專利名稱：殺真菌組合物及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及新的殺真菌活性化合物，制備該化合物的方法，能產生所述化合物的微生物，含有所述化合物的組合物，和所述組合物在控制有價值的作物，動物，包括鳥類和哺乳動物中的真菌，及在木材和原木、涂料、化妝品、食物和飼料的防腐方面的應用。
多年來，已知各種不同的微生物可產生具有生物活性的代謝物，其可作為殺生物劑用于對抗疾病和害蟲。
尤其已知彎孢屬的某些菌種可產生不同的具有生物活性的代謝物，如植物毒素。然而，已知這些代謝物中沒有一種是殺真菌劑。發(fā)現(xiàn)彎孢(C.lunata(Wakk)Boed)可產生至少兩種植物毒素。它們甚至在經高度稀釋后仍能在植物葉子上造成枯斑。(F.Macri and A Vianello，physiological Plant Pathology8325-331，1976)。該毒素系植物毒素并且是非宿主特異性的。已從蒼白彎孢(C.pallescensBoedijn)的培養(yǎng)濾液中和從受該菌種侵襲的染病宿主的葉子上分離出宿主特異性毒素(Olufolaji，Cryp-togamie Mycol 7(4)335-342，1986)。這些毒性物質使玉米植株出現(xiàn)黃化斑。此后它們變得枯萎，類似于由蒼白彎孢所引起的病害的體內癥狀。
彎孢霉素，一種大環(huán)代謝物，已被從彎孢菌種中(O.C.Musgrave，J.Chem.Soc.，1956，4301)和從彎孢中(Coombe et al.Aust.J.Chem.21783，1968)分離出來。該化合物的分子式為C16H20O5(分子量292.3)，如下式1所示 分離出的粗彎孢霉素為無色或淡黃褐色結晶。
彎孢霉素和彎孢屬的粗濾液都沒有抗細菌活性(抗枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、和金黃色葡萄球菌)或抗真菌活性(用指狀青霉進行的孢子萌發(fā)試驗)。
以上化合物中沒有一種能用于對抗植物病蟲害，因為它們是強植物毒素。
雖然在鑒定和開發(fā)用于對抗各種發(fā)生在具有農藝學重要性的植物和動物中的病蟲害的生物學殺蟲劑領域中已取得進步，但目前應用的多數(shù)殺蟲劑仍為合成化合物，它們在自然界難以分解并具有廣譜活性。
近十年來，人們對這類殺蟲劑對環(huán)境和農田周圍的生態(tài)系統(tǒng)的影響仍日益關注，因而，急需具有更強的特異性活性并且在自然環(huán)境中易于降解的殺蟲劑。
在1990年3月28日公開的歐洲專利申請No.EP360760(Sandoz AG)中已揭示了許多與本發(fā)明所述化合物相關的化合物。據公開這些化合物由殼針孢屬真菌制得，其在動物體內具有重要的藥理學特性，例如抗真菌活性，抵抗可造成全身病害的酵母和酵母樣菌種。該公開只提及一個抵抗假絲酵母屬的試驗，未提及對82種列舉的化合物中的哪些化合物試驗了這一活性，但指出了最優(yōu)選的化合物可由下式表示cyclo-[Pec-MeVal-Val-MeAsp-MeIle-MeIle-Gly-MeVal-TyrOMe-D-Lact](實施例1，第一種化合物)如上所述彎孢霉菌屬的已知代謝物都具有強植物毒性活性，但現(xiàn)已令人驚奇地發(fā)現(xiàn)屬于所述屬的真菌也能產生具有強的抗真菌活性，并且基本上無植物毒性活性的代謝物。
第一方面，本發(fā)明涉及一組新的化合物，包括總組成為I的化合物，及其衍生物，乳酸(1)，甘氨酸(1)，纈氨酸(4)，異亮氨酸(1)，六氫吡啶羧酸(1)，天冬氨酸(1)，酪氨酸(1) (I)其中每個氨基酸殘基可分別以L-型或D-型存在，圓括號中的數(shù)字表示各基團的存在數(shù)。
在這一方面，本發(fā)明還涉及組成為C56H89N9O14的化合物及其衍生物。
具體地講，本發(fā)明涉及總組成為II的化合物及其衍生物，乳酸(1)，甘氨酸(1)，纈氨酸(1)，N-Me-纈氨酸(3)，N-Me-異亮氨酸(1)，六氫吡啶羧酸(1)，N-Me-天冬氨酸(1)，O-Me-酪氨酸(1) (II)其中每個氨基酸殘基可分別以L-型或D-型存在，圓括號中的數(shù)字表示各基團的存在數(shù)。
本發(fā)明還涉及式III和式IV的化合物及其衍生物， (III)cyclo-[Pec-MeAsp-MeVal-Val-MeVal-MeIle-Gly-MeVal-TyrOMe-D-Lact] (III) (IV)cyclo-[Pec-MeVal-Val- MeAsp-MeVal- MeIle-Gly- MeVal-TyrOMe-D-Lact] (IV)，其中每個氨基酸殘基和乳糖殘基可分別以L-型或D-型存在。最優(yōu)選的是所有氨基酸殘基均以L-型存在且乳糖殘基以D-型存在的化合物。
第二方面，本發(fā)明涉及用于生產本發(fā)明的新化合物的方法。這些方法包括特定微生物的使用以及全合成或半合成生產所述化合物的化學方法。
第三方面，本發(fā)明涉及包括本發(fā)明的新化合物與合適的賦形劑，如稀釋劑、載體等結合的殺真菌組合物。
本發(fā)明還涉及能產生本發(fā)明的化合物的微生物作為殺真菌組合物的應用。
將本發(fā)明的新化合物與已知的殺生物劑組合制成新的組合物也包括在本發(fā)明的范圍內。
此外，第四方面，本發(fā)明涉及通過將含有本發(fā)明化合物的組合物施用于受侵染的部位而對抗植物病害的方法。
第五方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的新化合物在抵抗或控制植物病害，特別是真菌侵襲方面的應用。
本發(fā)明還涉及新化合物作為防腐劑和/或添加劑以控制食物和飼料、原木和木材、涂料、生長培養(yǎng)基、化妝品等中的真菌的應用。
最后，本發(fā)明涉及一種分離出的彎孢菌種(CMICCNo.337159)的純培養(yǎng)物。
為了詳細描述本發(fā)明，彎孢種真菌菌株(CMICCNo.337159)已保藏于CommonwealthMycological Institute CultureCollection(CMICC)(Ferry Lane，Kew，Surrey TW93AF，England)，保藏日如下。CMICC是布達佩斯條約的國際保藏單位，可按所述條約第9條的規(guī)定進行永久保藏。
保藏日 1990年2月6日保藏者參考號 33177CMICC保藏號CMICC No.337159CMICC337159屬于半知菌綱(Deuteromycetes)，絲孢亞綱(Hyphomycetidae)，暗色孢科。該真菌是彎孢屬的一個新種。
下面參照附圖進一步詳細描述本發(fā)明。


圖1是本發(fā)明的新化合物的穩(wěn)定性/活性與溫度和PH的關系示意圖。
圖2，3和4示出了所分離的本發(fā)明化合物分別在CDCl3，DMSO-d6和CD3OD中的400MHz1H-NMR譜。
圖5示出了所分離的本發(fā)明化合物在CDCl3中的100.6MHz13C-NMR譜。
圖6示出了所分離的本發(fā)明化合物在KBr中的紅外(IR)光譜。
圖7示出了甲基化衍生物在KBr中的IR光譜。
圖8，9和10示出了將本發(fā)明化合物分別施用于被灰葡萄孢感染的草莓、葡萄和番茄的結果。
如上所示，第一方面，本發(fā)明涉及總組成為I的新化合物及其衍生物，乳酸(1)，甘氨酸(1)，纈氨酸(4)，異亮氨酸(1)，六氫吡啶羧酸(1)，天冬氨酸(1)，酪氨酸(1) (I)其中每個氨基酸殘基可分別以L-型或D-型存在，圓括號中的數(shù)字表示各基團的存在數(shù)。
在這一方面，本發(fā)明進一步包括還包含一內酯環(huán)的化合物及其衍生物。
而且，本發(fā)明包括組成為C56H89N9O14的化合物及其衍生物。
在這一方面，以上特別提到的衍生物包括已被烷基化，?；?、羥基化、糖基化、鹵化、還原、氧化、水解或酯化的化合物。
具體地講，本發(fā)明涉及總組成為II的化合物及其衍生物，乳酸(1)，甘氨酸(1)，纈氨酸(1)，N-Me-纈氨酸(3)，N-Me-異亮氨酸(1)，六氫吡啶羧酸(1)，N-Me-天冬氨酸(1)，O-Me-酪氨酸(1) (II)其中每個氨基酸殘基可分別以L-型或D-型存在，圓括號中的數(shù)字表示各基團的存在數(shù)。
作為一個具體實例，本發(fā)明涉及式III和式IV的化合物及其衍生物， (III)cyclo-[Pec-MeAsp-MeVal-Val-MeVal-MeIle-Gly-MeVal-TyrOMe-D-Lact] (III) (IV)cyclo-[Pec-MeVal-Val-MeAsp-MeVal-MeIle-Gly-MeVal-TyrOMe-D-Lact](IV)，其中每個氨基酸殘基和乳酸殘基可分別以L-型或D-型存在。最優(yōu)選的是其中所有氨基酸殘基均以L-型存在且乳酸殘基以D-型存在的化合物。
式III和式IV的化合物作為代謝物從彎孢屬的一個新種，彎孢菌種(CMICC No.337159)中分離出來。
這類有機結構如式III和式IV所示的化合物是新的。最相關的對比文獻是上面討論的EP360760。EP360760的化合物與本發(fā)明化合物的主要區(qū)別在于它們總是包含兩個相鄰的異亮氨酸殘基。
雖然與本發(fā)明的化合物密切相關的化合物公開于EP360760中，但不會考慮將其用于農藝學。這是由于它們的高毒性(約100mg/kg p.o.)和低的抗真菌活性(劑量為25-300mg/kg，每日劑量為300-3000mg)，如在EP360760第47-49頁所舉例說明的對假絲酵母的活性。
此外，EP360760只指出了相關化合物在藥物上的應用。因而根本不能從EP360760推知本發(fā)明的化合物在農藝學應用方面的令人驚奇的特異性和活性。
第二方面，本發(fā)明涉及組成I的新化合物的生產方法。
式III或式IV的化合物可在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基上，在下述條件下對屬于彎孢屬的真菌菌株，特別是彎孢菌種(CMICC337159)的真菌菌株進行需氧培養(yǎng)，然后從生物量和發(fā)酵培養(yǎng)基中回收活性組分而制得的。
此后，天然代謝物可用化學方法修飾以獲得其各種不同的衍生物。為了改善代謝物的某些特性，例如其在含水培養(yǎng)基中的溶解性、其疏水性、親水性、穩(wěn)定性、特異性等，可生產不同的衍生物。
可用易得到的起始物，通過眾所周知的化學合成方法制備本發(fā)明的化合物。
相關化合物的衍生物及生產這類衍生物的方法在EP360760中已公開，在此作為參考。
特定類型的式III和式IV化合物的衍生物是其中內酯環(huán)已打開的化合物。
一組衍生物是組成I，II，III或IV的化合物，其中一個或幾個羥基和/或氨基已被一個或多個糖基糖基化。
另一組包括組成I，II，III或IV的化合物，其中一個或幾個羥基和/或氨基已被有機酸酰化為酯/酰胺基。
再一組衍生物是組成I，II，III或IV的化合物，其中一個或幾個羥基和/或氨基已被烷基化為烷基醚/胺。
再一組衍生物是組成I，II，III或IV的化合物，其中一個或幾個基團已被鹵素所取代，成為其中一個或多個基團為鹵素的化合物。
再一組衍生物是組成I，II，III或IV的化合物，其中一個或幾個基團已通過一個或多個基團的還原而在所得化合物中被改變。
再一組衍生物是組成I，II，III或IV的化合物，其中一個或幾個基團已通過一個或多個基團的氧化而在所得化合物中被改變。
再一組衍生物是組成I，II，III或IV的化合物，其中一個或幾個基團已通過一個或多個基團的水解而在所得化合物中被改變。
雖然下面討論的本發(fā)明主要涉及特定的菌種CMICC337159，但本領域的技術人員都知道微生物的特性可被自然地和人為地改變。因此所有屬于彎孢屬的菌株，包括變異體、重組體和突變體，無論是經自然選擇而得到，還是通過突變劑的作用如電離輻射或紫外線照射或是通過化學誘變劑如亞硝基胍的作用而產生，都包括在本發(fā)明中。
眾所周知，真菌能產生具有相同或相似活性，但化學結構上略有差別的密切相關的代謝物(參見EP360760，其中三種相關的化合物是由CMICC337159產生的)。因此本發(fā)明也意欲包括這類由CMICC337159產生的密切相關的化合物。
依據諸如欲對抗其中的真菌的作物，環(huán)境條件或其它因素等情況，本發(fā)明的組合物除含有所述的本發(fā)明的殺真菌活性化合物之外還可含有其他活性成分，例如其他殺生物劑，如殺真菌劑、殺蟲劑、除莠劑、殺昆蟲劑、殺線蟲劑、殺螨劑，或植物營養(yǎng)素，植物生長調節(jié)劑或肥料。
可與本發(fā)明的活性化合物組合的其他殺真菌劑的實例特別包括麥角甾醇生物合成抑制劑(“EBIs”)。這些EBIs一般為咪唑或三唑衍生物，其實例包括通用名稱如下的化合物prochloraz，triadimefon，propiconazole，diclobutrazol，triadiminol，flusilazole，flutriafol，myclobutanil，penconazole，quinconazole，imazalil和diniconazole。非吡咯EBIs的實例包括nuarimol，fenarimol，fenpropimorph，tridemorph)和fenpropidine?？膳c本發(fā)明的酶制劑組合的其它殺真菌劑包括酰替苯胺，例如萎銹靈，metalaxyl，furalaxyl，ofurace，benalaxyl，mepronil，flutolanil，pency-curon和oxadixyl；苯并咪唑，例如苯菌靈和多菌靈；氨基甲酸酯，例如，代森錳，代森錳鋅和propamo-carb；二甲酰亞胺，例如iprodione，vin-clozolin和procymidone；亞磷衍生物，例如定菌靈，tolclofos-methyl和fosetylaluminum；和混雜化合物，包括二硫代氨基甲酸酯，雙二硫代氨基甲酸酯，咪唑，三唑，鄰苯二甲腈，多鹵烷基硫代化合物，iminoctadine，雙胍鹽，氯硝胺，百菌清，pyrifexox，乙菌定，cymoxanil，苯基吡咯，thiocyofenes，嘧啶類內吸殺菌劑，和敵菌靈。
為了對抗動物包括人體內的真菌，本發(fā)明的組合物通常應包括所述的本發(fā)明的活性化合物以及生理上相容的載體或稀釋劑，但它也可與其他活性成分如抗菌素組合。
以本發(fā)明的殺真菌活性化合物作為其活性成分的本發(fā)明殺真菌組合物，可通過下述方法配制以用于農藝和/或園藝領域將活性成分與合適的惰性相容載體或稀釋劑混合，得到在農藥組合物中通常使用類型的組合物，例如可潤濕的粉末，可乳化濃縮物，濃縮的乳液，顆粒制劑，水溶性粉末，藻酸鹽，黃原膠和/或氣溶膠。作為固體載體，可提到的有膨潤土，硅藻土，磷灰石，石膏，滑石，葉蠟石，蛭石，地殼和粘土。為了制備均勻而穩(wěn)定的制劑還可加入表面活性劑。
本發(fā)明組合物中的稀釋劑或載體可以是固體或液體，根據需要，可與表面活性劑，例如分散劑、乳化劑或潤濕劑結合。合適的表面活性劑包括陰離子化合物，如羧酸鹽，例如長鏈脂肪酸的金屬羧酸鹽；N-?；“彼猁}；磷酸與脂肪醇乙氧基化物形成的單酯或二酯或這種酯的鹽；脂肪醇硫酸鹽如十二烷基硫酸鈉，十八烷基硫酸鈉或十六烷基硫酸鈉；乙氧基化脂肪醇硫酸鹽；乙氧基化烷基酚硫酸鹽；木素磺酸鹽；石油磺酸鹽；烷基芳基磺酸鹽如烷基-苯磺酸鹽或低級烷基萘磺酸鹽；例如丁基-萘磺酸鹽；磺化萘-甲醛縮合物的鹽；磺化苯酚-甲醛縮合物的鹽；或多配磺酸鹽如酰胺磺酸鹽，例如油酸和N-甲基牛磺酸的磺化縮合產物或二烷基磺基琥珀酸鹽，例如二辛基琥珀酸的磺酸鈉。非離子劑包括脂肪酸酯、脂肪醇、脂肪酰胺或脂肪烷基取代的苯酚或脂肪烯基取代的苯酚與環(huán)氧乙烷的縮合產物，多元醇酯，例如脫水山梨醇脂肪酸酯，這樣的酯與環(huán)氧乙烷的縮合產物，例如聚氧乙烯脫水山梨醇脂肪酸酯，環(huán)氧乙烷和環(huán)氧丙烷的嵌段共聚物，炔屬二醇如2，4，7，9-四乙基-5-癸炔-4，7-二醇，或乙氧基化炔屬二醇。
陽離子表面活性劑的實例包括，例如，脂族單胺、二胺或多胺的乙酸鹽，環(huán)烷酸鹽或油酸鹽；含氧胺如氧化胺或聚氧乙烯烷基胺；通過羧酸與二胺或多胺的縮合所制得的酰胺連接的胺；或季銨鹽。
本發(fā)明的組合物可采取本領域已知的適于農藥配制的任何形式，例如溶液、分散液、含水乳液，撒粉，拌種劑、可分散粉末，可乳化濃縮物或顆粒。而且，它可為適于直接應用的形式或為濃縮物或初級組合物，應用前需用適量的水或其他稀釋劑稀釋。
可乳化的濃縮物包括溶于可與水混溶的溶劑的活性成分，在乳化劑存在下用水將其制成乳液。
撒粉包括與固體粉末稀釋劑，例如，高嶺土充分混合和被磨細的活性成分。
顆粒狀固體包括與稀釋劑混合的活性成分，所用稀釋劑與在撒粉中所用者相似，但該混合物用已知方法制粒。另外，它包括吸附于成粒狀稀釋劑例如漂白土，硅鎂土或石灰渣上的活性成分。
可潤濕粉末，顆粒通常包括與合適的活性劑和惰性粉末稀釋劑如陶土混合的活性成分。
另一種合適的濃縮物是可流動懸浮濃縮物，它是通過將活性成分與水或其它液體、潤濕劑和懸浮劑一起研磨后形成的。
為了控制植物中的真菌，預計本發(fā)明的活性化合物可按約0.001μg/ml-750mg/ml、優(yōu)選1μg/ml-10mg/ml的濃度施用。
為了抵抗動物(包括哺乳動物)中的真菌，可通過將本發(fā)明的化合物與現(xiàn)有技術中已知的用于常規(guī)配方中的或用作可應用的內吸殺蟲劑的合適的惰性和相容性載體混合而配制出本發(fā)明的活性化合物。
根據配方的類型以及應用的領域，這里所述的本發(fā)明組合物中本發(fā)明活性化合物的濃度可在很寬的范圍內變化。
為了控制動物中的真菌，預計本發(fā)明的活性化合物可按約0.001μg/ml-10mg/ml、優(yōu)選0.1μg/ml-1mg/ml的濃度施用。
本發(fā)明所涉及的第四個方面是抵抗植物或動物(包括哺乳動物)中真菌的方法，其中殺真菌有效量的本發(fā)明活性化合物被施用于欲處理的區(qū)域。
對于這一方面，可將用于農藝或園藝的本發(fā)明組合物施用于欲處理的區(qū)域，它既可以作為苗前處理而直接施用于土壤，以對種子表面進行敷裹，也可以作為苗后處理而施用于植物的葉片或果實。根據作物和環(huán)境的不同，該處理可一直延續(xù)至需要控制其中真菌的植物出現(xiàn)種子或果實為止。
可在植物上出現(xiàn)真菌時或作為一種保護性措施在植物上出現(xiàn)真菌前，通過噴霧或撒粉而將本發(fā)明的活性制劑或組合物直接施用于植物。在這兩種情況下，優(yōu)選的施用方式是葉面噴霧。一般來說，在植物生長的早期獲得良好的真菌控制效果非常重要，因為這是植物可能遭受最嚴重損害的時期。如果認為需要的話，噴霧劑或粉劑通?？珊忻缜盎蛎绾蟪輨⑵渌鼩⑾x劑的混合物、植物生長調節(jié)劑或肥料。
有時，可在種植之前或種植過程中通過將根浸入合適的液體或固體組合物中而處理植物的根。當將本發(fā)明的活性制劑直接施用于植物時，適宜的施用率為0.001-50kg/公頃，優(yōu)選0.05-5kg/公頃。
在本發(fā)明的方法中，單獨或與常規(guī)殺生物劑結合的本發(fā)明活性制劑也可被施用于種子或植物的產地。因此，可在鉆孔之前、同時或之后將該制劑直接施用于土壤，以便土壤中存在的活性成分能夠控制可能侵襲種子的真菌的生長。
可按相應于約1g-100kg殺真菌活性化合物/公頃的量施用組合物。
當直接處理土壤時，可將活性制劑(單獨或與常規(guī)殺生物劑混合)按使其與土壤均勻混合的任何方式施用，例如噴霧、播撒固體狀顆?；驅⒒钚猿煞衷阢@孔時與種子插入同一孔中而進行施用。合適的施用率為0.01-5kg/公頃，更優(yōu)選的是0.05-5kg/公頃。
單獨或與常規(guī)殺真菌劑結合后施用于植物時，本發(fā)明組合物中殺真菌活性化合物的濃度在0.001-30％(重量)的范圍內較好，在0.01-3.0％(重量)范圍內更好。初級組合物中活性化合物的量可在很寬的范圍內變化，例如，可為組合物重量的約5-95％。
當與本發(fā)明的組合物混合應用于植物時，其它殺真菌活性成分的濃度在0.001-50％(重量)范圍內較好，在0.01-10％(重量)范圍內更好。在初級組合物中，其它活性成分的量可在很寬的范圍內變化，例如可為組合物重量的5-80％。
盡管針對控制植物和動物真菌對本發(fā)明進行了詳細敘述，但仍然可以預想到，通過將本發(fā)明的殺真菌活性化合物加到木材防腐和/或浸漬組合物中而可將其用于木材防腐。另外，也可將本發(fā)明的活性化合物用作涂料中的殺真菌劑和防腐劑--既可防止真菌在涂料保存期間的生長也可防止真菌在所涂物體如涂過的墻壁上生長。
由于其低毒性，本發(fā)明的殺真菌活性化合物還可用于化妝品、食品和飼料以及化合物可在任何熱煉加工后加入的其它物品的防腐。
另外，也可將本發(fā)明的殺真菌活性化合物作為殺真菌添加劑應用到各種微生物(如大腸桿菌、銅綠假單孢菌、Serpulalacrymans和枝孢菌種)的生長培養(yǎng)基中。
對菌株的描述菌落灰色，棉花狀，有時成帶。
分生孢子梗單個至聚集，簡單，從直至彎曲，膝狀彎曲向上。
分生孢子頂側生，成熟時有2-4個隔膜，光滑，但在大的中心細胞上多疣，大部分彎曲，單色或中心細胞比其它細胞具有更多色素沉著，大部分長20-39μm，且最寬部分厚11-14μm。
象C.verruciformis一樣，CMICC337159為4分隔，但與其不同的是分生孢子的大小。C.verruciformis分生孢子的大小為16-26μm×8-12μm。CMICC337159為彎孢屬中的新種。它屬于半知菌綱，絲孢亞綱，暗色孢科。
菌株的培養(yǎng)可在含有以下成分(克/升)的瓊脂斜面上培養(yǎng)真菌醇母浸膏 4.0磷酸二氫鉀 1.0七水合硫酸鎂 0.1葡萄糖 15Bacto(DifcoLaboratories，Detroit，USA)瓊脂20將這一基質于121℃高壓滅菌20-40分鐘，該培養(yǎng)基以下稱作YPG瓊脂。斜面含有12ml YPG瓊脂，將其接種后于20-25℃培養(yǎng)7天或更長時間。
殺真菌劑的生產利用軟化水和以下成分(g/l)可配制用于搖瓶培養(yǎng)的基質酵母浸膏 4.0磷酸二氫鉀 1.0七水合硫酸鎂 0.1
葡萄糖 15Pluronic L61(BASF，F(xiàn)ederalRepublic ofGermany)0.1于121℃滅菌20分鐘。將來源于前面所述接種了CMICC337159的YPG瓊脂斜面的106孢子接種裝有100ml基質的500ml錐瓶。該錐瓶于25℃以230rpm振蕩3-7天，然后離心發(fā)酵肉湯。從菌絲體中分離出含有殺真菌劑的上清液。分析菌絲體和上清液二者的殺真菌活性。
也可按照熟知的方法在表面培養(yǎng)物中生產殺真菌劑。
也可在含有其它可被微生物同化的碳源和氮源以及通常低水平的無機鹽的培養(yǎng)基中進行發(fā)酵。另外，盡管當使用復合碳源和氮源時它們通常以復合物形式存在，培養(yǎng)基中仍可補充微量金屬。
化合物的提取用High Flow Supercel對培養(yǎng)液進行圓筒過濾以作為預涂布。向濾液中加入20g/l XAD-8，并將混合物于5℃攪拌16小時。
然后過濾掉樹脂XAD-8，用10個柱床體積的25％v/v乙醇漂洗并攪拌30分鐘。首先用2×3體積的60％乙醇(于10mM磷酸鹽中，pH7.0)洗脫活性，并攪拌60分鐘。其余活性用2×3體積80％v/v乙醇(于10mM磷酸鹽中，pH7.0)洗脫并攪拌60分鐘。合并洗脫液，并于低于40℃的溫度下通過真空蒸發(fā)濃縮至1/5體積。
將3.6升濃縮過的洗脫液進一步濃縮至750ml。然后離心濃縮物，并棄去沉淀。上清液用765ml乙酸乙酯萃取兩次。然后冷凍合并后的乙酸乙酯相以除去水。
通過真空蒸發(fā)濃縮無水提取物至20ml，然后加至120ml乙腈。通過真空蒸發(fā)進一步濃縮至25ml后，加至70ml去離子水和70ml乙醇中，并真空蒸發(fā)至輕微混濁。然后將該溶液置于冰箱中結晶。4天后，用去離子水洗滌晶體并凍干。
從而得到1克晶體。
為簡便起見，式IV化合物以下命名為BK202。
溫度和pH穩(wěn)定性步驟在圖1所示pH下，將化合物BK202溶于緩沖液，然后于25-55℃放置16小時。在pH2.5-7時所用的緩沖液為磷酸鹽-檸檬酸鹽(T.C.McIlvaine，J.Biol.Chem.49，183(1982))，在pH7-9.5時，所用緩沖液為TRIS0.05M。16小時后，于0.45μm膜過濾器上過濾樣品，然后通過HPLC法進行分析。
圖1顯示了在各種溫度下殘余活性與pH值之間的關系。從中可以看出，本發(fā)明式IV化合物在pH7時顯示出最佳穩(wěn)定性，該穩(wěn)定性似乎不受溫度影響，而當pH值在8以上時穩(wěn)定性迅速下降。除25℃外，當pH值低于7時穩(wěn)定性緩慢下降，而在25℃外，當pH值低于7時穩(wěn)穩(wěn)性緩慢下降，而在25℃時穩(wěn)定性似乎迅速下降。但是，這可能是由于實驗誤差造成的。
分析--HPLC法柱Spherisorb Hexyl 5μm，140mm×4.6mm流速1.5ml/分鐘檢測220nm和210nm洗脫液55％乙腈+0.1％三氟乙酸樣品10μl保留時間約6.3分鐘物理和化學性質通過前面所述的分離步驟從乙醇水溶液中結晶物質后得到具有以下理化性質的白色晶體(于80℃干燥2小時并于無水硅石上的真空干燥器中過夜保存)。
1.物理性質性狀無色晶體MP194-195℃[α]D21(C＝0.4，MeOH)205°元素分析(C56H89N9O14·H2O)實測值 C59.44H8.14N10.89
計算值C59.50H8.11N11.15從甲醇中結晶物質后得到具有以下理化性質的無水白色晶體(于80℃干燥2小時，并在無水硅石上的真空干燥器中過夜保存)。
1.物理性質性狀無色晶體MP210-212℃[α]D21(C＝0.4，MeOH)-227°元素分析(C56H89N9O14)實測值 C60.11H8.00N11.28計算值 C60.48H8.06N11.33質譜(FAB) MH+1112.62.化學性質總酸水解(6NHCl，18-24小時，110℃)產生下列α-氨基酸和羥基酸(通過三氟乙基-正丁基酯衍生物的氣相色譜/質譜分析測得，括號中的數(shù)字表示每種氨基酸出現(xiàn)的數(shù)目)。
乳酸(1) C3H4O2甘氨酸(1)C2H3NO纈氨酸(1)C5H9NON-Me-纈氨酸(3) C6H11NON-Me-異亮氨酸(1) C7H13NO六氫吡啶羧酸(1) C6H9NON-Me-天冬氨酸(1) C5H7NO3O-Me-酪氨酸(1) C10H11NO2C56H89N9O14本發(fā)明化合物BK202對水合茚三酮試驗呈陰性，不含可被乙?；腦H官能團(乙酸酐/吡啶，24小時，室溫)而具有一個游離羧基，通過用重氮甲烷處理后它能被酯化為相應的一甲基酯BK202-Me(Cf-PDMS，MH+1126.5)。
本發(fā)明化合物BK202含有內酯鍵(IR1736cm-1)。通過溫和的堿水解(0.1N NaOH；0.5小時，室溫)，該內酯鍵可被打開，產生開環(huán)衍生物BK202-OH。用重氮甲烷處理后BK202-OH可變?yōu)橄鄳亩谆K202Me2(Cf-PDMS，MH+1158.4)光譜數(shù)據BK2021H-NMR由于多種構象體的共存而導致的光譜的復雜性，目前只完成了表1所示的部分排布。
表11H-NMR光譜的部分排布(圖2)與TMS相關的主要構象物的化學位移值(多重性(d＝雙峰，t＝三峰，dd＝雙雙峰，q＝四峰，m＝多重峰，br＝寬峰)，J-Hz值)殘基 NHα-Hβ-H γ-H 其他O-MeTyr 7.50 5.203.25 ---- 7.00(2H，d，8)(d，10)(m)(2H，m) 6.70(2H，d，8)Val 7.00 4.552.10 0.80，0.89----(d，10) (t，10) (m) (2Me，d，7)Gly 7.08 4.02---- ---- ----(br) (dd，6/18)NMe-Val ---- 5.192.37 0.88，0.98 ----(d，11) (m) (2Me，d，7)NMe-Val ---- 4.312.43 0.89，1.06 ----(d，10) (m) (2Me，d，7)NMe-Val ---- 4.742.13 0.68，？ ----(d，10) (m) (Me，d，7)Lac ---- 5.471.40 ---- ----(q，7) (Me，d，7)
1H-NMR是作為原光譜示于圖2-4中。(圖2、3和4分別于CDCl3、DMSO-d6和CD3OD中的400MHz譜)。13C-NMR100.6MHz(于CDCl3中)(圖5)IRKBr(圖6)BK202的衍生物BK202-MeIRKBr(圖7)生物檢測將10個灰葡萄孢的孢子加到包括以下成分的50ml稀鹽中磷酸氫銨 66mg磷酸二氫鉀68mg磷酸氫二鉀87mg二水氯化鈣7.4mg六水氯化鎂10mg接種前，用蒸餾水將鹽溶液加到1升并于121℃滅菌20分鐘。
在瓊脂保持液體狀態(tài)而對孢子無任何損害的30℃-45℃范圍內有利于葡萄孢屬孢子存活的溫度下，將該鹽溶液與50mlYPG瓊脂混合。將12ml該混合液倒入9cm陪氏平皿中讓其固化。在瓊脂中打出1-5個直徑4mm的孔，并向每孔中倒入15μl培養(yǎng)肉湯。
將陪氏平皿于20-25℃培養(yǎng)2天?？字車黠@的非生長區(qū)的出現(xiàn)說明有殺真菌劑的存在--該區(qū)越大，殺真菌作用越強。在前述條件下的CMICC337159的上清液產生一個相當擴散的區(qū)，直徑為40mm。在立體顯微鏡下，可以看出真菌的存在，但其正常生長被阻止。在光學顯微鏡下，菌絲體以大的泡囊出現(xiàn)，揭示了一種特定的作用方式。
哺乳動物致病性當將含有殺真菌劑、活孢子和菌絲體的培養(yǎng)肉湯按每千克體重20ml的量對小鼠進行腹膜注射時，未顯示出任何作用。該肉湯含有約4.5×107活孢子數(shù)/ml。
毒理學在以下的試驗中，利用晶體形式的式IV化合物，對BK202的毒性進行了研究。
--小鼠中的急性口服和靜脈注射毒性，和--Ames斑點試驗和皮膚刺激(Skintex)的體外測式。
當活性成分是以懸浮液形式對動物給藥時，其劑量不超過1600mg/kg；當以溶液形式在尾部進行靜脈給藥時，其劑量不超過13mg/kg。
根據以上試驗值測出BK202的IC50值為ATP＞10μg/ml；化學發(fā)光＞10μg/ml。
最后的結論是，BK202在所進行的試驗中未顯示出毒性，而且，在Skintex試驗中BK202可能造成的刺激最低。
殺真菌活性進行實驗以測定式IV化合物對各種真菌的效力。將活性成分溶于60％乙醇中并加到冷卻的馬鈴薯葡糖瓊脂中，分別得到25、5、1、0.2、0.04和0.0016μg活性成分/ml的終濃度。對照平皿中不含活性成分。
將10ml瓊脂培養(yǎng)基倒入9cm陪氏平皿中，并用用于試驗的真菌分離物的有效成長的菌絲體接種每種濃度的培養(yǎng)基。在分離物的最佳生長溫度下培養(yǎng)平皿3-6天，然后按毫米測定生長并與對照進行比較。
試驗分離物包括了卵菌綱、子囊菌綱、擔子菌綱、半知菌綱和接合菌綱在內的各種真菌。
結果發(fā)現(xiàn)，BK202對屬于子囊菌和半知菌種的真菌的殺菌活性最強。對以下真菌尤其有效子囊菌綱黑星菌屬，如蘋果黑星菌核盤菌屬，如核盤菌鏈核盤菌屬，如果生鏈核盤菌曲霉屬，如煙曲霉青霉屬，如指狀青霉半知菌綱葡萄孢屬，如灰葡萄孢殼二孢屬，如豌豆殼二孢核腔菌屬，如圓核腔菌尾孢屬，如菾菜生尾孢(弱)莖點霉屬，如P.sorghing(弱)鏈格孢屬，如鏈格孢(弱)鐮孢屬，如F.lycopersici(弱)除發(fā)現(xiàn)對菾菜生尾孢、P.sorghina、鏈格孢和F.lycopersici的抑制作用較弱外，在濃度低達0.0016μg/ml時對以上真菌的抑制作用也極強。
對接合菌綱的真菌種只發(fā)現(xiàn)有較弱的抑制作用，對卵菌綱和擔子菌綱的真菌種實際上未發(fā)現(xiàn)有抑制活性。
對植物的生物活性在以下實施例中所用的濃度下未發(fā)現(xiàn)植物毒性。
實施例1對西紅柿植株上灰葡萄孢的抗性用每毫升含有0.035毫克活性成分的液體懸浮液處理西紅柿植株(“First in Field”品種，3周齡)。將該植株于溫室中干燥24小時，然后用含有105灰葡萄孢孢子/ml的孢子懸浮液(于25％葡萄汁中)接種。于透明聚乙烯袋中培養(yǎng)該植株6天(于15℃-20℃光照16小時(1000lux)和暗置8小時)以將相對濕度提高至95-100％。未觀察到真菌的破壞作用。對照植物按同樣方式處理，只是施用的是不含活性成分的懸浮液，結果發(fā)現(xiàn)其上長滿灰葡萄孢。
實施例2對蘋果(Golden Delicious)上灰葡萄孢的抗性將含有9.8μg活性成分/ml的懸浮液噴灑于人工損傷的蘋果上。第二天用含有1×105/ml真菌的孢子懸液接種被處理過的蘋果，并于高空氣濕度和18-20℃下保溫1周。評估時，計數(shù)被感染的損傷部位，并由此測定試驗物質的殺真菌效果?；钚曰衔锿耆乐沽苏婢纳L。未處理的蘋果則百分之百地被灰葡萄孢感染。
實施例3對草霉(Senga-Sengana)上灰葡萄孢的抗性按照EPPO指南在丹麥的Funen完成了田間試驗(Guideline for the BiologicalEvaluation of Fungicides.Botrytis cinerea onstrawberries)。
試驗田的大小為20m2，并重復三份。所用活性化合物為含有約10％活性成分(a.i.)的試驗配方。使用三種濃度的活性化合物100，300和900g a.i./ha.噴灑體積為1200l/ha。
在以下生長期噴灑草霉T1，開始開花；T2，10％開花；T3，50％開花；T4，80％開花。
用市售殺真菌劑ROVRAL作為標準對照。
通過分別對健康的和被感染的草霉計數(shù)和稱重而完成評定。
結果如圖8所示，每次試驗的感染程度均被標出。從圖8可以看出，BK202顯示出比ROVRAL更優(yōu)越的殺真菌效果。
實施例4對葡萄(Ugni Blane)上灰葡萄孢的抗性按照CEB Method No.37在法國的Bordeaux進行了田間試驗。
試驗田由一行15株葡萄組成，總共六行。所用活性化合物為含有約10％活性成分的試驗配方。應用三種濃度的活性化合物100，300和900g a.i./ha.水體積為300l/ha。
在以下生長期對葡萄進行噴霧T1，葡萄串的形成結束；T2，葡萄開始成熟；T3，收獲前3-4周。
使用市售殺真菌劑RONILAN和BASULTRA作為標準對照。
在出現(xiàn)病害后通過估測灰葡萄孢損害的強度和頻率而完成評定。
其結果如圖9所示，其中標出了每次試驗的感染強度(定義為100串葡萄中發(fā)病的百分數(shù))。從圖9可以看出，BK202顯示出比RONILAN和BASULTRA更強的殺真菌效果。
實施例5對西紅柿(Matador)上灰葡萄孢的抗性在丹麥的Lyngby完成了溫室試驗。
試驗田由7株植株組成(約12周齡，1m高)，并重復三組。將這些植株置于塑料“帳蓬”中以維持濕度。噴灑植株前對每植株的20片葉子進行機械損傷以利灰葡萄孢的侵襲。所用的活性化合物為約含有10％活性成分的試驗配方。應用三種濃度的活性化合物0.01％，0.03％和0.09％。水體積為770ml/試驗田。
損傷葉子后立即噴灑西紅柿。殺真菌劑處理24小時后，通過噴灑懸浮于30％橙汁中的灰葡萄孢于植株而完成人工接種。
利用市售殺真菌劑RONILAN作為標準對照。
通過對葉子、枝條、果實和花蕾上的侵襲數(shù)進行計數(shù)而完成評定。
結果示于圖10，其中表示了每次試驗中感染的程度。從圖10可以看出，在所有濃度下BK202均顯示出比RONILAN更優(yōu)越的殺真菌效果。
實施例6對抗殺真菌劑的灰葡萄孢分離物的抗性將一個抗BENLATE的分離物(分離物A)、一個抗BENLATE、ROVRAL和SUMISCLEX的分離物(分離物B)從已噴灑了上述殺蟲劑的植物中分離出來。在體外檢測中測定BK202對這些分離物的作用效果，并與三種市售殺蟲劑進行比較。將殺真菌劑加到瓊脂中并按不同濃度分散到陪氏平皿中，然后用敏感菌株(正常(分離物C))和兩種抗性菌株接種。25℃培養(yǎng)3天后測定生長(mm)。
其結果示于下面的表II。
表II殺蟲劑濃度 分離物分離物 分離物ppm AB CBK202 10 00 02 00 00.125 00 0ROVRAL10 013 02 046 0BENLATE10 50 50 02 65 62 0SUMISCLEX10 035 02 046 0對照 - 76 80 74實施例7對蘋果(Golden Delicious)上果生鏈核盤菌的抗性將蘋果進行表面滅菌，每個蘋果用直徑2.1mm的釘子鉆孔5次，然后浸入含有0、0.5、5、50和500mg a.i./ml的懸浮液中?；钚猿煞譃?i)BK202，(ii)苯菌靈(BENLATE)，(iii)iprodione(ROVRAL)。將4個蘋果鉆孔并用每種濃度的三種殺蟲劑處理，使每種濃度共產生20個損傷。將蘋果置于成排的塑料容器中，損傷朝上。24小時后，用含有1×105孢子/ml的果生鏈核盤菌懸浮液噴灑損傷部位。然后用聚乙烯袋覆蓋容器，并保持于室溫(約22℃)下。
5天后，通過計數(shù)被感染的損傷數(shù)而評定效果(每次處理的最大感染損傷為20)。
結果如表III所示。
表III濃度BK202 BENLATEROVRAL0mg ai/l 20 20 200.5mg ai/l18 18 205.0mg ai/l14 19 1950mg ai/l 7 12 15500mg ai/l1 3 4從表III可以看出，BK202對果生鏈核盤菌的活性優(yōu)于兩種被試驗的市售殺真菌劑。
據信可被保護以抗真菌侵襲的其它作物的例子是梨、李樹、桃樹、櫻桃、木莓、蠶豆、豌豆、黃豆、油培養(yǎng)物(如油菜、芥子、橄欖、向日葵等)、谷物、黃瓜、甜瓜、柑桔屬水果(如橙子、檸檬、中國柑桔等)、菠菜、萵苣、土豆、胡椒、鱷梨、茄子、香蕉、菊科植物(如非洲菊)以及其它觀賞植物等。
權利要求
1.一種非藥用殺真菌組合物，該組合物的活性成分為式IV的化合物 BK202(IV)其中每個氨基酸殘基和乳糖殘基可分別以L-型或D-型存在，及其衍生物，優(yōu)選其中所有氨基酸殘基均為L-型且乳酸殘基為D-型的式(IV)化合物及其衍生物。
2.權利要求1的殺真菌組合物，其中所述的化合物以0.001μg/ml-100μg/ml的量存在。
3.根據權利要求1和2的非藥用殺真菌組合物與其它殺生物劑合用。
4.權利要求3的殺真菌組合物，其中所說的其它殺生物劑選自殺蟲劑，例如殺真菌劑、除莠劑、殺昆蟲劑、殺線蟲劑、殺螨劑或植物營養(yǎng)素，植物長生調節(jié)劑和肥料。
5.權利要求3的殺真菌組合物，其中所說的其它殺生物劑是另一種殺真菌劑，選自麥角甾醇生物合成抑制劑(“EBIs”，吡咯或非吡咯類)，酰替苯胺、苯并咪唑、氨基甲酸酯、二甲酰亞胺、二硫代氨基甲酸酯、雙二硫代氨基甲酸酯、咪唑、三唑、鄰苯二甲腈、多鹵烷基硫代化合物和亞磷衍生物。
6.權利要求3-5任一項的殺真菌組合物，其中所說的其它殺生物劑以0.001-50％(重量)，最好以0.01-10％(重量)的量存在。
7.一種在已被或易被真菌侵染的部位對抗真菌的方法，該方法包括將權利要求1-6任一項的組合物施用于所說的部位。
8.權利要求7的方法，用于對抗植物上、木材上、化妝品、飼料和食物上的真菌。
9.權利要求7或8的方法，用于控制屬于半知菌綱或子囊菌綱的真菌菌種的侵襲。
10.權利要求7，8或9的方法，用于控制屬于黑星菌屬、核盤菌屬、鏈核盤菌屬、曲霉屬、青霉屬、葡萄孢屬、殼二孢屬、核腔菌屬、尾孢屬、莖點霉屬、鏈格孢屬、或鐮孢屬的真菌菌種的侵襲。
11.權利要求10的方法，用于控制屬于葡萄孢屬的真菌菌種，特別是灰葡萄孢的侵襲。
12.權利要求1-6任一項的組合物在處理植物方面的應用。
13.權利要求1-6任一項的組合物在木材或樹木的防腐方面的應用。
14.權利要求1-6任一項的組合物在涂料防腐方面的應用。
15.權利要求1-6任一項的組合物在化妝品防腐方面的應用。
16.權利要求1-6任一項的組合物在食物和飼料的防腐方面的應用。
17.權利要求1-6任一項的組合物作為生長培養(yǎng)基的添加劑的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了含有式IV的化合物及其衍生物作為活性成分的殺真菌組合物，式IV中的每個氨基酸殘基和乳糖殘基分別可以L-型或D-型存在。還公開了該組合物在控制作物中的真菌和在木材、涂料、化妝品和可食用產品的防腐方面的應用。
文檔編號C07K1/113GK1142895SQ96103738
公開日1997年2月19日 申請日期1996年3月26日 優(yōu)先權日1990年9月17日
發(fā)明者羅比·I·尼爾森, 斯·布來赫特, 喬治·威·杰恩森 申請人:諾沃挪第克公司