本發(fā)明屬于生物檢測領(lǐng)域，涉及利用多重PCR技術(shù)對產(chǎn)毒真菌進(jìn)行快速檢測鑒定的引物組、試劑盒及檢測方法。具體而言，本發(fā)明涉及針對產(chǎn)黃曲霉毒素真菌的多重PCR檢測用引物組、試劑盒及檢測方法。

背景技術(shù)：

黃曲霉毒素(Aflatoxin，AFT)是主要由黃曲霉(A.flavus)、寄生曲霉(A.parasiticus)及特曲霉(A.nomius)等真菌產(chǎn)生的一類化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的次級代謝產(chǎn)物，現(xiàn)已分離出AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2、AFB2a、AFG2a、AFBM2a及AFGM2a等多達(dá)18種不同的黃曲霉毒素，其中AFB1的毒性最強(qiáng)且化學(xué)性質(zhì)最穩(wěn)定，它具有很強(qiáng)的致癌性、致突變性和致畸性，是國際上公認(rèn)的A類致癌物。大量的調(diào)查研究證實，AFB1主要作用的靶器官為肝臟，AFB1能夠?qū)е赂闻K壞死或肝癌形成；此外，AFB1還會影響動物胚胎發(fā)育，造成免疫抑制和反復(fù)感染，導(dǎo)致動物的產(chǎn)奶量或產(chǎn)蛋量降低。黃曲霉毒素主要污染花生、玉米、大豆、小麥、堅果等農(nóng)作物及其制品；此外，肉類、乳及乳制品、水產(chǎn)品、發(fā)酵食品等也存在被黃曲霉毒素污染的風(fēng)險。黃曲霉毒素污染不僅導(dǎo)致食品自身營養(yǎng)價值和經(jīng)濟(jì)價值的降低，更對人畜生命安全造成巨大的潛在威脅。

目前，國內(nèi)外研究的焦點主要集中在黃曲霉毒素的檢測方法，制定了包含薄層層析法、液相色譜法、放射免疫分析方法、酶聯(lián)免疫法、免疫層析法等在內(nèi)的比較成熟的檢測規(guī)范。然而，這些方法也存在例如周期長、程序復(fù)雜、成本高等諸多不足之處。針對產(chǎn)黃曲霉毒素真菌本身的檢測技術(shù)鮮有報道，遠(yuǎn)落后于相關(guān)毒素檢測技術(shù)的研究與應(yīng)用。迄今為止，對產(chǎn)黃曲霉毒素真菌的檢測主要沿用傳統(tǒng)的培養(yǎng)鑒定方法，即，在分離得到病原菌單菌落的基礎(chǔ)上，通過形態(tài)學(xué)觀察和科赫法則來判斷病原菌的種類，同時采用病原菌產(chǎn)毒能力檢測來進(jìn)行驗證，但這一傳統(tǒng)方法實施起來比較困難。例如，整個檢測鑒定過程常常需要昂貴的設(shè)備，并且要求操作者具備專業(yè)的病原菌分離技術(shù)、形態(tài)學(xué)鑒定知識和豐富的 經(jīng)驗，費時費力，一般需要幾天才能完成。此外，傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定方法由于耗時長而效率低，而且容易出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果，難以滿足對產(chǎn)黃曲霉毒素真菌快速靈敏檢測的實際需要。

近年來，借助于分子生物學(xué)技術(shù)，對產(chǎn)黃曲霉毒素真菌的快速檢測有了很大發(fā)展。例如，檢測標(biāo)準(zhǔn)SN/T 2582-2010建立了產(chǎn)黃曲霉毒素真菌的PCR檢測方法，實現(xiàn)了分別針對真菌通用分子標(biāo)識序列(內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列ITS)及黃曲霉毒素生化合成過程中三個關(guān)鍵基因(產(chǎn)黃曲霉毒素調(diào)節(jié)基因aflR、柄曲霉素轉(zhuǎn)甲氧基酶基因omt-1及雜色曲霉素A脫氫酶基因ver-1)的單重PCR檢測。然而，操作相對繁瑣、影響因素較多、檢測通量相對不足等缺陷影響了這一單重PCR檢測技術(shù)在產(chǎn)黃曲霉毒素真菌檢測中的廣泛應(yīng)用與發(fā)展。

相比之下，多重PCR技術(shù)能在同一PCR反應(yīng)體系內(nèi)實現(xiàn)對多個目標(biāo)基因的同步擴(kuò)增，從而能夠快速、靈敏、特異地進(jìn)行檢測。具體而言，多重PCR檢測法采用將多個目標(biāo)基因聯(lián)用的方式，通過不同目標(biāo)基因間檢測結(jié)果的互相映證，可實現(xiàn)提高檢測準(zhǔn)確度、降低假陽性率的效果。

在影響多重PCR檢測的諸多因素中，目標(biāo)基因的數(shù)目和種類的選取至關(guān)重要。若目標(biāo)基因的數(shù)目過多，PCR體系中加入的引物對數(shù)量過多，產(chǎn)生非預(yù)期反應(yīng)的概率增大，導(dǎo)致電泳鑒定圖中出現(xiàn)雜帶或造成拖尾等，從而影響檢測效率；而若將引物加入不同的PCR體系分別進(jìn)行反應(yīng)，勢必又會降低通量并增加檢測工作量。另外，目標(biāo)基因種類的選取對于是否能夠有效進(jìn)行多重PCR檢測而言也是關(guān)鍵因素之一：如果目標(biāo)基因特異性過高(即種屬分布過窄)，會造成檢測覆蓋種類不足，從而造成漏檢等問題；反之，則可能會引起假陽性率高等弊端。

進(jìn)而，在選定目標(biāo)基因后，針對多個目標(biāo)基因進(jìn)行的引物設(shè)計同樣可能從根本上影響多重PCR檢測的結(jié)果：由于需要在同一PCR體系中針對不同目標(biāo)基因進(jìn)行同步擴(kuò)增，適宜各引物對的反應(yīng)條件需能夠彼此配合、且各引物對之間不會相互干擾，從而確保針對各目標(biāo)基因的PCR反應(yīng)均能夠順利、準(zhǔn)確地進(jìn)行。

目前，已發(fā)展出少量用于對產(chǎn)黃曲霉毒素真菌進(jìn)行檢測的多重PCR 技術(shù)。例如，秦文彥等(可污染食品及飼料的產(chǎn)黃曲霉毒素真菌的多重PCR檢測，《菌物學(xué)報》26(3)：448～454，2007)公開了根據(jù)黃曲霉毒素生化途徑中的關(guān)鍵調(diào)控基因aflR、omt-1和ver-1的序列以及真菌共有的5.8S rDNA的ITS序列分別設(shè)計四對引物，并利用這些引物建立了以可能被真菌污染的飼料或食品為檢測對象的多重PCR檢測體系。當(dāng)模板DNA濃度降至0.1ng/μL時，aflR基因擴(kuò)增片段完全消失，表明該體系的總體靈敏度為2ng/μL(靈敏度計算方式參見下文的具體描述)，考慮到黃曲霉毒素極強(qiáng)的毒性和致癌力，這一靈敏度仍亟待提高。此外，CN103103258A也公開了一種利用多重PCR技術(shù)分析花生粕中黃曲霉毒素的方法，然而，CN103103258A中并未提及該方法的靈敏度，因而難以知曉其是否能滿足實際檢測要求，事實上，CN103103258A中使用的四對引物與秦文彥等(可污染食品及飼料的產(chǎn)黃曲霉毒素真菌的多重PCR檢測，《菌物學(xué)報》26(3)：448～454，2007)中使用的四對引物完全相同，因而推測其靈敏度同樣至多為2ng/μL。

可見，現(xiàn)有技術(shù)并不能完全滿足產(chǎn)黃曲霉毒素真菌檢測的需求。因此，建立一種快速、靈敏、特異、準(zhǔn)確、高效的產(chǎn)黃曲霉毒素真菌多重PCR檢測技術(shù)顯得尤為迫切。這是解決產(chǎn)黃曲霉毒素真菌侵染的檢測問題的重要途徑，此類方法具有良好的應(yīng)用與發(fā)展前景。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對上述技術(shù)問題，本發(fā)明組合利用了真菌通用分子標(biāo)識序列(內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列ITS)及黃曲霉毒素生化合成過程中三個關(guān)鍵基因(產(chǎn)黃曲霉毒素調(diào)節(jié)基因aflR、柄曲霉素轉(zhuǎn)甲氧基酶基因omt-1及雜色曲霉素A脫氫酶基因ver-1)，采用多重PCR技術(shù)對產(chǎn)黃曲霉毒素真菌進(jìn)行快速檢測。本發(fā)明在比對分析產(chǎn)黃曲霉毒素真菌PCR檢測方法標(biāo)準(zhǔn)《SN/T 2582-2010產(chǎn)黃曲霉毒素真菌PCR檢測方法》的基礎(chǔ)上優(yōu)化設(shè)計，篩選出覆蓋范圍廣、特異性強(qiáng)、靈敏度高的相應(yīng)引物對及引物組，優(yōu)化組合建立了多重PCR檢測體系，并開發(fā)了產(chǎn)黃曲霉毒素真菌多重PCR檢測用試劑盒；同時，建立了檢測覆蓋范圍廣、特異性強(qiáng)且靈敏度高的檢測方法，由此完成了本發(fā)明。

在第一方面，本發(fā)明提供了一種用于快速檢測產(chǎn)黃曲霉毒素真菌的 多重PCR檢測用引物組，所述多重PCR檢測用引物組由特異性針對真菌內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列ITS的ITS引物對、特異性針對產(chǎn)黃曲霉毒素調(diào)節(jié)基因aflR的aflR引物對、特異性針對柄曲霉素轉(zhuǎn)甲氧基酶基因omt-1的omt-1引物對及特異性針對雜色曲霉素A脫氫酶基因ver-1的ver-1引物對組成，其中，

所述ITS引物對的序列為：

上游引物ITS-600-F：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCG-3’(SEQ ID NO：1)；

下游引物ITS-600-R：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’(SEQ ID NO：2)，

所述aflR引物對的序列為：

上游引物aflR-421-F：5’-AGCAAAGCACCCTGTCTTC-3’(SEQ ID NO：3)；

下游引物aflR-421-R：5’-TTGAGAACGATAAGGACGACC-3’(SEQ ID NO：4)，

所述omt-1引物對的序列為：

上游引物omt-1-317-F：5’-TCATTTTCGAGGAGGTTGCC-3’(SEQ ID NO：5)；

下游引物omt-1-317-R：5’-AGCTGTTTCTCGCATTTCAGC-3’(SEQ ID NO：6)，

所述ver-1引物對的序列為：

上游引物ver-1-201-F：5’-TTCGGTCACCTGAAAGACG-3’(SEQ ID NO：7)；

下游引物ver-1-201-R：5’-TGACGCAAGCGGTGTTAG-3’(SEQ ID NO：8)。

在第二方面，本發(fā)明提供了一種用于快速檢測產(chǎn)黃曲霉毒素真菌的多重PCR檢測用試劑盒，所述試劑盒中包含如本發(fā)明第一方面所述的多重PCR檢測用引物組。

在第三方面，本發(fā)明還提供了一種使用本發(fā)明的多重PCR檢測用引物組或多重PCR檢測用試劑盒對產(chǎn)黃曲霉毒素真菌進(jìn)行快速檢測的方 法，所述方法包括以下步驟：

a)提取待檢測樣品的總DNA作為模板DNA的步驟；

b)使用如本發(fā)明第一方面所述的多重PCR檢測用引物組或如本發(fā)明第二方面所述的多重PCR檢測用試劑盒對所述模板DNA進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增的步驟；

c)對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測的步驟；

從而對所述待檢測樣品中產(chǎn)黃曲霉毒素真菌的存在與否進(jìn)行分析。

本發(fā)明所提供的針對產(chǎn)黃曲霉毒素真菌的多重PCR檢測用引物組、試劑盒及檢測方法具有檢測適用面廣、對產(chǎn)黃曲霉毒素真菌種屬覆蓋全面、特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)勢，從而有效解決了現(xiàn)行檢測標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)中報道的針對產(chǎn)黃曲霉毒素真菌的PCR檢測方法中由檢測覆蓋種類不足、引物特異性差及靈敏度不強(qiáng)等因素造成的漏檢、假陽性等問題。此外，本發(fā)明提供的針對產(chǎn)黃曲霉毒素真菌的多重PCR用檢測引物組、試劑盒及檢測方法還具備檢測耗時短、檢測通量高、操作較簡單、設(shè)備要求低等特點，可以節(jié)省大量的人力、物力和財力，適合高通量快速檢測的要求，具有廣泛的推廣應(yīng)用市場前景。

具體實施方式

根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，除本發(fā)明的多重PCR檢測用引物組外，本發(fā)明的多重PCR檢測用試劑盒中可進(jìn)一步包含反應(yīng)緩沖液、4種脫氧核苷三磷酸、DNA聚合酶等成分。

根據(jù)本發(fā)明一些優(yōu)選的實施方式，除本發(fā)明的多重PCR檢測用引物組外，本發(fā)明的多重PCR檢測用試劑盒中可進(jìn)一步包含具有如下成分的PCR反應(yīng)基礎(chǔ)溶液：Tris-HCl；KCl；MgCl₂；dATP、dTTP、dGTP及dCTP；以及Taq DNA聚合酶。

根據(jù)本發(fā)明一些優(yōu)選的實施方式，在本發(fā)明的多重PCR檢測用試劑盒中，各成分以如下濃度包含于50μL的PCR最終反應(yīng)溶液中：

其中，所述ITS引物對的序列為：

上游引物ITS-600-F：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCG-3’；

下游引物ITS-600-R：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’，

所述aflR引物對的序列為：

上游引物aflR-421-F：5’-AGCAAAGCACCCTGTCTTC-3’；

下游引物aflR-421-R：5’-TTGAGAACGATAAGGACGACC-3’，

所述omt-1引物對的序列為：

上游引物omt-1-317-F：5’-TCATTTTCGAGGAGGTTGCC-3’；

下游引物omt-1-317-R：5’-AGCTGTTTCTCGCATTTCAGC-3’，

所述ver-1引物對的序列為：

上游引物ver-1-201-F：5’-TTCGGTCACCTGAAAGACG-3’；

下游引物ver-1-201-R：5’-TGACGCAAGCGGTGTTAG-3’。

根據(jù)本發(fā)明一些更為優(yōu)選的實施方式，在本發(fā)明的多重PCR檢測用試劑盒中，各成分以如下濃度包含于50μL的PCR最終反應(yīng)溶液中：

其中，所述ITS引物對的序列為：

上游引物ITS-600-F：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCG-3’；

下游引物ITS-600-R：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’，

所述aflR引物對的序列為：

上游引物aflR-421-F：5’-AGCAAAGCACCCTGTCTTC-3’；

下游引物aflR-421-R：5’-TTGAGAACGATAAGGACGACC-3’，

所述omt-1引物對的序列為：

上游引物omt-1-317-F：5’-TCATTTTCGAGGAGGTTGCC-3’；

下游引物omt-1-317-R：5’-AGCTGTTTCTCGCATTTCAGC-3’，

所述ver-1引物對的序列為：

上游引物ver-1-201-F：5’-TTCGGTCACCTGAAAGACG-3’；

下游引物ver-1-201-R：5’-TGACGCAAGCGGTGTTAG-3’。

根據(jù)本發(fā)明一些優(yōu)選的實施方式，本發(fā)明的多重PCR檢測用試劑盒中還含有陰性對照DNA和陽性對照DNA。

根據(jù)本發(fā)明一些進(jìn)一步優(yōu)選的實施方式，本發(fā)明的多重PCR檢測用試劑盒中的所述陰性對照DNA來自黑曲霉(Aspergillus niger)菌株CGMCC 3.0316，所述陽性對照DNA來自黃曲霉(Aspergillus flavus)菌株CGMCC 3.4410。

根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，在提取待檢測樣品的總DNA之前，可根據(jù)待檢測樣品的種類對待檢測樣品進(jìn)行粉碎等處理。為獲得多重PCR檢測的模板DNA，可利用可商購的DNA提取試劑盒獲取待檢測樣品中的總DNA；或者，也可通過水煮裂解法獲取待檢測樣品中的總DNA。

根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，在使用本發(fā)明的多重PCR檢測用試劑盒對產(chǎn)黃曲霉毒素真菌進(jìn)行檢測的方法中，進(jìn)行所述多重PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：以總體積為50μL計，加入濃度為10pg/μL～100ng/μL的模板DNA 1μL；反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2min；94℃變性20s、55℃退火30s、72℃延伸40s，共進(jìn)行35個循環(huán)；72℃延伸7min。

在本發(fā)明的實施方式中，可依照如下方式對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析：利用1.5％(w/v)的瓊脂糖凝膠電泳檢測多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)含有0.01％(v/v)的EB染色液染色后，觀測凝膠中DNA條帶大小。陽性對照中應(yīng)出現(xiàn)全部4個擴(kuò)增片段(ITS、aflR、omt-1和ver-1基因擴(kuò)增片段)；陰性對照中應(yīng)只出現(xiàn)ITS擴(kuò)增片段(約600bp)；空白模板對照中應(yīng)無任何 擴(kuò)增片段。當(dāng)檢測樣品中ITS、aflR、omt-1和ver-1基因擴(kuò)增片段沒有全部出現(xiàn)時，判定檢測結(jié)果為陰性，即無產(chǎn)黃曲霉毒素真菌侵染。當(dāng)檢測樣品同時出現(xiàn)全部4個擴(kuò)增片段時，判定檢測結(jié)果為可疑陽性，即可能存在產(chǎn)黃曲霉毒素真菌侵染。對于可疑陽性樣品，應(yīng)在產(chǎn)毒純化后按照《SN/T 1035-2011進(jìn)出口食品中產(chǎn)毒青霉屬、曲霉屬及其毒素的檢測方法》和《GB/T 4789.16-2003食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗常見產(chǎn)毒霉菌的鑒定》進(jìn)行黃曲霉毒素測定，以進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)，如確認(rèn)結(jié)果為陽性，判定結(jié)果為陽性，否則判定為陰性。

在本發(fā)明中，多重PCR反應(yīng)的檢測靈敏度依照如下方式進(jìn)行計算：在50μL的多重PCR反應(yīng)體系內(nèi)分別加入不同濃度的模板DNA 1μL，針對四個目標(biāo)基因，各自所能檢出的模板DNA的最低濃度即為該多重PCR反應(yīng)對于各目標(biāo)基因的檢測靈敏度，取針對四個目標(biāo)基因的檢測靈敏度的最大值(即，最差的靈敏度)作為該多重PCR反應(yīng)的檢測靈敏度。例如，當(dāng)在50μL的多重PCR反應(yīng)體系內(nèi)分別加入1pg/μL、10pg/μL、100pg/μL、1ng/μL及10ng/μL的陽性對照(黃曲霉菌株CGMCC 3.4410)模板DNA 1μL時，若能夠在加入1pg/μL、10pg/μL、100pg/μL、1ng/μL及10ng/μL的陽性對照模板DNA 1μL時檢測到ITS的目的條帶，則對ITS而言，所能檢出的模板DNA的最低濃度為1pg/μL，該多重PCR反應(yīng)對于ITS的檢測靈敏度為1pg/μL；對aflR、omt-1和ver-1基因的檢測靈敏度評判標(biāo)準(zhǔn)與此類似；相應(yīng)地，例如，在該多重PCR反應(yīng)對于aflR、omt-1和ver-1基因的檢測靈敏度分別為1pg/μL、1pg/μL和10pg/μL時，認(rèn)為該多重PCR反應(yīng)的檢測靈敏度為10pg/μL。

附圖說明

圖1示出了本發(fā)明同檢測標(biāo)準(zhǔn)SN/T 2582-2010關(guān)于產(chǎn)黃曲霉毒素真菌單重PCR檢測特異性的比較。

圖2示出了本發(fā)明同檢測標(biāo)準(zhǔn)SN/T 2582-2010關(guān)于產(chǎn)黃曲霉毒素真菌單重PCR檢測靈敏度的比較。

圖3示出了本發(fā)明同檢測標(biāo)準(zhǔn)SN/T 2582-2010關(guān)于產(chǎn)黃曲霉毒素真菌多重PCR檢測靈敏度的比較。

實施例

以下實施例和比較例的目的在于對本發(fā)明的產(chǎn)黃曲霉毒素真菌多重PCR檢測用引物組、試劑盒及檢測方法的原理及應(yīng)用作進(jìn)一步的說明，但并不以任何形式限制本發(fā)明的范圍。

實施例1：單重PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件的建立

1.引物設(shè)計及篩選

根據(jù)真菌中黃曲霉毒素合成途徑及相應(yīng)酶編碼基因信息，選擇真菌黃曲霉毒素生化合成過程中三個關(guān)鍵基因-產(chǎn)黃曲霉毒素調(diào)節(jié)基因aflR、柄曲霉素轉(zhuǎn)甲氧基酶基因omt-1及雜色曲霉素A脫氫酶基因ver-1作為研究對象。通過NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)的GenBank數(shù)據(jù)庫獲取相應(yīng)序列，將aflR、omt-1及ver-1序列同檢測標(biāo)準(zhǔn)SN/T 2582-2010中的PCR擴(kuò)增片段進(jìn)行序列相似性比對分析，選取擴(kuò)增片段中更為保守的序列區(qū)段，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計分析引物，優(yōu)化篩選出特異性高的3個引物對并與ITS PCR檢測用引物對進(jìn)行組合，序列如表1所示。

表1 ITS、aflR、omt-1及ver-1基因的PCR擴(kuò)增用引物對序列

2.單重PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件的建立

本研究進(jìn)行了分別針對ITS、aflR、omt-1及ver-1基因的單重PCR檢測反應(yīng)體系及反應(yīng)條件優(yōu)化，確定了最佳的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件。

最佳PCR反應(yīng)體系為(以50μL的PCR最終反應(yīng)溶液計)：

針對ITS基因的最佳PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2min；94℃變性20s、55℃退火30s、72℃延伸40s，共進(jìn)行35個循環(huán)；72℃延伸7min；

針對aflR、omt-1及ver-1基因的最佳PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2min；94℃變性20s、55℃退火30s、72℃延伸30s，共進(jìn)行35個循環(huán)；72℃延伸7min。

實施例2：單重PCR檢測中各引物對檢測特異性的驗證

對于實施例2和比較例1而言，在進(jìn)行檢測前對實驗所采用的各菌株進(jìn)行培養(yǎng)，抽提基因組DNA，用超微量分光光度計NanoDrop 2000檢測DNA濃度，分別以1μL濃度為10ng/μL的DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其它反應(yīng)體系及反應(yīng)條件如實施例1中所述。

采用所設(shè)計的PCR檢測用引物組中的4對特異性PCR引物對(如表1所示)，對11株標(biāo)準(zhǔn)菌株或已經(jīng)過鑒定的菌株(如表2所示)進(jìn)行PCR檢測。對于是否產(chǎn)AFT的檢測，按照《GB/T 4789.16-2003食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗常見產(chǎn)毒霉菌的鑒定》進(jìn)行。正交試驗結(jié)果如圖1B所示。圖1B中，Blank表示空白對照的單重PCR檢測；M表示100bp ladder Marker，各條帶大小依次為1500bp、1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp及100bp；泳道1、2、3、4中所加入的樣品分別為ITS、aflR、ver-1和omt-1基因的擴(kuò)增產(chǎn)物。對于經(jīng)產(chǎn)黃曲霉毒素能力鑒定表現(xiàn)為陽性的4株菌株(編號分別為Sample 5、Sample 6、Sample 8及Sample 10)，利用本發(fā)明的針對ITS、aflR、omt-1和ver-1基 因的引物對分別進(jìn)行單重PCR擴(kuò)增均能得到擴(kuò)增片段，可判定結(jié)果為可疑陽性；而經(jīng)鑒定為無黃曲霉毒素產(chǎn)毒能力的其它7株菌株(編號分別為Sample 1、Sample 2、Sample 3、Sample 4、Sample 7、Sample 9及Sample 11)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中均只出現(xiàn)ITS的目的擴(kuò)增片段(泳道1)，可判定結(jié)果為陰性。該結(jié)果表明，本發(fā)明設(shè)計出的各引物對在單重PCR檢測中對產(chǎn)黃曲霉毒素真菌具有較強(qiáng)的特異性。

比較例1：單重PCR檢測中各引物對檢測特異性的比較

為對使用本發(fā)明的引物對進(jìn)行的檢測方法的特異性與檢測標(biāo)準(zhǔn)SN/T 2582-2010的特異性進(jìn)行比較，利用檢測標(biāo)準(zhǔn)SN/T 2582-2010所提供的引物對，按照與實施例2相同的方法進(jìn)行單重PCR和瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果如圖1A所示。圖1A中，M表示與實施例2相同的100bp ladder Marker；泳道1、2、3、4中所加入的樣品分別為ITS、aflR、ver-1和omt-1基因的擴(kuò)增產(chǎn)物。對于經(jīng)產(chǎn)黃曲霉毒素能力鑒定表現(xiàn)為陽性的4株菌株(編號分別為Sample 5、Sample 6、Sample 8及Sample 10)，利用檢測標(biāo)準(zhǔn)SN/T 2582-2010所提供的針對ITS、aflR、omt-1和ver-1基因的引物對分別進(jìn)行單重PCR擴(kuò)增均能得到擴(kuò)增片段，可判定結(jié)果為可疑陽性；而經(jīng)鑒定為無黃曲霉毒素產(chǎn)毒能力的其它7株菌株(編號分別為Sample 1、Sample 2、Sample 3、Sample 4、Sample 7、Sample 9及Sample 11)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中均只出現(xiàn)ITS的目的擴(kuò)增片段(泳道1)，可判定結(jié)果為陰性。

可見，本發(fā)明的針對ITS、aflR、omt-1和ver-1基因的各產(chǎn)黃曲霉毒素真菌單重PCR檢測用引物對及相應(yīng)的檢測方法與檢測標(biāo)準(zhǔn)SN/T 2582-2010具有相同的檢測特異性，具備特異性檢測產(chǎn)黃曲霉毒素真菌的能力。

表2 所使用的菌株列表

實施例3：單重PCR檢測中各引物對檢測靈敏度的驗證

對于實施例3和比較例2而言，在進(jìn)行檢測前培養(yǎng)黃曲霉菌株CGMCC 3.4410，抽提基因組DNA，用超微量分光光度計NanoDrop 2000檢測DNA濃度，進(jìn)行10倍梯度稀釋，利用表1中所示的各引物對，分別以1μL不同濃度的DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其它反應(yīng)體系及反應(yīng)條件如實施例1中所述。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，結(jié)果如圖2B所示。

圖2A和圖2B中，M表示100bp ladder Marker，各條帶大小依次為1500bp、1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp及100bp；ITS、aflR、omt-1及ver-1表示分別以ITS、aflR、omt-1及ver-1為目標(biāo)檢測基因的單重PCR檢測，Blank表示空白對照的單重PCR檢測。從左至右，各泳道所標(biāo)注的1pg、10pg、0.1ng、1ng及10ng分別表示在50μL的PCR反應(yīng)體系中，所加入的1μL模板DNA的濃度分別為1pg/μL、10pg/μL、0.1ng/μL、1ng/μL及10ng/μL。

從圖2B可以看出，采用本發(fā)明提供的產(chǎn)黃曲霉毒素真菌單重PCR檢測用引物對及檢測方法，對ITS、aflR、omt-1及ver-1基因的PCR檢 測反應(yīng)靈敏度分別達(dá)到0.1ng/μL、0.1ng/μL、10pg/μL及10pg/μL。

比較例2：單重PCR檢測中各引物對檢測靈敏度的比較

為對使用本發(fā)明的引物對的檢測方法的靈敏度與檢測標(biāo)準(zhǔn)SN/T 2582-2010的靈敏度進(jìn)行比較，利用檢測標(biāo)準(zhǔn)SN/T 2582-2010所提供的引物對，按照與實施例3相同的方法進(jìn)行單重PCR和瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果如圖2A所示。

從圖2A可以看出，采用檢測標(biāo)準(zhǔn)SN/T 2582-2010提供的產(chǎn)黃曲霉毒素真菌PCR檢測用引物對及檢測方法，對ITS、aflR、omt-1及ver-1基因的單重PCR檢測反應(yīng)靈敏度分別達(dá)到0.1ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL及0.1ng/μL；而采用本發(fā)明提供的產(chǎn)黃曲霉毒素真菌單重PCR檢測用引物對及檢測方法，對ITS、aflR、omt-1及ver-1基因的單重PCR檢測反應(yīng)靈敏度分別達(dá)到0.1ng/μL、0.1ng/μL、10pg/μL及10pg/μL，也就是說，就aflR、omt-1及ver-1基因的單重PCR檢測反應(yīng)靈敏度而言，本發(fā)明提供的檢測引物對及檢測方法均優(yōu)于檢測標(biāo)準(zhǔn)SN/T 2582-2010提供的檢測引物對及檢測方法。這表明本發(fā)明提供的PCR檢測用引物對及檢測方法能夠獲得較高的檢測靈敏度，具備更好地滿足產(chǎn)黃曲霉毒素真菌PCR檢測需求的優(yōu)勢。

實施例4：多重PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件的建立

基于單重PCR檢測的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件，本發(fā)明對多重PCR檢測中的各參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，確定了最佳的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件。

最佳多重PCR反應(yīng)體系為(以50μL的PCR最終反應(yīng)溶液計)：

上述多重PCR反應(yīng)的反應(yīng)條件為：

94℃預(yù)變性2min；94℃變性20s、55℃退火30s、72℃延伸40s，共進(jìn)行35個循環(huán)；72℃延伸7min。

實施例5：多重PCR檢測用引物組的檢測特異性的驗證

在進(jìn)行檢測前對實驗所采用的各菌株進(jìn)行培養(yǎng)，抽提基因組DNA，用超微量分光光度計NanoDrop 2000檢測DNA濃度，分別以1μL濃度為10ng/μL的DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。利用實施例4中建立的多重PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件，通過正交反應(yīng)多次試驗，對11株實驗菌株(如表2所示)進(jìn)行多重PCR檢測，結(jié)果表明：

對于經(jīng)產(chǎn)黃曲霉毒素能力鑒定表現(xiàn)為陽性的4株菌株(編號分別為Sample 5、Sample 6、Sample 8及Sample 10)，利用本發(fā)明的針對ITS、aflR、omt-1和ver-1基因的引物對進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增可得到全部4個擴(kuò)增片段(ITS、aflR、omt-1和ver-1基因擴(kuò)增片段)，而經(jīng)鑒定為無黃曲霉毒素產(chǎn)毒能力的其它7株菌株(編號分別為Sample 1、Sample 2、Sample 3、Sample 4、Sample 7、Sample 9及Sample 11)的多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中均只出現(xiàn)ITS的目的擴(kuò)增片段。該結(jié)果同檢測標(biāo)準(zhǔn)SN/T 2582-2010提供的產(chǎn)黃曲霉毒素真菌PCR檢測方法的檢測結(jié)果完全一致，表明本發(fā)明設(shè)計出的由表1中列出的4個引物對構(gòu)成的多重PCR檢測用引物組對產(chǎn)黃曲霉毒素真菌具有較強(qiáng)的特異性。

實施例6：多重PCR檢測用引物組的檢測靈敏度的驗證

對于實施例6和比較例3而言，在進(jìn)行檢測前培養(yǎng)黃曲霉菌株CGMCC 3.4410，抽提基因組DNA，用超微量分光光度計NanoDrop 2000檢測DNA濃度，進(jìn)行10倍梯度稀釋，利用表1中所示的各引物對，分別以1μL不同濃度的DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其它反應(yīng)體系及反應(yīng)條件如實施例4中所述。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，結(jié)果如圖3所示。

圖3中，M表示100bp ladder Marker，各條帶大小依次為1500bp、 1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp及100bp；Blank表示空白對照的多重PCR檢測。Test表示依據(jù)本發(fā)明提供的多重PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件的檢測結(jié)果，SN/T 2582-2010表示依據(jù)檢測標(biāo)準(zhǔn)《SN/T 2582-2010產(chǎn)黃曲霉毒素真菌PCR檢測方法》構(gòu)建的多重PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件的檢測結(jié)果。從左至右，各泳道所標(biāo)注的1pg、10pg、0.1ng、1ng及10ng分別表示在50μL的PCR反應(yīng)體系中，所加入的1μL模板DNA的濃度分別為1pg/μL、10pg/μL、0.1ng/μL、1ng/μL及10ng/μL。

從圖3可以看出，采用本發(fā)明提供的產(chǎn)黃曲霉毒素真菌多重PCR檢測用引物組及檢測方法，對產(chǎn)黃曲霉毒素真菌中的ITS、aflR、omt-1及ver-1基因進(jìn)行的多重PCR檢測反應(yīng)靈敏度達(dá)到0.1ng/μL。

比較例3：多重PCR檢測用引物組的檢測靈敏度的比較

將使用本發(fā)明多重PCR檢測用引物組的檢測方法的特異性與依據(jù)檢測標(biāo)準(zhǔn)《SN/T 2582-2010產(chǎn)黃曲霉毒素真菌PCR檢測方法》構(gòu)建的多重PCR檢測方法的靈敏度進(jìn)行比較，結(jié)果如圖3所示。

采用依據(jù)檢測標(biāo)準(zhǔn)《SN/T 2582-2010產(chǎn)黃曲霉毒素真菌PCR檢測方法》構(gòu)建的多重PCR檢測方法對產(chǎn)黃曲霉毒素真菌ITS、aflR、omt-1及ver-1基因的多重PCR檢測反應(yīng)的靈敏度達(dá)到1ng/μL；而采用本發(fā)明提供的產(chǎn)黃曲霉毒素真菌多重PCR檢測用引物組及檢測方法，對產(chǎn)黃曲霉毒素真菌ITS、aflR、omt-1及ver-1基因的多重PCR檢測反應(yīng)的靈敏度可進(jìn)一步提升至0.1ng/μL。這表明本發(fā)明提供的多重PCR檢測用引物組及檢測方法能夠獲得較高的檢測靈敏度，具備更好地滿足產(chǎn)黃曲霉毒素真菌多重PCR檢測需求的優(yōu)勢。

實施例7：應(yīng)用于實際樣品的檢測試驗

利用實施例4中建立的多重PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件，采用本發(fā)明提供的產(chǎn)黃曲霉毒素真菌多重PCR檢測用引物組及檢測方法，對應(yīng)用表2所列菌株構(gòu)建的人工侵染的玉米(11份)、花生(11份)及飼料(11份)樣品中的產(chǎn)黃曲霉毒素真菌進(jìn)行實際檢測。

在33份檢測樣品中，本方法檢測出12份樣品被產(chǎn)黃曲霉毒素真菌 侵染，這與預(yù)期結(jié)果完全一致，說明本發(fā)明所提供的針對產(chǎn)黃曲霉毒素真菌的PCR檢測用引物組及檢測方法在應(yīng)用于實際樣品的檢測試驗中的準(zhǔn)確度高達(dá)100％。

以上結(jié)果表明，本發(fā)明所提供的針對產(chǎn)黃曲霉毒素真菌的多重PCR檢測用引物組及檢測方法具有出色的準(zhǔn)確性和實用性，并且檢測耗時短，具有廣泛的市場推廣應(yīng)用前景。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施例對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明描述的基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是容易實現(xiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。