本申請(qǐng)涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種從血漿中提取微小RNA的方法及其試劑盒。

背景技術(shù)：

近年來，隨著qPCR、RNA-seq等新興分子生物學(xué)研究技術(shù)的不斷發(fā)展，在RNA水平對(duì)生命事件進(jìn)行更為深入的研究已逐漸成為生命科學(xué)領(lǐng)域的焦點(diǎn)。微小RNA(MicroRNAs、miRNAs)是一類長度在17～25個(gè)堿基的小分子非編碼RNA，通過與靶基因轉(zhuǎn)錄本的互補(bǔ)結(jié)合，對(duì)靶基因的表達(dá)起負(fù)調(diào)節(jié)作用，或稱為基因沉默。這種基因沉默效應(yīng)在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、干細(xì)胞發(fā)育、腫瘤發(fā)生發(fā)展、感染與免疫等多種生理、病理過程中發(fā)揮重要作用。研究表明，miRNA基因占預(yù)測(cè)基因總數(shù)的3％～5％，調(diào)控大約20％--30％的蛋白編碼基因。miRNA成熟序列在不同物種中高度保守，在不同生物個(gè)體中的表達(dá)組織和時(shí)相也具有一定的保守性。

近年來大量研究表明，微小RNA的表達(dá)水平與多種腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。微小RNA既可以作為抑癌基因下調(diào)原癌基因活性，也可以作為癌基因下調(diào)抑癌基因活性。此外，許多研究報(bào)道微小RNA與其他疾病的發(fā)生發(fā)展具有密切聯(lián)系，包括調(diào)節(jié)胰島素分泌功能、影響神經(jīng)元生成等。多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病證明了微小RNA的病理生理作用，這些疾病包括脆性X染色體綜合征、Rett綜合征、唐氏綜合征、孤獨(dú)癥、阿爾茨海默病、神經(jīng)退行性疾病等。因而尋找疾病特異性miRNAs是未來分子診斷學(xué)發(fā)展的一個(gè)新方向。

循環(huán)系統(tǒng)中的miRNAs廣泛存在且非常穩(wěn)定，隨著疾病發(fā)生發(fā)展，循環(huán)miRNAs表達(dá)譜也會(huì)發(fā)生特異性改變，因此有可能成為疾病診斷、預(yù)后判斷及療效評(píng)價(jià)的新型生物標(biāo)志物。目前，血漿微小RNA作為其中一種重要的途徑已被廣泛的應(yīng)用于各類疾病的研究當(dāng)中。然而，血漿miRNA的提取方法主要是采用國外進(jìn)口試劑盒，但試劑盒提取血漿miRNA的具有價(jià)格昂貴、提取量少等缺點(diǎn)，提取的RNA總量往往不能滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本申請(qǐng)主要解決的技術(shù)問題是提供一種從血漿中提取微小RNA的方法及其試劑盒，能夠滿足下游微小RNA(miRNA)芯片表達(dá)譜和其他分子生物學(xué)各項(xiàng)試驗(yàn)的質(zhì)量要求。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明實(shí)施例采用的一個(gè)技術(shù)方案是：提供一種從血漿中提取微小RNA的方法，包括如下步驟：

步驟1：在血漿樣品中加入裂解液進(jìn)行裂解，得到裂解混合物，再在裂解混合物中加入去蛋白液進(jìn)行蛋白降解，得到第一混合液；

步驟2：在第一混合液中加入RNA抽提試劑進(jìn)行RNA抽提，得到抽提混合物，再在抽提混合物中加入氯仿震蕩混合，并進(jìn)行低溫離心分離，所得上層液體為第二混合液；

步驟3：在第二混合液中加入沉淀劑和助沉劑進(jìn)行RNA沉淀，得到沉淀混合物，將沉淀混合物進(jìn)行低溫離心分離，所得沉淀物為第一沉淀；

步驟4：將第一沉淀用洗滌液進(jìn)行洗滌，得到洗滌混合物，將洗滌混合物進(jìn)行低溫離心分離，所得沉淀物為第二沉淀，將第二沉淀用RNase-free的水進(jìn)行溶解，所得溶液即為含有微小RNA的提取樣品。

可選地，在步驟1中，所述裂解液為質(zhì)量濃度為10％的十二烷基硫酸鈉溶液，所述去蛋白液為20mg/ml的蛋白酶K溶液。

可選地，在步驟2中，所述RNA抽提試劑為Trizol試劑，低溫離心溫度為2～6℃。

可選地，在步驟3中，所述沉淀劑為異丙醇，所述助沉劑為糖原，低溫離心溫度為2～6℃。

可選地，在步驟4中，所述洗滌液為體積百分比為70％～80％的乙醇溶液，低溫離心溫度為2～6℃。

可選地，在步驟1中，所述血漿樣品與裂解液的體積比為1：1；在步驟2中，所述RNA抽提試劑與第一混合液的體積比為2：1，所述氯仿與所述抽提混合物的體積比為1：5；在步驟3中，所述沉淀劑與第二混合液的體積比為1：1。

可選地，在步驟1之前還包括由血液制備血漿的步驟。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明實(shí)施例采用的另一個(gè)技術(shù)方案是：提供一種從血漿中提取微小RNA的試劑盒，包括裂解液、去蛋白液、RNA抽提試劑、沉淀劑、助沉劑和洗滌液，其中，所述沉淀劑為異丙醇，所述助沉劑為15mg/ml的糖原溶液。

可選地，所述裂解液為質(zhì)量濃度為10％的十二烷基硫酸鈉溶液，所述去蛋白液為20mg/ml的蛋白酶K溶液，所述RNA抽提試劑為Trizol試劑，所述洗滌液為體積百分比為70％～80％的乙醇溶液。

可選地，還包括氯仿和RNase-free的水。

本申請(qǐng)實(shí)施例的有益效果是：區(qū)別于現(xiàn)有技術(shù)的情況，本發(fā)明實(shí)施例的提取方法首先進(jìn)行樣品裂解和去蛋白，再進(jìn)行RNA的抽提，使的與微小RNA結(jié)合的蛋白變性釋放出游離的微小RNA并保持微小RNA的完整性；本發(fā)明實(shí)施例的試劑盒中，裂解液和去蛋白試液同時(shí)使用有助于充分降解與微小RNA結(jié)合的蛋白，沉淀劑異丙醇以及助沉劑糖原同時(shí)使用極大地提高了微小RNA回收效率。

附圖說明

為了更清楚地說明本申請(qǐng)實(shí)施例的技術(shù)方案，下面將對(duì)本申請(qǐng)實(shí)施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹。顯而易見地，下面所描述的附圖僅僅是本申請(qǐng)的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)。

圖1是本發(fā)明實(shí)施例3與比較例提取RNA總量的比較圖。

圖2是本發(fā)明實(shí)施例3與比較例提取外參cel-miR-39效率的比較圖。

圖3是本發(fā)明實(shí)施例與比較例miRNA芯片掃描結(jié)果的組內(nèi)比較圖。

圖4是本發(fā)明實(shí)施例與比較例miRNA芯片掃描結(jié)果的組間比較圖。

具體實(shí)施方式

為了使本申請(qǐng)的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本申請(qǐng)進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅用以解釋本申請(qǐng)，并不用于限定本申請(qǐng)。

本發(fā)明實(shí)施例為了滿足下游微小RNA芯片表達(dá)譜和其他分子生物學(xué)各項(xiàng)試驗(yàn)的質(zhì)量要求，提供一種從血漿中提取微小RNA的方法包括如下步驟：

步驟1：在血漿樣品中加入裂解液進(jìn)行裂解，得到裂解混合物，再在裂解混合物中加入去蛋白液進(jìn)行蛋白降解，得到第一混合液；

步驟2：在第一混合液中加入RNA抽提試劑進(jìn)行RNA抽提，得到抽提混合物，再在抽提混合物中加入氯仿震蕩混合，并進(jìn)行低溫離心分離，所得上層液體為第二混合液；

步驟3：在第二混合液中加入沉淀劑和助沉劑進(jìn)行RNA沉淀，得到沉淀混合物，將沉淀混合物進(jìn)行低溫離心分離，所得沉淀物為第一沉淀；

步驟4：將第一沉淀用洗滌液進(jìn)行洗滌，得到洗滌混合物，將洗滌混合物進(jìn)行低溫離心分離，所得沉淀物為第二沉淀，將第二沉淀用RNase-free的水進(jìn)行溶解，所得溶液即為含有微小RNA的提取樣品。

在一些可選實(shí)施方式中，在步驟1中，所述裂解液為質(zhì)量濃度為10％的十二烷基硫酸鈉溶液，所述去蛋白液為20mg/ml的蛋白酶K溶液。在步驟2中，所述RNA抽提試劑為Trizol試劑，低溫離心溫度為2～6℃。在步驟3中，所述沉淀劑為異丙醇，所述助沉劑為糖原，低溫離心溫度為2～6℃。在步驟4中，所述洗滌液為體積百分比為70％～80％的乙醇溶液，低溫離心溫度為2～6℃。在步驟1中，所述血漿樣品與裂解液的體積比為1：1；在步驟2中，所述RNA抽提試劑與第一混合液的體積比為2：1，所述氯仿與所述抽提混合物的體積比為1：5；在步驟3中，所述沉淀劑與第二混合液的體積比為1：1。在步驟1之前還包括由血液制備血漿的步驟。

提取血漿中微小RNA的關(guān)鍵在于消除RNA降解酶(RNase)的污染和解離與微小RNA特異結(jié)合的蛋白。本發(fā)明實(shí)施例的方法在血漿中加入蛋白酶K主要有兩個(gè)作用，一方面蛋白酶K可以滅活RNase A，另一方面蛋白酶K可以降解蛋白，使的與微小RNA結(jié)合的蛋白變性釋放出游離的微小RNA，高濃度10％SDS能迅速破壞RNase，保持微小RNA的完整性。

在一些可選實(shí)施方式中，步驟1中，將混合液放入75℃水浴5分鐘可有效的提升蛋白酶K和SDS去蛋白的協(xié)同作用，隨后在42℃溫浴1小時(shí)，目的是讓蛋白酶K和SDS與血漿充分反應(yīng)，徹底降解微小RNA結(jié)合蛋白。

血漿中的微小RNA及其微量，除了防止RNase的降解之外，高效獲取血漿中的微小RNA的另一個(gè)關(guān)鍵步驟是如何充分沉淀提取液中的微小RNA，在一些可選實(shí)施方式中，在步驟3中，采用異丙醇沉淀RNA的同時(shí)，加入了1μL 15mg/mL糖原。糖原是一種有效的核酸助沉劑，能吸附核酸，極大地提高異丙醇沉淀的RNA回收效率。

在一些可選實(shí)施方式中，在步驟3中，將沉淀混合物于-80℃超低溫靜置，進(jìn)一步抑制RNase作用的同時(shí)可提高RNA沉淀效率。

本發(fā)明實(shí)施例還提供了一種應(yīng)用上述方法進(jìn)行微小RNA提取的試劑盒，包括裂解液、去蛋白液、RNA抽提試劑、沉淀劑、助沉劑和洗滌液，其中，所述沉淀劑為異丙醇，所述助沉劑為15mg/ml的糖原溶液。

在一些可選實(shí)施方式中，所述裂解液為質(zhì)量濃度為10％的十二烷基硫酸鈉溶液，所述去蛋白液為20mg/ml的蛋白酶K溶液，所述RNA抽提試劑為Trizol試劑，所述洗滌液為體積百分比為70％～80％的乙醇。在一些可選實(shí)施方式中，該試劑盒還包括氯仿和RNase-free的水。

實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用為健康人血漿，保存于-80℃低溫冰箱。對(duì)照組采用MiRNeasy Serum/Plasma kit(QIAGEN GmbH,Hilden,Germany,Cat no.217184)試劑盒，按照標(biāo)準(zhǔn)流程操作。Trizol試劑(Trizol LS，Ambion)，糖原(Ambion)。

實(shí)施例1

一種用于提取人血漿中微小RNA的方法，按照以下步驟：

(1)收集人抗凝全血混勻后，500rpm離心10分鐘，去除血細(xì)胞，得到血漿樣本保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

(2)取上述血漿樣本200μL于1.5mL離心管中，加入200μL 10％十二烷基硫酸鈉(SDS)進(jìn)行1:1混合，再加入1μL蛋白酶K20mg/ml，75℃加熱5分鐘；再42℃溫浴消化1h。

(3)將處理后的樣本加入2倍體積的Trizol試劑，混勻，室溫靜置5min；加入20％體積氯仿，震蕩15秒，靜置2分鐘；12000rpm、4℃離心15分鐘，取上清。

(4)加入等體積異丙醇和1μL 15mg/ml糖原，混勻，-80℃靜置過夜。

(5)12000rpm、4℃離心15分鐘，收集沉淀，用75％的乙醇洗滌；12000rpm、4℃，離心5分鐘，收集沉淀，室溫干燥，加入14μL RNase-free水溶解后，-80℃保存。

(6)用nanodrop 2000分光光度計(jì)檢測(cè)RNA在260nm處的吸光值，并換算成相應(yīng)濃度。

實(shí)施例2

一種用于提取人血漿中微小RNA的方法，按照以下步驟：

(1)收集人抗凝全血混勻后，500rpm離心10分鐘，去除血細(xì)胞，得到血漿樣本保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

(2)取上述血漿樣本200μL于1.5mL離心管中，加入200μL 10％十二烷基硫酸鈉(SDS)，同時(shí)加入1μL蛋白酶K 20mg/ml，震蕩混勻，75℃加熱5分鐘，42℃溫浴1小時(shí)。

(3)將處理后的樣本加入2倍體積的Trizol試劑，混勻，室溫靜置5min；加入20％體積氯仿，震蕩15秒，靜置2分鐘；12000rpm、4℃離心15分鐘，取上清。

(4)加入等體積異丙醇和1μL 15mg/ml糖原，混勻，-80℃靜置過夜(8～12小時(shí))。

(5)12000rpm、4℃離心15分鐘，收集沉淀，用75％的乙醇洗滌；12000rpm、4℃，離心5分鐘，收集沉淀，室溫干燥，加入14μL RNase-free水溶解后，-80℃保存。

(6)用nanodrop 2000分光光度計(jì)檢測(cè)RNA在260nm處的吸光值，并換算成相應(yīng)濃度。

實(shí)施例3

一種用于提取人血漿中微小RNA的方法，按照以下步驟：

(1)采集人血漿200μL，加入1μL蛋白酶K 20mg/ml和等體積10％SDS，震蕩混勻。

(2)75℃加熱5分鐘，42℃溫浴1小時(shí)。

(3)加入2倍體積Trisol試劑，1/5倍體積氯仿，震蕩混勻，靜置15分鐘。

(4)4℃,12000rpm離心15分鐘，取上清，加入等體積異丙醇和1μL 15mg/ml糖原。

(5)-80℃靜置過夜，4℃，12000rpm離心10分鐘。

(6)收集沉淀，用75％的乙醇洗滌，4℃，12000rpm離心5分鐘。

(7)收集沉淀，室溫干燥，加入14μL RNase-free水溶解后，-80℃保存。

比較例

采用QIAGEN公司的MiRNeasy Serum/Plasma kit的試劑盒(Cat no.217184)，取血漿樣本200μL，嚴(yán)格按試劑盒說明操作，提取微小RNA后-80℃保存。

RNA濃度檢測(cè)

采用nanodrop 2000分光光度計(jì)檢測(cè)RNA在260nm處的吸光值，并換算成相應(yīng)濃度。

加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

在提取過程中加入了3.5μL cel-miR-39(1.6×108copies/μL)，采用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)cel-miR-39的Cq值。通過一系列梯度稀釋cel-miR-39標(biāo)準(zhǔn)品的熒光定量PCR的Cq值，繪制相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)算加標(biāo)回收率。

制備cel-miR-39濃度和Cq值的標(biāo)準(zhǔn)曲線

1)在冰上制備反轉(zhuǎn)錄體系：在PCR反應(yīng)管中依次加入2.2μL 1.0×108copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)品，2μL RNA樣本(～100ng)，4μL 5×mi Script Buffer，2μL 10×miScript Nucleics Mix，7.8μL RNase-free water，2μL miScript Reverse Transcriptase Mix。2)混合后簡單離心，置于冰上。3)37℃水浴60分鐘，95℃熱激5分鐘，然后置于冰上。4)加入200μL去RNase水稀釋反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。5)將稀釋的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物按梯度配成5.0×105copies/μL，5.0×104copies/μL，5.0×103copies/μL，5.0×102copies/μL濃度的cel-miR-39 cDNA稀釋液。6)熒光定量PCR：各取上述稀釋液2μL cel-miR-39 cDNA進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系：12.5μL 2×QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix，2.5μL 10×miScript Universal Primer，2.5μL 10×Cel-miR-39miScript Primer Assay，5.5μL RNase-free water，2μL cel-miR-39 cDNA。反應(yīng)流程：先95℃熱激15分鐘。然后94℃，15秒；55℃，30秒；70℃，34秒；(40個(gè)循環(huán))。測(cè)得各濃度cel-miR-39的Cq值，繪制濃度和Cq值的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

檢測(cè)cel-miR-39的加標(biāo)回收率

1)在冰上制備反轉(zhuǎn)錄體系：在PCR反應(yīng)管中依次加入2.2μL 1.0×108copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)品，2μL RNA樣本(～100ng)，4μL 5×miScript Buffer，2μL 10×miScript Nucleics Mix，7.8μL RNase-free water，2μL miScript Reverse Transcriptase Mix。2)混合后簡單離心，置于冰上。3)37℃水浴60分鐘，95℃熱激5分鐘，然后置于冰上。4)加入200μL去RNase水稀釋反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。5)熒光定量PCR：反應(yīng)體系：12.5μL 2×QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix，2.5μL 10×miScript Universal Primer，2.5μL 10×Cel-miR-39 miScript Primer Assay，5.5μL RNase-free water，2μL上述反轉(zhuǎn)錄稀釋產(chǎn)物。反應(yīng)流程：先95℃熱激15分鐘。然后94℃，15秒；55℃，30秒；70℃，34秒；(40個(gè)循環(huán))。檢測(cè)加標(biāo)cel-miR-39的Cq值，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出加標(biāo)回收率。

miRNA芯片分析

1)熒光標(biāo)記與ELISA質(zhì)控：用FlashTag Biotin HSR試劑盒對(duì)樣品總RNA中小分子量RNA進(jìn)行加尾和生物素標(biāo)記。標(biāo)記完成后，吸取2μL標(biāo)記完成的樣本做ELISA質(zhì)控(參考試劑盒說明)，樣品孔顯示藍(lán)色，Biotin標(biāo)記成功，加100μL終止液，溶液變黃，酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光值，樣本在450nm的吸光度比陰性對(duì)照多0.1以上，證明合格。2)miRNA芯片檢測(cè)及信號(hào)分析：將標(biāo)記好的樣品與miRNA 4.0芯片(Affymetrix)雜交、洗染，將洗染后的芯片置于GCS3000型芯片掃描儀(Affymetrix)掃描。將掃描芯片得到的原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入Expression Console軟件中(Affymetrix)，扣除背景，計(jì)算重復(fù)點(diǎn)平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，然后將數(shù)據(jù)歸一化，進(jìn)行組內(nèi)和組間比較。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

RNA定量檢測(cè)結(jié)果

本發(fā)明實(shí)施例采用nanodrop 2000分光光度計(jì)(Thermo Scientific)檢測(cè)RNA在260nm處的吸光值，并換算成相應(yīng)濃度。結(jié)果顯示實(shí)施例3所提取的RNA總量是比較例的19.1倍(P＜0.01)，實(shí)施例3明顯高于比較例，請(qǐng)參閱圖1所示，其中，*P＜0.01。

Cel-miR-39外參回收率

本發(fā)明實(shí)施例的方法在提取過程中加入了3.5μL cel-miR-39(1.6×108copies/μL)，采用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)加標(biāo)回收率。結(jié)果顯示實(shí)施例3得到的加標(biāo)回收率使比較例的13.9倍(P＜0.01)，請(qǐng)參閱圖2所示。

miRNA芯片掃描結(jié)果

1)組內(nèi)比較：如圖3所示，A、B、C三圖表示采用試劑盒(MiRNeasy Serum/Plasma kit,QIAGEN GmbH,Hilden,Germany)提取(比較例)的血漿miRNA的芯片信號(hào)結(jié)果，D、E、F表示采用本發(fā)明實(shí)施例方法提取(實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例3)的血漿miRNA的芯片信號(hào)結(jié)果，坐標(biāo)中對(duì)應(yīng)的數(shù)字均為芯片信號(hào)值的log2對(duì)數(shù)值。對(duì)二維點(diǎn)陣圖做線性回歸，比較例斜率分別為0.9110，08731，0.8991；平均值為0.8944；實(shí)施例3斜率分別為0.7950，0.9011，0.9554；平均值為0.8838。兩組斜率的均值比較接近，提示實(shí)施例和比較例的實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性相當(dāng)(斜率越接近1.0，實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性越好)。

2)組間比較：如圖4所示，取在實(shí)施例和比較例的平均信號(hào)值的log2對(duì)數(shù)值進(jìn)行比較，從圖中可以看出比較例和實(shí)施例回歸顯示有相關(guān)性，R2＝0.613,提示兩組之間的實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有相關(guān)性。

以上所述僅為本申請(qǐng)的實(shí)施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本申請(qǐng)說明書及附圖內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運(yùn)用在其他相關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域，均同理包括在本申請(qǐng)的專利保護(hù)范圍內(nèi)。