映某些絲氨酸蛋白酶具有高的最佳 pH (9. 0-11. 0)(綜述見 Priest (1977) Bacteriological Rev. 41 711-753)。胰蛋白酶樣蛋白酶術(shù)語“胰蛋白酶樣蛋白酶”在本上下文中旨在指具有類似于胰蛋白酶活性的蛋白酶，即能夠斷裂位于賴氨酸或精氨酸的C末端側(cè)肽鍵的酶。如在以下材料和方法部分中實施例IV所述，基于胰蛋白酶底物斷裂的測定法測定胰蛋白酶樣蛋白酶活性。母體蛋白酶母體蛋白酶可以是從自然來源分離的蛋白酶，其中可以在保留蛋白酶特征的同時對此蛋白酶進行后續(xù)修飾。而且，母體蛋白酶還可以是通過如J. E. Ness等，NatureBiotechnology, 17，893-896 (1999)所描述的DNA改組技術(shù)制備的蛋白酶。備選地，術(shù)語“母體蛋白酶”可稱作“野生型蛋白酶”。蛋白酶的修飾將此處所用的術(shù)語“修飾”定義為包括蛋白酶的化學(xué)性修飾以及編碼蛋白酶的DNA的遺傳操作。所述修飾可以是氨基酸側(cè)鏈替換、在目的氨基酸處的替代、缺失和/或插入。蛋白酶變體在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語蛋白酶變體或已突變的蛋白酶意指一種由表達突變基因的生物產(chǎn)生的蛋白酶，其中所述突變基因源自擁有原始基因或母體基因并且產(chǎn)生相應(yīng)母體酶的母體微生物，為了能夠在宿主中表達時產(chǎn)生該突變蛋白酶已經(jīng)將母體基因突變成為突變基因。類似地，突變基因還可源自經(jīng)DNA改組技術(shù)產(chǎn)生的母體基因。同源蛋白酶序列在本上下文中，兩種氨基酸序列之間的同源性由參數(shù)“同一性”描述。為了確定兩種蛋白酶之間的同一'丨生程度，可應(yīng)用默認(rèn)設(shè)置的Vector NTI程序包v8的AlignX應(yīng)用的GAP程序。來自程序的結(jié)果除了氨基酸比對之外還計算兩種序列間“同
一性百分?jǐn)?shù)”?；诖嗣枋?，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員可以常規(guī)鑒定根據(jù)本發(fā)明可修飾的適宜同源蛋白酶和相應(yīng)的同源活性位點環(huán)區(qū)域。分離多核苷酸如此處所用，術(shù)語“分離多核苷酸”指已經(jīng)分離和純化并且因此處于適用于遺傳工程蛋白質(zhì)生產(chǎn)系統(tǒng)形式的多核苷酸。此類分離分子可以是從其天然環(huán)境中分離的那些分子，并且包括cDNA克隆和基因組克隆以及源自DNA改組實驗或源自位點定向自然發(fā)生實驗的多核苷酸。本發(fā)明的分離多核苷酸不含通常與之結(jié)合的其它基因，但可包含5’和3’非翻譯區(qū)，如啟動子和終止子。鑒定所結(jié)合的區(qū)域?qū)τ诒绢I(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言是輕而易舉的(見例如Dynan和Ti jan,Nature 316:774-78,1985)。術(shù)語“分離核酸序列”可備選地稱作“分離DNA序列”、“克隆核酸序列”或“克隆DNA序列”。分離蛋白質(zhì)當(dāng)術(shù)語“分離的”應(yīng)用于蛋白質(zhì)時表明該蛋白質(zhì)已經(jīng)脫離了其天然環(huán)境。在一個優(yōu)選的方式中，分離蛋白質(zhì)基本不含其它蛋白質(zhì)，尤其是其它同源蛋白質(zhì)(即“同源雜質(zhì)”(見下))。如通過SDS-PAGE所確定，分離蛋白質(zhì)純度大于10%、優(yōu)選大于20%、更優(yōu)選大于30%。此外，優(yōu)選提供如通過SDS-PAGE所確定的高度純化形式的蛋白質(zhì)，即純度大于40%、大于60%、大于80%，更優(yōu)選大于95%并且最優(yōu)選大于99%。術(shù)語“分離蛋白質(zhì)”可備選地稱作“純化蛋白質(zhì)”。同源雜質(zhì)術(shù)語“同源雜質(zhì)”意指源自最初獲得本發(fā)明蛋白酶的同源細(xì)胞中的任何雜質(zhì)(例如除本發(fā)明蛋白酶之外的另外的多肽)。獲得自如此處所使用的與特定微生物來源有關(guān)的術(shù)語“獲得自”意指由特定來源產(chǎn)生的或由所來源基因已經(jīng)插入的細(xì)胞產(chǎn)生的多核苷酸和/或蛋白酶。底物如此處所使用的與蛋白酶的底物有關(guān)的術(shù)語“底物”應(yīng)當(dāng)解釋為該術(shù)語的最廣義形式，如包括包含至少一種對蛋白酶水解敏感的肽 鍵的化合物。產(chǎn)物
如所使用的與源自蛋白酶的酶反應(yīng)產(chǎn)物有關(guān)的術(shù)語“產(chǎn)物”在本發(fā)明的上下文中應(yīng)當(dāng)解釋為包括涉及蛋白酶的水解反應(yīng)的產(chǎn)物。產(chǎn)物可以為后續(xù)水解反應(yīng)中的底物。洗滌性能在本上下文中，術(shù)語“洗滌性能”用作表示酶在例如洗滌或硬質(zhì)表面清潔過程中去除污跡、特別是所清除物體上的蛋跡的能力。還可參見實施例VII中的“模式洗滌劑洗滌性能測試”。附圖簡沭

圖1描述了本發(fā)明蛋白酶的抑制譜圖。圖2描述了本發(fā)明蛋白酶的底物特異性。 圖3描述了本發(fā)明蛋白酶的溫度譜圖。圖4描述了如DMC測定法所測定的本發(fā)明蛋白酶的pH譜圖。圖5描述了如ACZL-酪蛋白-測定法所測定的本發(fā)明蛋白酶的pH譜圖。圖6描述了本發(fā)明蛋白酶的pH-穩(wěn)定性譜圖。發(fā)明詳沭在本發(fā)明第一個引起關(guān)注的方面，具有改善穩(wěn)定性的胰蛋白酶樣蛋白酶是與如SEQ ID N0:2(即成熟蛋白酶)的第1-266位氨基酸所示的氨基酸序列具有至少73%同一性的分離蛋白酶。在一個引起關(guān)注的實施方案中，本發(fā)明的蛋白酶與如SEQ ID N0:2的第1-266位氨基酸所不氨基酸序列具有大于75%、或大于80%、或大于85%、或大于90%、或大于92%、或大于94%、或大于96%、或大于97%、或大于98%、或大于99%的同一性。在另一個引起關(guān)注的方面，所述蛋白酶是具有如SEQ ID NO:2的第-25-266位氨基酸所示氨基酸序列的蛋白酶變體，所述蛋白酶變體包含一個或多個氨基酸殘基的替代、缺失和/或插入。序列比對和同一性值的計算可以使用對蛋白質(zhì)和DNA比對均有用的完全Smith-Waterman比對進行。氨基酸序列可以使用默認(rèn)設(shè)置的Vector NTI程序包v8的AlignX應(yīng)用程序比對,該應(yīng)用程序使用改進ClustalW算法(Thompson, J. D. , Higgins, D.G.和Gibson T. J.，1994)、blosum62mt2得分矩陣、開口罰分10和缺口延伸罰分O.1。通過對具有SEQ ID N0:2氨基酸序列的蛋白酶的氨基酸序列與認(rèn)為是現(xiàn)有技術(shù)最接近蛋白酶的氨基酸序列之間進行此種比對，發(fā)現(xiàn)了同一性為73%的成熟蛋白質(zhì)。在本發(fā)明另一個引起關(guān)注的實施方案中，分離蛋白酶由這樣的核酸序列編碼，其中所述核酸序列在低嚴(yán)格條件下、優(yōu)選在中等嚴(yán)格條件下、更優(yōu)選在高嚴(yán)格條件下與(i)如SEQ ID NO:1的第127-804位核苷酸所示核酸序列的互補鏈，或(ii)至少100個核苷酸的(i)白勺亞序列雜交(J. Sambrook, E. F. Fritsch 和 T. Maniatus, 1989,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第二版，ColdSpring Harbor, New York)。如SEQ ID NO:1的第127-804位核苷酸所示核酸序列互補鏈的亞序列可以為至少100個核苷酸或優(yōu)選至少200個核苷酸、或至少300個核苷酸，或至少400個核苷酸。而且，亞序列應(yīng)當(dāng)編碼具有蛋白水解活性的蛋白酶片段。蛋白酶還可以是具有蛋白水解活性的蛋白酶等位基因變體或片段。SEQ ID NO:1的核酸序列或其亞序列以及SEQ ID NO: 2的氨基酸序列或其片段可用于設(shè)計核酸探針，以便根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的方法從不同屬或種的株系中鑒定和克隆編碼具有蛋白水解活性的subtilase的DNA。具體而言，此類探針可用于在標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡方法中與目的屬或種的基因組DNA或cDNA雜交以便鑒定和分離其相應(yīng)基因。此類探針比完整序列明顯較短，但長度應(yīng)該至少15個、優(yōu)選25個并且更優(yōu)選35個核苷酸。還可使用更長的探針。DNA探針和RNA探針均可使用。探針一般是標(biāo)記的以便用于檢測相應(yīng)基因(例如用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白標(biāo)記)。此類探針包括于本發(fā)明中。因此，從其它此類生物中制備的基因組DNA文庫或cDNA文庫可篩選與上述探針雜交并且編碼本發(fā)明subtilase的DNA。來自其它此類生物的基因組DNA或其它DNA可以通過熟練技術(shù)人員所知的瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳或者其它分離技術(shù)分離。來自文庫的DNA或分離DNA可以轉(zhuǎn)移并固定在硝酸纖維素或其它適宜載體材料上。為了鑒定與SEQ IDNO:1或其亞序列同源的克隆或DNA，將所述載體材料用于DNA印跡。為了本發(fā)明的目的，雜交作用指核酸序列與對應(yīng)于SEQ ID NO:1中所示核酸序列、其互補鏈或其亞序列的標(biāo)記核酸探針在低嚴(yán)格條件至高嚴(yán)格條件下雜交。使用X射線膠片檢測在此類條件下與核酸探針雜交的分子。 對于至少100個核苷酸長度的長探針，將低嚴(yán)格條件至高嚴(yán)格條件定義為在標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡方法之后于42°C在5XSSPE、0. 3% SDS,200 μ g/ml已剪切和變性鮭精DNA和25%甲酰胺(對于低嚴(yán)格條件)>35%甲酰胺(對于中等嚴(yán)格條件)或50%甲酰胺(對于高嚴(yán)格條件)中預(yù)雜交和雜交。對于至少100個核苷酸長度的長探針，載體材料用2XSSC、0. 2% SDS于優(yōu)選至少500C (低嚴(yán)格條件)、更優(yōu)選至少55°C (中等嚴(yán)格條件)、甚至更加優(yōu)選65°C (高嚴(yán)格條件)下最終洗滌三次，每次15分鐘。對于長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，將嚴(yán)格條件定義為在標(biāo)準(zhǔn)DNA 印跡方法之后于低于根據(jù) Bolton和 McCarthy (1962, Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 48:1390)的計算方法所計算Tm值5_10°C的溫度下，在0. 9MNaCl、0. 09M Tris-HCl pH 7. 6、6mMEDTA、0. 5%NP_40、I XDenhardt 溶液、ImM 焦磷酸鈉、ImM磷酸二氫鈉、O.1mMATP和O. 2mg/ml酵母RNA中進行預(yù)雜交、雜交和雜交后洗滌。對于長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，載體材料于低于所計算Tm值5-10°C的溫度下，在添加O. 1%SDS的6 X SCC中洗滌一次(15分鐘)并且用6 X SCC洗滌兩次(每次15分鐘)。本領(lǐng)域眾所周知，一種氨基酸殘基替換成相似氨基酸殘基的所謂保守替換預(yù)期在酶的特征上僅產(chǎn)生輕微改變。下表I列出了保守氨基酸替換的組別。表I保守氨基酸置換共H特狂氨基酸
堿性(正電荷)R=精氨酸
K=賴氨酸 H=組氨酸
酸性(負(fù)電荷)E=谷氨酸
D=天冬氨酸
極性Q=谷氨跣胺
N=天冬酰胺
疏水性L=亮氨酸1=異亮氨酸
V=纈氨酸 M=甲硫氨SI
芳香族F=笨丙氨酸
W=色氨酸 Y=酪氨酸
小的G=甘氨酸
A=丙氨酸 S=絲氨酸
T_ - * 備因此，在本發(fā)明又一個令人關(guān)注的實施方案中，具有SEQ ID NO:2氨基酸序列的蛋白酶同時具有一個或多個氨基酸殘基的替代、缺失和/或插入。而且，與具有SEQ ID NO: 2氨基酸序列的蛋白酶具有免疫化學(xué)同一性或部分免疫化學(xué)同一性的所分離蛋白酶(優(yōu)選純化形式)也處于本發(fā)明范圍內(nèi)。免疫化學(xué)特性可以通過眾所周知的Ouchterlony雙向免疫擴散方法由免疫交叉反應(yīng)同一'丨生檢測確定。具體而言，根據(jù) Harboe 和 Ingild 在 N. H. Axelsen, J. Kl.uH和 B. Weeks 編輯的 A Manual ofQuantitative Immunoelectrophoresis, BlackwellScientific Publications,1973,第23 章或 Johnstone 和 Thorpe 的 Immuno-chemistry in Practice, Blackwell ScientificPublications, 1982 (更具體在第27-31頁)所描述的方法免疫兔(或其它嚙齒類動物)制備抗血清，其中所述抗血清包含與具有SEQ ID NO:2氨基酸序列的蛋白酶表位發(fā)生免疫反應(yīng)或結(jié)合的多克隆抗體。具有免疫化學(xué)同一性的蛋白酶是與抗血清以相同方式反應(yīng)的蛋白酶，所述的相同方式例如在使用特異免疫化學(xué)技術(shù)時沉淀完全融合、相同的沉淀形態(tài)學(xué)和 / 或相同的電泳遷移率。Axelsen, Bock 和—Κ.Γ011 在 N. H. Axelsen, J. Krell和 B. Weeks編輯的 A Manual of Quantitativeimmunoelectrophoresis, Blackwell ScientificPublications，1973，第10章中深入解釋了免疫化學(xué)同一性。具有部分免疫化學(xué)同一性的蛋白酶是與抗血清以部分相同方式反應(yīng)的蛋白酶，所述的部分相同方式例如在使用特異免疫化學(xué)技術(shù)時沉淀的部分融合、部分相同的沉淀形態(tài)學(xué)和/或部分相同的電泳遷移率。Bock 和 Axelsen 在 N. H. Axelsen, J. ΚΓ011 和 B. Weeks 編輯的 A Manual ofQuantitativeImmunoelectrophoresis,Blackwell Scientific Publications, 1973,第 11 章中描述了部分免疫化學(xué)同一'I"生?？贵w還可以是單克隆抗體。單克隆抗體可根據(jù)如E. Harlow和D. Lane,編者，1988,Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press,ColdSpring Harbor,NewYork的方法制備和使用。本發(fā)明人分離了編碼具有如SEQ ID NO: 2中所示氨基酸序列的subtilase的基因并且將其插入至大腸桿菌(Escherichia coli) NN049696中。根據(jù)國際承認(rèn)用于專利程序的微生物菌種保藏布達佩斯條約，將攜帶所述基因的大腸桿菌NN049696株于2000年2月8日保藏于德意志微生物保藏中心(MascheroderWeg 1B,D_38124 Braunschweig,德國)并且指定保藏號為DSM 15940。 在本發(fā)明一個令人關(guān)注的實施方案中，所述蛋白酶與由多核苷酸的蛋白酶編碼部分所編碼蛋白酶具有大于73. 0%、或大于75. 0%、或大于80. 0%、或大于85. 0%、或大于90. 0%、或大于92. 0%、或大于94. 0%、或大于96. 0%、或大于97. 0%、或大于98. 0%、或大于99. 0%的同一性，其中所述的多核苷酸的蛋白酶編碼部分已經(jīng)被克隆進入保藏號DSM 15940大腸桿菌NN049696中質(zhì)粒片段。如上所述，本發(fā)明的蛋白酶在洗滌劑中表現(xiàn)出改善的穩(wěn)定性。因此，為了使熟練技術(shù)人員能選擇有效的和優(yōu)選的蛋白酶，為此目的本發(fā)明人提供了能夠由熟練技術(shù)人員容易實施以便評估所討論蛋白酶性能的適宜測試法。因此，可使用此處實施例V中公開的穩(wěn)定性測試以評估所選擇蛋白酶的穩(wěn)定性。也就是說，當(dāng)?shù)鞍酌富旌系綐?biāo)準(zhǔn)洗滌劑組合物中時，可以使用此實施例評估與參考系統(tǒng)(混合到相同模式洗滌劑系統(tǒng)中并在相同條件下測試)相比較的蛋白酶的穩(wěn)定性。在本發(fā)明一個令人關(guān)注的方面中，當(dāng)在“實施例V洗滌劑中的穩(wěn)定性”中測試時所述蛋白酶在30°C時具有至少40%的殘余活性，在30°C時具有至少50%的殘余活性，例如在30°C時具有至少60%的殘余活性，更優(yōu)選地在30°C時具有至少70%的殘余活性。在本發(fā)明另一個令人關(guān)注的方面中，當(dāng)在“實施例V洗滌劑中的穩(wěn)定性”中測試時所述蛋白酶在35°C時具有至少40%的殘余活性，在35°C時具有至少50%的殘余活性，例如在35°C時具有至少60%的殘余活性，更優(yōu)選地在35°C時具有至少70%的殘余活性。因此，對于衣物洗滌目的特別令人關(guān)注的蛋白酶是這樣的蛋白酶，當(dāng)該蛋白酶在如此處“穩(wěn)定測試”所述的包含下列成分的模式洗滌劑組合物中測試時表現(xiàn)出與相同條件下測試的參照酶相比改善的穩(wěn)定性磺酸盞20-30%
非離子表面活性劑 0-4%
Na2SO42-8%
NaCO20-40%
Na2OSSiO21-3%
石 4A5-15%
非極性的烴045%
檸檬酸鈉2-8% PCA共聚物0-2%本發(fā)明的蛋白酶可通過用于人工產(chǎn)生多樣性的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)構(gòu)建，例如通過不同蛋白酶基因的 DNA 改組(見 WO 95/22625 和 J. E. Ness 等，NatureBiotechnology, 17，893-896(1999))ο顯而易見，本發(fā)明的蛋白酶還可從天然來源分離，即本發(fā)明的蛋白酶可以是例如真菌多肽，并且更優(yōu)選是絲狀真菌蛋白酶，如鐮孢霉屬、頂孢霉屬(Acremonium)、曲霉屬(Aspergillus)、短梗霉屬(Aureobasidium)、隱球酵母屬(Cryptococcus)、Filibasidium、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、Magnaporthe、毛霉屬(Mucor)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、Neocallimastix、脈抱菌屬(Neurospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(Penicillium)、Piromyces、裂糟菌屬(Schizophyllum)、籃狀菌屬(Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭孢殼屬(Thielavia)、彎頸霉屬(Tolypocladium)或木霉屬(Trichoderma)的蛋白酶；或酵母蛋白酶例如假絲酵母屬(Candida)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)或亞羅酵母屬(Yarrowia)蛋白酶。在另一個令人關(guān)注的實施方案中，蛋白酶是桿孢狀鐮孢(Fusariumbactridioides)、 Fusarium cerealis、 Fusarium crookwellense、 大刀德抱(Fusariumculmorum)、禾本科德抱(Fusarium graminearum)、禾赤德抱(Fusariumgraminum)、異抱德抱(Fusarium heterosporum)、合歡木德抱(Fusariumnegundi)、尖德抱(Fusarium oxysporum)、多枝德抱(Fusarium reticulatum)、粉紅鐮孢(Fusarium roseum)、接骨木鐮孢(Fusarium sambucinum)、膚色鐮孢(Fusariumsarcochroum)、擬分枝抱德抱(Fusarium sporotrichioides)、硫色德抱菌(Fusariumsulphureum)、 Fusarium torulosum、 Fusarium trichothecioides、Fusariumvenenatumλ 棘抱曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、孤獨腐質(zhì)霉(Humicola insolens)、柔毛腐質(zhì)霉(Humicola Ianuginose)、米黑毛霉(Mucor miehei)、Myceliphthora thermophila、粗糖脈抱菌(Neurospora crassa)、產(chǎn)紫青霉(Penicillium pur-purogenum)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康寧木霉(Trichoderma koningii)、長柄木霉(Trichoderma Iongibrachiatum)、李氏木霉(Trichoderma reesei)或綠色木霉(Trichoderma viride)蛋白酶。在一個令人關(guān)注的實施方案中，蛋白酶是卡爾酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus)、Saccharomyces douglasi1、克魯弗酵母(Saccharomyceskluyveri)、諾地酵母(Saccharomyces norbensis)或 Saccharomyces oviformis 蛋白酶。應(yīng)當(dāng)理解，對于前面提到的物種本發(fā)明包括完整狀態(tài)和不完整狀態(tài)以及其它分類學(xué)上的同等物如無性型，而無論其種名是否已知。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會容易識別適當(dāng)同等物的同一'I"生。本發(fā)明的蛋白酶還可以是細(xì)菌蛋白酶，如革蘭氏陽性細(xì)菌的蛋白酶如芽孢桿菌屬(Bacillus)多肽，例如嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽抱桿菌(Bacillus brevis)、環(huán)狀芽抱桿菌(Bacillus circulans)、凝結(jié)芽抱桿菌(Bacillus coagulans)、Bacillus lautus、遲緩
芽抱桿菌(Bacillus lentus)、地衣芽抱桿菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽抱桿菌(Bacillus megaterium)、嗜熱脂肪芽抱桿菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)或蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)蛋白酶；或鏈霉菌屬(Streptomyces)蛋白酶如變鉛青鏈霉菌(Streptomyces Iividans)或鼠灰鏈霉菌(Streptomyces murinus)蛋白酶；或者革蘭氏陰性細(xì)菌蛋白酶如大腸桿菌或假單胞菌屬(Pseudomonas)蛋白酶。公眾輕易地從眾多的菌種保藏中心例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)、德意志微生物保藏中心(DSM)、荷蘭真菌菌種保藏中心(CBS)和美國北方農(nóng)業(yè)研究所培養(yǎng)物保藏中心(NRRL)獲得這些物種的株系。而且，可使用上述探針從其它來源，包括從自然界(例如土壤、堆肥、水等等)中分離的微生物中鑒定和獲得此類蛋白酶。用于從天然環(huán)境中分離微生物的技術(shù)為本領(lǐng)域眾所周知。類似地，篩選另一種微生物的基因組文庫或cDNA文庫還可得到多核苷酸。一旦使用探針檢測到編碼蛋白酶的多核苷酸，則可用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知的技術(shù)分離或克隆該序列(見例如Sambrook等，1989,見上)。通常，可以使用用于克隆基因和向所述基因?qū)?隨機和/或位點定向)插入的標(biāo)準(zhǔn)方法以便獲得本發(fā)明的蛋白酶。對適宜技術(shù)的進一步描述，可參考此處實施例(見下頁)和 Sambrook 等，(1989)Molecular cloning A laboratorymanual, Cold SpringHarbor lab. , Cold Spring Harbor, NY ；Ausubel, F. M.等(編者)“Current protocolsin Molecular Biology” John Wiley and Sons, 1995 ；Harwood, C. R.和 Cutting, S. M.(編者)“Molecular Biological Methods forBacillus”，John Wiley and Sons, 1990;以及WO 96/34946。此外，本發(fā)明的蛋白酶可通過用于人工創(chuàng)造多樣性的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)構(gòu)建，例如通過不同蛋白酶基因的 DNA 改組(TO 95/22625 ；Stemmer WPC，Nature370:389-91 (1994))。多核苷酸本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明蛋白酶的分離多核苷酸。在一個令人關(guān)注的實施方案中，多核苷酸與如SEQ ID NO:1的第52-804位核苷酸所示的多核苷酸的同一性為至少86%，諸如至少87%，例如至少88%，優(yōu)選至少89%，諸如至少90%，例如至少91%，更優(yōu)選至少92%，諸如至少93%，例如至少94%，最優(yōu)選至少95%，諸如至少96%，例如至少97%，具體而言至少98%，優(yōu)選至少99%。在本發(fā)明另一個令人關(guān)注的實施方案中，多核苷酸包含如SEQ ID NO:1的第127-804位核苷酸所示多核苷酸、其等位基因變體或其能夠編碼本發(fā)明蛋白酶的片段。顯而易見，多核苷酸可由如SEQID NO:1的第127-804位核苷酸所示的多核苷酸組成。本發(fā)明還包含編碼具有SEQ ID NO:2氨基酸序列的多肽的多核苷酸，其中所述多核苷酸因為密碼子簡并性而不同于SEQ ID N0:2。本發(fā)明還涉及編碼具有蛋白水解活性的SEQ ID N0:2片段的SEQ ID NO:1的亞序列。SEQ ID NO:1的亞序列是包含SEQ ID NO:1的第52-804位核苷酸的多核苷酸，只是去除了 5’末端和/或3’末端的一個或多個核苷酸。用于分離或克隆編碼多肽的多核苷酸的技術(shù)為本領(lǐng)域眾知并且包括從基因組DNA中分離、從cDNA中制備或其組合?？墒褂美绫娝苤木酆厦告?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或旨在 檢測具有共同結(jié)構(gòu)特征的所克隆DNA片段的表達文庫抗體篩選法實現(xiàn)從該基因組中克隆本發(fā)明多核苷酸。見例如 Innis 等，1990, PCR :A Guide to Methods and Application,Academic Press, New York?？墒褂闷渌暮怂釘U增方法,例如連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、連接激活轉(zhuǎn)錄法(LAT)和酸序列依賴性擴增法(NASBA)。所分離多核苷酸可通過例如基因工程中使用的旨在將多核苷酸從其天然位置遷移至其可以再生的不同位點的標(biāo)準(zhǔn)克隆方法獲得。所述克隆方法包括剪切和分離含有編碼蛋白酶的多核苷酸的目的核酸片段、將片段插入載體分子以及將重組載體整合進入宿主細(xì)胞，在所述宿主細(xì)胞中將復(fù)制出多核苷酸的多個拷貝或克隆。所述的多核苷酸可以為基因組來源、cDNA來源、RNA來源、半合成來源、合成來源或其組合。為了本發(fā)明的目的，如上述測定兩種多核苷酸之間的同一性程度。對編碼本發(fā)明蛋白酶的多核苷酸進行修飾對于與蛋白酶基本類似的蛋白酶的合成可能是必需的。術(shù)語與蛋白酶“基本類似”指蛋白酶的非天然存在形式。這些蛋白酶在某些工程化方式上不同于從其天然來源分離的蛋白酶，例如特異活性、熱穩(wěn)定性、最佳PH等不同的變體。變體序列可以基于作為SEQ ID NO:1的多肽編碼部分存在的多核苷酸(例如其亞序列)而構(gòu)建，和/或通過導(dǎo)入不會產(chǎn)生核酸序列所編碼蛋白酶的另一種氨基酸序列但符合宿主生物密碼子選擇(為了酶的生產(chǎn))的核苷酸替代或者通過導(dǎo)入可產(chǎn)生不同氨基酸序列的核苷酸替代而構(gòu)建。對于核苷酸替代的概述見例如Ford等，1991，ProteinExpression and Purification 2 :95_107o本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，此類替代可在分子的功能關(guān)鍵區(qū)域以外進行并且仍產(chǎn)生活性蛋白酶?？筛鶕?jù)本領(lǐng)域已知方法，如位點定向突變或丙氨酸掃描突變(見例如Cunningham和Wells, 1989, Science 244:1081-1085)鑒定對于本發(fā)明所分離多核昔酸編碼的多肽的活性必需的并且因此優(yōu)選不進行替代的氨基酸殘基。在丙氨酸掃描突變技術(shù)中，在分子中每個正電荷殘基處引入突變，并且測試所得突變分子的蛋白水解活性以鑒定對分子活性至關(guān)重要的氨基酸殘基。底物-酶相互作用的位點還可通過三維結(jié)構(gòu)分析確定，所述三維結(jié)構(gòu)分析可通過諸如核磁共振分析、晶體學(xué)或光親和標(biāo)記技術(shù)測定(見例如 deVos 等，1992, Science 255 :306-312 ；Smith 等，1992, Journal ofMolecularBiology224 :899-904 ；fflodaver 等，1992，F(xiàn)EBS Letters 309 :59-64)。
核酸構(gòu)建體
本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明多核苷酸的核酸構(gòu)建體，其中所述多核苷酸與能夠指導(dǎo)多肽在適宜宿主細(xì)胞中表達的一種或多種控制序列有效連接。
為了使蛋白酶表達，可以以多種方式操作編碼本發(fā)明蛋白酶的分離多核苷酸。在插入載體之前對多核苷酸進行操作可能是期望的或必需的，這取決于表達載體。利用重組 DNA方法來修飾多核苷酸的技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的。
控制序列包括對表達本發(fā)明蛋白酶所必需或有利的所有成分。相對于編碼蛋白酶的多核苷酸而言，每一控制序列可以是天然的或外來的。此類控制序列包括但不限于前導(dǎo)序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子?？刂菩蛄兄辽侔▎幼右约稗D(zhuǎn)錄終止信號和翻譯終止信號?？商峁┖宇^的控制序列，其中所述接頭用于引入便于控制序列與編碼蛋白酶的多核苷酸的編碼區(qū)連接的特異限制性酶切位點。
控制序列可以是適當(dāng)啟動子序列，即在核酸序列表達時可被宿主細(xì)胞識別的序列。啟動子序列包含介導(dǎo)蛋白酶表達的轉(zhuǎn)錄控制序列。啟動子可以是在所選擇宿主細(xì)胞中表現(xiàn)轉(zhuǎn)錄活性的任何多核苷酸，其包括突變體啟動子、截斷啟動子和雜合啟動子，并且可以從編碼與宿主細(xì)胞同源或異源的細(xì)胞外蛋白酶或細(xì)胞內(nèi)蛋白酶的基因獲得。
用于指導(dǎo)本發(fā)明核酸構(gòu)建體在絲狀真菌宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的適宜啟動子的例子是從米曲霉TAKA淀粉酶基因、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶基因、黑曲霉中性α淀粉酶基因、黑曲霉酸穩(wěn)定性α淀粉酶基因、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶 (glaA)基因、米黑根毛霉脂肪酶基因、米曲霉堿性蛋白酶基因、米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶基因、構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶基因和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶基因獲得的啟動子(W0 96/00787) 以及NA2_tpi啟動子(來自黑曲霉中性α淀粉酶基因和米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶基因的啟動子的雜合體)以及其突變啟動子、截斷啟動子和雜合啟動子 。
在酵母宿主中有用的啟動子是從釀酒酵母烯醇化酶(ΕΝ0-1)基因、釀酒酵母半乳糖激酶(GALl)基因、釀酒酵母乙醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)基因和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因獲得的啟動子。用于酵母宿主細(xì)胞的其它啟動子描述于 Romanos 等，1992, Yeast 8 :423_488。
用于指導(dǎo)本發(fā)明核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄，尤其是在細(xì)菌宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的適宜啟動子的例子是從大腸桿菌Iac操縱基因、天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)瓊脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢桿菌α淀粉酶基因(amyL)、 嗜熱脂肪芽孢桿菌麥芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢桿菌α淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因和原核的β-內(nèi)酰胺酶基因(Villa-Kamaroff 等，1978, Proceedings of theNational Academy of Sciences USA 75 :3727-3731)獲得的啟動子以及 tac 啟動子(DeBoer 等，1983，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80:21-25)。另外的啟動子描述于“Useful proteins from recombinant bacteria，，(ScientificAmerican, 1980, 242:74-94)和 Sambrook 等， 1989，同上。
控制序列還可以是適宜轉(zhuǎn)錄終止序列，即宿主細(xì)胞識別以終止轉(zhuǎn)錄的序列。終止序列與編碼蛋白酶的多核苷酸的3’末端有效連接。在所選擇宿主細(xì)胞中具有功能的任何終止子可用于本發(fā)明。
用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選終止子是從米曲霉TAKA淀粉酶基因、黑曲霉葡糖淀粉酶基因、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶基因、黑曲霉α葡糖苷酶基因和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶基因獲得的終止子。
用于酵母宿主細(xì)胞的優(yōu)選終止子是從釀酒酵母烯醇化酶基因、釀酒酵母細(xì)胞色素 C(CYCl)基因和釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因獲得的終止子。用于酵母宿主細(xì)胞的其它終止子描述于Romanos等，1992,同前。
控制序列還可以是適宜前導(dǎo)序列，即對宿主細(xì)胞翻譯而言重要的mRNA非翻譯區(qū)域。前導(dǎo)序列有效連接于編碼多肽的多核苷酸5’末端。在所選擇宿主細(xì)胞中具有功能的任何前導(dǎo)序列可用于本發(fā)明。
用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選前導(dǎo)序列是從米曲霉TAKA淀粉酶基因和構(gòu)巢曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶基因獲得的。
用于酵母宿主細(xì)胞的適宜前導(dǎo)序列是從釀酒酵母烯醇化酶(ΕΝ0-1)基因、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因、釀酒酵母α因子基因和釀酒酵母乙醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)基因獲得的。
控制序列還可以是聚腺苷酸化序列，即有效連接于多核苷酸3’末端并且在轉(zhuǎn)錄時被宿主細(xì)胞識別作為向所轉(zhuǎn)錄mRNA添加聚腺苷酸殘基的信號的序列。在所選擇宿主細(xì)胞中具有功能的任何聚腺苷酸化序列可用于本發(fā)明。
用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選聚腺苷酸化序列是從米曲霉TAKA淀粉酶基因、黑曲霉葡糖淀粉酶基因、 構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶基因、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶基因和黑曲霉α葡糖苷酶基因獲得的。
用于酵母宿主細(xì)胞的聚腺苷酸化序列描述于Guo和Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15:5983-5990。
控制序列還可以是信號肽編碼區(qū)，其中所述信號肽編碼區(qū)編碼連接于蛋白酶氨基末端的氨基酸序列并且指導(dǎo)所編碼蛋白酶進入細(xì)胞的分泌途徑。多核苷酸的編碼序列5’端可內(nèi)在地包含與編碼分泌性蛋白酶的編碼區(qū)片段以翻譯閱讀框天然連接的信號肽編碼區(qū)。 備選地，編碼序列的5’端可包含對編碼序列而言為外來的信號肽編碼區(qū)。當(dāng)編碼序列在天然情況下不包含信號肽編碼區(qū)時，可能需要外來的信號肽編碼區(qū)。備選地，可以將外來的信號肽編碼區(qū)簡單地替換天然的信號肽編碼區(qū)以便增強蛋白酶的分泌。然而，能夠指導(dǎo)所表達蛋白酶進入所選擇宿主細(xì)胞的分泌途徑的任何信號肽編碼區(qū)可用于本發(fā)明。
用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的有效的信號肽編碼區(qū)是從米曲霉TAKA淀粉酶基因、黑曲霉中性淀粉酶基因、黑曲霉葡糖淀粉酶基因、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶基因、孤獨腐質(zhì)霉(Humicola insolens)纖維素酶基因和柔毛腐質(zhì)霉(Humicola lanuginosa)脂肪酶基因獲得的。
用于酵母宿主細(xì)的信號肽編碼區(qū)是從釀酒酵母α因子基因和釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶基因獲得的。其它有用信號肽編碼區(qū)描述于Romanos等，1992，同前。
用于細(xì)菌宿主細(xì)胞的有效信號肽編碼區(qū)是從芽孢桿菌NCIB 11837麥芽糖淀粉基因、嗜熱脂肪芽孢桿菌α淀粉酶基因、地衣芽孢桿菌枯草蛋白酶基因、地衣芽孢桿菌β內(nèi)酰胺酶基因、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶基因(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢桿菌PrsA基因獲得的信號肽編碼序列。另一些信號肽描述于Simonen和Palva, 1993,Microbiological Reviews 57 :109_137o
控制序列還可以是編碼位于蛋白酶氨基端的前肽編碼區(qū)。得到的多肽稱為酶原 (proenzyme)或前多肽(或在某些情況下稱為酶原(zymogen))。前多肽通常為非活性的并且可通過將前肽從前多肽中催化性切下或自催化性切下而轉(zhuǎn)換為成熟的活性多肽。前肽編碼區(qū)可從枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶(aprE)基因、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT)基因、釀酒酵母ct因子基因、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶基因和Myceliphthora thermophila蟲漆酶基因(WO 95/33836)獲得的。
當(dāng)信號肽和前肽區(qū)均出現(xiàn)于subtilase的氨基末端時，則前肽區(qū)緊鄰蛋白酶氨基端而信號肽區(qū)位于前肽區(qū)的氨基端。
添加使多肽表達相對于宿主細(xì)胞生長而受到調(diào)節(jié)的調(diào)節(jié)序列也是適當(dāng)?shù)?。調(diào)節(jié)系統(tǒng)的實例是那些對化學(xué)刺激或物理刺激(包括調(diào)節(jié)性化合物的存在)做出反應(yīng)從而引起基因表達開啟或關(guān)閉的系統(tǒng)。原核系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)系統(tǒng)包括lac、tac和trp f呆縱基因系統(tǒng)。在酵母中可使用ADH2系統(tǒng)或GALl系統(tǒng)。在絲狀真菌中，TAKAa淀粉酶啟動子、黑曲霉葡糖淀粉酶啟動子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動子可用作調(diào)節(jié)序列。調(diào)節(jié)序列的其它實例是那些允許基因擴增的調(diào)節(jié)序列。在真核系統(tǒng)中，這些調(diào)節(jié)序列包括能夠在氨甲蝶呤存在下擴增的二氫葉酸還原酶基因和在重金屬存在下擴增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼多肽的多核苷酸與調(diào)節(jié)序列有效連接。
表汰載體
本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明核酸構(gòu)建體、啟動子和轉(zhuǎn)錄終止信號和翻譯終止信號的重組表達載體。
包含編碼本發(fā)明酶的核酸構(gòu)建體的重組表達載可以是方便進行重組DNA操作的任何載體。
載體的選擇常常取決于該載體將要導(dǎo)入的宿主細(xì)胞。因此，載體可為自主復(fù)制載體，即作為載體復(fù)制不依賴于染色體復(fù)制的染色體外實體存在的載體，例如質(zhì)粒。備選地， 載體可以是在導(dǎo)入宿主細(xì)胞后部分或全部整合至宿主細(xì)胞基因組并且與載體所導(dǎo)入染色體一同復(fù)制的一種載體。
載體優(yōu)選為表達載體，在此載體中編碼本發(fā)明酶的DNA序列與DNA轉(zhuǎn)錄所需的額外片段有效連接。通常表達載體源自質(zhì)?；虿《綝NA，或者包含二者的成分。術(shù)語“有效連接”表示片段如此排列以便這類片段協(xié)調(diào)發(fā)揮它們的預(yù)期功能，例如轉(zhuǎn)錄從啟動子起始并且前進通過編碼酶的DNA序列。
啟動子可以為在所選擇宿主細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)轉(zhuǎn)錄活性的任何DNA序列，并且可以源自編碼與宿主細(xì)胞同源或異源的蛋白質(zhì)的基因。
用于細(xì)菌宿主細(xì)胞的適宜啟動子實例包括嗜熱脂肪芽孢桿菌麥芽糖淀粉酶基因、 地衣芽孢桿菌α淀粉酶基因、淀粉液化芽孢桿菌α淀粉酶基因、枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶基因或短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)木糖苷酶基因的啟動子，或者噬菌體λ PR或PL 啟動子或者大腸桿菌lac、trp或tac啟動子。
如果需要，還可以將編碼本發(fā)明酶的DNA序列與適宜終止子有效連接。
本發(fā)明的重組載體還可進一步包含能使載體在所討論宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的DNA序列。
載體還可以包含選擇標(biāo)記，例如其產(chǎn)物補償宿主細(xì)胞缺陷的基因或者編碼對抗生素如卡那霉素、氯霉素、紅霉素、四環(huán)素、壯觀霉素等或?qū)χ亟饘倩虺輨┚哂锌剐缘幕颉?br> 為了指導(dǎo)本發(fā)明的酶進入所述宿主細(xì)胞的分泌途徑，可在重組載體中提供分泌信號序列(也稱作前導(dǎo)序列、前序列原(Pr印ro sequence)或前序列)。分泌信號序列可以以正確的讀碼框與編碼酶的DNA序列連接。分泌信號序列通常位于編碼酶的DNA序列的5’ 端。分泌信號序列可以是與酶正常連接的分泌信號序列或者來自編碼另一種分泌性蛋白質(zhì)的基因。
用于將編碼本發(fā)明酶的DNA序列分別與啟動子和任選終止子和/或分泌信號序列連接的方法、或者用于通過合適的PCR擴增方案組裝這些序列的方法和用于將它們插入包含復(fù)制或整合所必需信息的合適載體內(nèi)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的(參考例如 Sambrook 等，同上)。
宿豐細(xì)朐
本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明核酸構(gòu)建體的重組宿主細(xì)胞。
導(dǎo)入宿主細(xì)胞的編碼本發(fā)明酶的DNA序列對所討論宿主而言為同源的或異源的。 如果所述DNA序列與宿主細(xì)胞同源，即由該宿主細(xì)胞天然產(chǎn)生，則所述DNA序列一般與另一個啟動子序列有效連接或者(如果可行的話)與不同于該序列天然環(huán)境中的另一種分泌信號序列和/或終止子序列連接。術(shù)語“同源”旨在包括編碼對所討論宿主生物而言為天然的酶的DNA序列。術(shù)語“異源”旨在包括宿主細(xì)胞天然不表達的DNA序列。因此，DNA序列可來自另一種生物，或者其為人工合成序列。
本發(fā)明DNA構(gòu)建體或重組載體所導(dǎo)入的宿主細(xì)胞可以是能夠產(chǎn)生本發(fā)明酶的任何細(xì)胞，其包括細(xì)菌、酵母、真菌和包括植物在內(nèi)的高等真核細(xì)胞。
能夠在培養(yǎng)時產(chǎn)生本發(fā)明酶的細(xì)菌宿主細(xì)胞的實例是革蘭氏陽性細(xì)菌，例如芽孢桿菌菌株諸如枯草芽胞桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、Bacillus lautus、巨大芽孢桿菌或蘇云金芽孢桿菌菌株，尤其是遲緩芽孢桿菌菌株，或者鏈霉菌菌株諸如變鉛青鏈霉菌或鼠灰鏈霉菌菌株，或者革蘭氏陰性菌如大腸桿菌。
細(xì)菌的轉(zhuǎn)化可通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、電穿孔、結(jié)合或通過感受態(tài)細(xì)胞以本身已知的方式實現(xiàn)(參考Sambrook等，同前)。
當(dāng)酶在細(xì)菌如大腸桿菌中表達時，此酶一般可作為不溶性顆粒(稱作包涵體)留在細(xì)胞質(zhì)中或者由細(xì)菌分泌序列指導(dǎo)分泌至壁膜間隙。在前一種情況下，將細(xì)胞裂解并且回收顆粒并變性，此后通過稀釋變性劑使酶再折疊。在后一種情況下，可以通過破碎細(xì)胞 (如通過超聲處理或滲透休克以便釋放壁膜間隙內(nèi)容物)從壁膜間隙獲得酶，并且回收酶。
當(dāng)酶在革蘭氏陽性細(xì)菌諸如芽孢桿菌或鏈霉菌菌株中表達時，酶可以滯留在細(xì)胞質(zhì)中或者由細(xì)菌分泌序列指導(dǎo)分泌至細(xì)胞外培養(yǎng)基。在后一種情況下，如下所述可以從培養(yǎng)基中獲得酶。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，真菌宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞。如此處所用的“酵母” 包括產(chǎn)子囊酵母(內(nèi)孢霉目(Endomycetales))、產(chǎn)擔(dān)孢子目(basidiosporogenous)和屬于半知菌類的酵母(芽酵母屬(Blastomycetes))。由于酵母的分類將來可能變化,為了本發(fā)明的目的，酵母應(yīng)當(dāng)如 Biology andActivities of Yeast (Skinner, F. A. , Passmore,S. M.和 Davenport, R. R.，編者，Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9,1980)所描述進行定義。
在優(yōu)選實施方案中，酵母宿主細(xì)胞是假絲酵母屬、漢遜酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬或亞羅酵母屬細(xì)胞。
在更優(yōu)選實施方案中，酵母宿主細(xì)胞是卡爾酵母、釀酒酵母、糖化酵母、 Saccharomyces douglasi1、克魯弗酵母、諾地酵母或 Saccharomyces oviformis 細(xì)胞。在另一個最優(yōu)選的實施方案中，酵母宿主細(xì)胞是乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces Iactis)細(xì)胞。在另一個最選的實施方案中，酵母宿主細(xì)胞是解脂耶氏酵母(Yarrowia Iipolytica) 細(xì)胞。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，真菌宿主細(xì)胞是絲狀真菌細(xì)胞。“絲狀真菌”包括真菌門(Eumycota)和卵菌門(Oomycota)亞門的所有真菌(如Hawksworth等，1995,見上,所定義)。絲狀真菌的特征為具有由殼多糖、纖維素、葡聚糖、殼聚糖、甘露聚糖和其它復(fù)雜多糖構(gòu)成的菌絲壁。營養(yǎng)生長通過菌絲延長進行并且碳代謝是專性需氧。與此不同，酵母例如釀酒酵母的營養(yǎng)生長是通過單細(xì)胞菌體的出芽進行并且碳代謝可以是發(fā)酵。
在甚至更加優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主 細(xì)胞是如鐮孢霉屬、頂孢霉屬、曲霉屬、腐質(zhì)霉屬、毛霉屬、毀絲霉屬、脈抱圃屬、青霉屬、梭抱殼屬、彎頸霉屬或木霉屬各種的細(xì)胞，但不限于此。
在最優(yōu)選實施方案中，所述的絲狀真菌宿主細(xì)胞是泡盛曲霉、臭曲霉、日本曲霉、 構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、米曲霉細(xì)胞。在另一個最優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞是桿孢狀鐮孢、Fusarium cerealis、Fusarium crookwellense、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝抱鍵抱、硫色鍵抱菌、Fusariumtorulosum、Fusarium trichothecioides、Fusarium venenatum細(xì)胞。在甚至最優(yōu)選的實施方案中，所述的絲狀真菌母細(xì)胞是Fusarium venenatum(Nirenberg sp. nov.)細(xì)胞。在另一個最優(yōu)選的實施方案中，所述的絲狀真菌宿主細(xì)胞是孤獨腐質(zhì)霉、柔毛腐質(zhì)霉、米黑毛霉、Myceliphthora thermophila、粗糙脈孢菌、 產(chǎn)紫青霉、Thielavia terrestris、哈茨木霉、康寧木霉、長柄木霉、李氏木霉或綠色木霉細(xì)胞。
真菌細(xì)胞可通過包括原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和細(xì)胞壁再生的方法以本身已知的方式轉(zhuǎn)化。適用于轉(zhuǎn)化曲霉屬宿主細(xì)胞的方法描述于EP 238023和Yelton等，1984， Proceedings of the National Academy of Sciences USA81 :1470-1474。適用于轉(zhuǎn)化鍵孢霉屬各種的方法描述于Malardier等，1989，Gene 78 :147-156和WO 96/00787。對酵母的轉(zhuǎn)化可使用 Becker 和 Guarente (在 Abelson, J. N.和 Simon, Μ.1.,編者，Guide to Yeast Genetics and MolecularBiology, Methods in Enzymology,第 194 卷，第 182-187 頁，Academic Press, Inc. , New York 中)；Ito 等，1983, Journal of Bacteriology 153 163 以及 Hinnen 等，1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75 1920中描述的方法進行。
產(chǎn)生本發(fā)明蛋白酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明蛋白酶的方法，所述方法包括
a)在誘導(dǎo)產(chǎn)生蛋白酶的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞，和
b)回收蛋白酶。
當(dāng)將包含編碼酶的DNA序列的表達載體轉(zhuǎn)化進入異源宿主細(xì)胞中時，有可能實現(xiàn)本發(fā)明酶的異源重組生產(chǎn)。
因此可以制造出高度純化的蛋白酶組合物，其特征在于不含同源雜質(zhì)。
在本發(fā)明上下文中，同源雜質(zhì)意指來自同源細(xì)胞的任何雜質(zhì)(例如除了本發(fā)明酶以外的其它多肽)，其中所述同源細(xì)胞是最始獲得本發(fā)明酶的細(xì)胞。
用于培養(yǎng)所轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基可以是適于所討論宿主細(xì)胞生長的任何常規(guī)培養(yǎng)基。所表達的蛋白酶可以方便地分泌到培養(yǎng)基中并且可通過眾所周知的方法從其中回收，其中所述方法包括經(jīng)離心或過濾從培養(yǎng)基中分離細(xì)胞、通過鹽例如硫酸銨沉淀方式沉淀培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)成分、隨后為層析方法例如離子交換層析、親和層析等等。
本發(fā)明蛋白酶的用途
本發(fā)明蛋白酶可用于眾多工業(yè)應(yīng)用中，尤其用于洗滌劑工業(yè)。因此，本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明蛋白酶的清潔組合物或洗滌劑組合物，優(yōu)選衣物洗滌組合物或洗碟組合物。
包含本發(fā)明蛋白酶的洗滌劑組合物
通常，清潔組合物和洗滌劑組合物在本領(lǐng)域內(nèi)經(jīng)充分描述，并且對適宜清潔組合物和洗滌劑組合物的進一步描述可參考WO 96/34946 ；W097/07202 ；W0 95/30011。
而且，此處的實施例證明本發(fā)明蛋白酶在洗滌劑中的穩(wěn)定性得到改善。
洗滌劑組合物
本發(fā)明的酶可添加至清潔組合物或洗滌劑組合物中并且因此成為它們的一種成分。
本發(fā)明的洗滌劑組合物可以配制成例如手洗或機洗衣物洗滌劑組合物(其包含適用于預(yù)處理臟織物的衣物添加劑組合物和漂洗加入的織物柔軟劑組合物)，或者配制成用于一般家居硬質(zhì)表面清潔操作的洗滌劑組合物，或者配制成用于手工用或機器用洗碟操作的洗滌劑組合物。
在一個特定方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明蛋白酶的洗滌劑添加劑。洗滌劑添加劑以及洗滌劑組合物可以包含一種或多種其它酶，如另一種蛋白酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、淀粉酶、糖酶、纖維素酶、果膠酶、甘露聚糖酶、arabinase、galactanase、木聚糖酶、氧化酶如蟲漆酶和/或過氧化物酶。
通常，所選則酶的特征應(yīng)當(dāng)與所選擇洗滌劑相容(例如最佳pH、與其它酶或非酶成份的相容性等等)，并且酶應(yīng)當(dāng)以有效量存在。
蛋白酶適宜蛋白酶包括那些動物來源、植物來源或微生物來源的蛋白酶。優(yōu)選微生物來源的蛋白酶?；瘜W(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程改造的突變體包括在內(nèi)。蛋白酶可以是絲氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶，優(yōu)選堿性微生物蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶。堿性蛋白酶的實例是枯草蛋白酶，尤其是那些源自芽孢桿菌屬的枯草蛋白酶，如枯草蛋白酶Novo、枯草蛋白酶 Carlsberg、枯草蛋白酶309、枯草蛋白酶147和枯草蛋白酶168 (在TO 89/06279中描述)。 胰蛋白酶樣蛋白酶的實例是胰蛋白酶(如豬或牛來源)和在WO 89/06270和W094/25583 中描述的鐮孢霉屬蛋白酶。
有用蛋白酶的實例是在WO 92/19729,WO 98/20115,WO 98/20116 和 WO 98/34946 中描述的變體，尤其在如下位置存在一個或多個替代的變體第27、36、56、76、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、120、123、159、167、170、206、218、222、224、232、235、236、 245、248、252 和 274 位(BPN，編號)。
優(yōu)選的可商業(yè)獲得的蛋白酶包括Alcalase 、Savinase 、Primase 、Duralase 、 Esperase 、Kannase (Novozymes A/S)、Maxatase 、Maxacal 、Maxapem 、Properase 、 Purafe c t 、Purafect OxP 、FN2 和 FN3 (Genencor International Inc·)。
脂肪酶適宜脂肪酶包括那些細(xì)菌來源或真菌來源的脂肪酶?；瘜W(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程改造的突變體包括在內(nèi)。有用脂肪酶的實例包括來自腐質(zhì)霉屬(同義詞嗜熱真菌屬)如在EP 258 068和EP 305 216中描述的柔毛腐質(zhì)霉或者在WO 96/13580中描述的孤獨腐質(zhì)霉的脂肪酶；假單胞菌脂肪酶如來自產(chǎn)堿假單胞菌(P.alcaligenes)或類產(chǎn)喊假單胞菌(P. pseudoalcaligenes) (EP 218272)、洋蔥假單胞菌(P. cepacia) (EP 331 376)、施氏假單胞菌(P. stutzeri) (GBI, 372，034)、熒光假單胞菌(P. fluorescens)、假單胞菌種 SD 705 菌株(Pseudomonas sp. strain SD 705) (W0 95/06720 和 WO 96/27002)、 P. wisconsinensis (W0 96/12012)的脂肪酶；芽孢桿菌脂肪酶如來自枯草芽胞桿菌 (Dartois 等，(1993), Biochemica et BiophysicaActa, 1131, 253-360)、嗜熱脂肪芽抱桿菌 (JP 64/744992)或短小芽孢桿菌(W0 91/16422)的脂肪酶。
另一些實例是如在WO 92/05249、TO 94/01541、EP 407 225、EP 260 105、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079和WO 97/07202中描述的那些脂肪酶變體。
優(yōu)選的可商業(yè)獲得的脂肪酶包括Lipolase 和LipolaseUltra (Novozymes A/ S)。
淀粉酶適宜(α和/或β )淀粉酶包括那些細(xì)菌來源或真菌來源的淀粉酶?；瘜W(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程改造的突變體包括在內(nèi)。淀粉酶包括例如自芽孢桿菌如更加詳細(xì)描述于GB I, 296，839中的地衣芽孢桿菌特定株獲得的α -淀粉酶。
有用淀粉酶的實例是在WO 94/02597,WO 94/18314,WO 96/23873 和 WO 97/43424 中描述的變體，尤其在 如下位置存在一個或多個替代的變體第15、23、105、106、124、128、 133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408 和 444 位。
可商業(yè)獲得的淀粉酶是Duramyl 、termamyl 、Fun gamy I 和 BAN (Novozymes A/ S)、Rapidase 和 Purastar (來自 Genencor International Inc.)。
纖維素酶適宜纖維素酶包括那些細(xì)菌來源或真菌來源的纖維素酶?；瘜W(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程改造的突變體包括在內(nèi)。適宜纖維素酶包括來自芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、腐質(zhì)霉屬、鐮孢霉屬、梭孢殼屬、頂孢霉屬的纖維素酶，例如公開于US 4, 435, 307、 US 5，648，263、US 5，691，178、US 5，776，757 和 W 89/09259 中的由孤獨腐質(zhì)霉、 Myceliphthora thermophila和尖鍵抱產(chǎn)生的真菌纖維素酶。
尤其適合的纖維素酶是助于護色的堿性或中性纖維素酶。此類纖維素酶的實例是在 EP 0495257、EP 0531372、WO 96/11262、WO 96/29397、W098/08940 中描述的纖維素酶。另一些實例是在 WO 94/07998、EP O 531 315、US 5，457，046、US 5，686，593、US 5，763，254、WO 95/24471, WO 98/12307 和 PCT/DK98/00299 中描述的那些纖維素酶變體。
可商業(yè)獲得的纖維素酶包括Celluzyme 和 Carezyme (NovozymesA/S)、 Clazinase 、和 Puradax HA (Genencor International Inc.)和 KAC-500(B) (KaoCorporation)。
過氧化物酶/氧化酶適宜過氧化物酶/氧化酶包括那些植物、細(xì)菌或真菌來源的過氧化物酶/氧化酶?；瘜W(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程改造的突變體包括在內(nèi)。有用過氧化物酶的實例包括來自鬼傘屬(Coprinus)如灰蓋鬼傘(C. cinereus)的過氧化物酶以及在WO 93/24618、WO 95/10602和WO 98/15257中描述的它們的變體。
通過添加包含一種或多種酶的單獨添加劑或通過添加包含所有這些酶的組合添加劑，使洗滌劑組合物中包含洗滌劑酶。本發(fā)明的洗滌劑添加劑(即單獨添加劑或組合添加劑)可配制成顆粒、液體、漿夜等。優(yōu)選的洗滌劑添加劑制劑是顆粒(尤其為非塵狀顆粒)、液體(尤其是穩(wěn)定液體)或漿液。
非塵狀的顆粒可例如按照US 4，106, 991和4，661，452中所公開那樣產(chǎn)生并且可任選地通過本領(lǐng)域已知的方法包衣。蠟質(zhì)包衣材料的實例是平均分子量為1000-20000的聚(環(huán)氧乙烷)產(chǎn)物(聚乙二醇，PEG);具有16-50個環(huán)氧乙烷單元的乙氧基化壬基酚；在醇中包含12-20個碳原子并且存在15-18個環(huán)氧乙烷單元的乙氧基化脂肪醇；脂肪醇；月旨肪酸以及脂肪酸的單甘油酯、二甘油酯和三甘油酯。適用于通過流化床技術(shù)形成膜的包衣材料的實例在GB143591中給出。液體酶制劑可以根據(jù)已建立方法通過加入多元醇如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸進行穩(wěn)定處理。經(jīng)保護的酶可根據(jù)在EP 238，216中公開的方法制備。
本發(fā)明的洗滌劑組合物可為任何方便形式，如棒狀、片狀、粉末、顆粒狀、糊狀或液體。液體洗滌劑可以是含水液體，一般含有高達70%的水和0-30%的有機溶劑，或者是非水液體。
洗滌劑組合物一般包含一種或多種表面活性劑，所述表面活性劑可以是包括半極性在內(nèi)的非離子表面活性劑和/或陰離子表面活性劑和/或陽離子表面活性劑和/或兩性離子表面活性劑。表面活性劑水平一般為重量的O. 1%-60%。當(dāng)在洗滌組合物中包含陰離子表面活性劑時，所述洗滌劑一般包含大約1%至大約4%的陰離子表面活性劑，例如直鏈烷基苯磺酸鈉、α烯烴磺酸酯、烷基硫酸鹽(脂肪醇硫酸鹽)、醇乙氧基硫酸鹽、仲烷基磺酸鹽、α硫代脂肪酸甲酯、烷基或烯基琥珀酸或皂。
當(dāng)在洗滌組合物中包含非離子表面活性劑時，所述洗滌劑一般包含大約O. 2%至大約40%的非離子表面活性劑，例如醇乙氧基化物、壬基苯酚乙氧基化物、烷基多葡糖苷、 烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸單乙醇酰胺、脂肪酸單乙醇酰胺、多羥基烷基脂肪酰胺或葡糖胺的N-?；鵑-烷基衍生物(“葡糖酰胺(glucamides) ” )。
洗滌劑可以包含0-65%的助洗劑或絡(luò)合劑，如沸石、二磷酸鹽、三磷酸鹽、膦酸鹽、 碳酸鹽、檸檬酸鹽、氨三乙酸、乙二胺四乙酸、二亞乙基三胺五乙酸、烷基或鏈烯基琥珀酸、 可溶性硅酸鹽或?qū)訝罟杷猁}(例如來自Hoechst的SKS-6)。
洗滌劑可以包含一種或多種聚合物。聚合物的實例是羧甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡啶N —氧化物、聚乙烯咪唑、聚羧酸酯如聚丙烯酸酯、 馬來酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。
洗滌劑可以包含含有過氧化氫源如過硼酸鹽或過碳酸鹽的漂白系統(tǒng)，其中所述過氧化氫源可與形成過酸的漂白激活物如四乙?；叶坊蛉甚Ａu苯磺酸鹽混合。備選地， 漂白系統(tǒng)可包含例如酰胺型、二酰亞胺型或砜型的過氧酸。
本發(fā)明洗滌劑組合物中的酶(類)可使用常規(guī)穩(wěn)定劑進行穩(wěn)定，穩(wěn)定劑如多元醇例如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸、或硼酸衍生物如芳香硼酸酯、或苯基硼酸衍生物如4-甲酰苯基硼酸，并且組合物可以按照如W092/19709和WO 92/19708中所述配制。
洗滌劑還可以包含其它常規(guī)洗滌劑成份例如織物調(diào)節(jié)劑，包括粘土、泡沫促進劑、 抑泡劑、防腐劑、污垢懸浮劑、防塵污再沾著劑、染料、殺菌劑、熒光增白劑、水溶助長劑、晦暗抑制劑或香料。
目前考慮按照相當(dāng)于每升洗滌液體O.01-100毫克酶蛋白、優(yōu)選每升洗滌液體 O. 05-5毫克酶蛋白、尤其每升洗滌液體O. 1-1毫克酶蛋白的量向洗滌劑組合物中加入任何酶，尤其是本發(fā)明的酶。
本發(fā)明的酶可以額外加入到WO 97/07202中所公開的洗滌劑配方。
本發(fā)明進一步在如下實施例中詳細(xì)描述，所述實施例無論如何不限制本發(fā)明所要求的范圍。
在洗滌劑組合物中，縮寫的組分標(biāo)識具有如下含義
LAS :直鏈C12烷基苯磺酸鈉
TAS :動物脂燒基硫酸納
XYAS :Cix-Ciy 烷基硫酸鈉
SS :分子式為2- 丁基辛酸的二級皂表面活性劑
25EY :與平均Y摩爾的環(huán)氧乙烷縮合的主要為C12-C15的直鏈伯醇
45EY :與平均Y摩爾的環(huán)氧乙烷縮合的主要為C14-C15的直鏈伯醇
XYEZS :每摩爾與平均Z摩爾的環(huán)氧乙烷縮合的Cix-Ciy烷基硫酸鈉
非離子表面活性劑由BASF GmbH以商品名Plurafax LF404銷售的C13-C15混合乙氧基化/丙氧基化脂肪醇，其具有平均程度為3. 8的乙氧基化作用和平均程度為4. 5的丙氧基化作用
CFAA C12-C14烷基N-甲基葡糖酰胺
TFAA C16-C18烷基N-甲基葡糖酰胺
硅酸鹽無定形硅酸鈉(SiO2 = Na2O比率=2. O)
NaSKS-6 :分子式為δ -Na2Si2O5的晶態(tài)層狀硅酸鹽
碳酸鹽無水碳酸鈉
磷酸鹽三聚磷酸鈉
ΜΑ/ΑΑ :馬來酸/丙烯酸為1:4的共聚物，其平均分子量大約為80，000
聚丙烯酸鹽由BASF GmbH以商品名PA30銷售的聚丙烯酸鹽同聚物，其平均分子量為8，000
沸石A :具有1-10微米的原始粒度大小的分子式為Na12 (AlO2SiO2) 12· 27H20的水合硅酸鋁鈉
檸檬酸鹽檸檬酸三鈉二水合物
檸檬酸梓檬酸
過硼酸鹽無水過硼酸鈉單水合物漂白劑，實驗式為NaBO2. H2O2
PB4 :無水過硼酸鈉四水合物
過碳酸鹽實驗式為2Na2C03. 3H202的無水過碳酸鈉漂白劑
TAED 四乙酰基乙二胺
CMC:羧甲基纖維素鈉
DETPMP :二亞乙基三胺五(亞甲基膦酸)，由Monsanto以商品名Dequest2060銷售
PVP :聚乙烯吡咯烷酮聚合物
EDDS :鈉鹽形式的乙二胺-N，N’ - 二琥珀酸，[S，S]異構(gòu)體
抑泡劑25%石蠟(熔點為50°C )，17%疏水二氧化硅，58%石蠟油
顆粒抑泡劑12%硅氧烷/ 二氧化硅，18%十八烷醇，70%顆粒形式淀粉
硫酸鹽無水硫酸鈉
HMWPEO :高分子量聚環(huán)氧乙烷
TAE25 :動物脂醇乙氧基化物(25)
洗滌劑實例I
本發(fā)明的顆粒狀織物清潔組合物可如下制備
權(quán)利要求
1.選自下列的蛋白酶a.包含與如SEQID NO: 2的第1-226位氨基酸所示氨基酸序列具有至少73%同一性的氨基酸序列的蛋白酶；和b.由在低嚴(yán)格條件下與下列序列雜交的核酸序列所編碼的蛋白酶(i)如SEQ ID NO:1的第127-804位核苷酸所示核酸序列的互補鏈，或( )至少100個核苷酸的(i)的亞序列；和c.與如SEQID NO:2的第1-266位氨基酸所示氨基酸序列相比具有1_50、優(yōu)選1_40或1-30、更優(yōu)選1-20、最優(yōu)選1-10個氨基酸替代的蛋白酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白酶，其中所述蛋白酶具有與如SEQID N0:2的第1-226位氨基酸所不氨基酸序列具有大于75. 0%、或大于80. 0%、或大于85. 0%、或大于90. 0%、或大于92. 0%、或大于94. 0%、或大于96. 0%、或大于97. 0%、或大于98. 0%、或大于99. 0%同一性的氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白酶，其包含如SEQID NO:2的第1-226位氨基酸所示的氨基酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白酶，其由如SEQID NO:2的第1-226位氨基酸所示的氨基酸序列組成。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任意一項所述的蛋白酶，其中所述蛋白酶是具有如SEQIDNO:2的第-25-226位氨基酸所示氨基酸序列的蛋白酶的變體，所述變體包含一個或多個氨基酸殘基的替代、缺失和/或插入。
6.蛋白酶或其變體，其中所述蛋白酶由克隆入在大腸桿菌(Escherichiacoli)DSM15940中存在的質(zhì)粒片段內(nèi)的多核苷酸的蛋白酶編碼部分所編碼，所述變體與所述蛋白酶的成熟部分具有大于73%的同一性。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的蛋白酶，其中所述蛋白酶與多核苷酸的蛋白酶編碼部分編碼的蛋白酶成熟部分具有大于75. 0%、或大于80. 0%、或大于85. 0%、或大于90. 0%、或大于92. 0%、或大于94. 0%、或大于96. 0%、或大于97. 0%、或大于98. 0%、或大于99. 0%的同一性，其中所述多核苷酸被克隆入在保藏號DSM 15940的大腸桿菌中存在的質(zhì)粒片段內(nèi)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的蛋白酶，其中所述蛋白酶包含由克隆入在大腸桿菌DSM15940中存在的質(zhì)粒片段內(nèi)的多核苷酸的蛋白酶編碼部分編碼的蛋白酶。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的蛋白酶，其中所述蛋白酶由克隆入在大腸桿菌DSM15940中存在的質(zhì)粒片段內(nèi)的多核苷酸的蛋白酶編碼部分所編碼的蛋白酶組成。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白酶，其中所述蛋白酶由在中等嚴(yán)格條件下、優(yōu)選在高嚴(yán)格條件下與下列序列雜交的核酸序列編碼(i)如SEQ ID NO:1的第127-804位核苷酸所示核酸序列的互補鏈，或( )至少100個核苷酸的(i)的亞序列。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任意一項所述的蛋白酶，其中所述蛋白酶是胰蛋白酶樣蛋白酶。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求中任意一項所述的蛋白酶，其中所述蛋白酶在35°C貯藏后具有至少50%的殘余活性，其中活性測定是按照“實施例V洗滌劑中的穩(wěn)定性”所述測試的。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的蛋白酶，其中所述蛋白酶在35°C貯藏后具有至少55%的殘余活性，例如在35°C貯藏后具有至少60%的殘余活性，更優(yōu)選地在35°C貯藏后具有至少65%的殘余活性。
14.所分離的核酸序列，其中所述核酸序列包含編碼前述權(quán)利要求中任意一項所定義蛋白酶的核酸序列。
15.編碼蛋白酶的所分離核酸序列，其中所述核酸序列選自a.與如SEQNO:1的第52-804位核苷酸所不核酸序列具有至少80%同一性的核酸序列；和b.在低嚴(yán)格條件下與下列序列雜交的核酸序列(i)如SEQ ID NO:1的第52-804位核苷酸所示核酸序列的互補鏈；或( )至少100個核苷酸的(i)的亞序列。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的核酸序列，其中所述核酸序列具有與如SEQIDNO:1的第52-804位核苷酸所示核酸序列具有至少86%，諸如至少87%，例如至少88%，優(yōu)選至少89%，諸如至少90%，例如至少91%，更優(yōu)選至少92%，諸如至少93%，例如至少94%，最優(yōu)選至少95%，諸如至少96%，例如至少97%，具體而言至少98%，優(yōu)選至少99%同一性的核酸序列。
17.包含權(quán)利要求14-16中任意一項所述的核酸序列的核酸構(gòu)建體，其中所述核酸構(gòu)建體與能夠指導(dǎo)蛋白酶在適宜宿主中表達的一種或多種控制序列有效連接。
18.重組表達載體，其中所述重組表達載體包含權(quán)利要求17的核酸構(gòu)建體、啟動子和轉(zhuǎn)錄終止信號以及翻譯終止信號。
19.重組宿主細(xì)胞,其中所述重組宿主細(xì)胞包含權(quán)利要求17的核酸構(gòu)建體。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的宿主細(xì)胞，其為真菌或酵母，優(yōu)選為絲狀真菌，尤其為曲霉屬(Aspergillus)ο
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的宿主細(xì)胞,其為米曲霉(Aspergillusoryzae)。
22.根據(jù)權(quán)利要求19所述的宿主細(xì)胞，其為細(xì)菌，優(yōu)選為芽孢桿菌屬(Bacillus)，尤其為遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)。
23.用于生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求1-13中任意一項所述蛋白酶的方法，所述方法包括a.在可誘導(dǎo)蛋白酶產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)如權(quán)利要求19-22中任意一項所定義的重組宿主細(xì)胞；和b.回收蛋白酶。
24.清潔組合物或洗滌劑組合物，優(yōu)選衣物洗滌組合物或洗碟組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1-13中任意一項所述的蛋白酶。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的組合物，其額外包含纖維素酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、氧化還原酶、另外的蛋白酶、淀粉酶或其混合物。
26.如權(quán)利要求1-13中任意一項所定義蛋白酶在清潔組合物或洗滌劑組合物中的用途。
27.用于清潔或洗滌硬質(zhì)表面或衣物的方法，所述方法包括將硬質(zhì)表面或衣物與權(quán)利要求25-26中所定義的組合物接觸。
全文摘要
本發(fā)明涉及在洗滌劑中具有改善穩(wěn)定性的蛋白酶。具體地，本發(fā)明涉及在洗滌劑組合物穩(wěn)定性改善的蛋白酶。此外，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明蛋白酶的清潔組合物或洗滌劑組合物以及此蛋白酶在洗滌劑組合物中的用途。
文檔編號C12N9/76GK102994486SQ20121047765
公開日2013年3月27日 申請日期2004年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月23日
發(fā)明者吳文平, K.V.約庫姆森, M.A.斯特林格 申請人:諾維信公司