本發(fā)明涉及重組腺病毒，尤其涉及表達(dá)人腸道病毒71型衣殼蛋白的重組腺病毒，本發(fā)明還涉及由所述重組腺病毒在制備預(yù)防或治療手足口病的疫苗中的應(yīng)用，屬于重組腺病毒的構(gòu)建及應(yīng)用領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

腸道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)是引起人手足口病(Hand,Foot and Mouth Disease,HFMD)的主要病原。該病多發(fā)于5歲以下兒童，患兒除發(fā)生手、足、口腔等部位的皰疹外，臨床上還表現(xiàn)為皰疹性咽峽炎、無菌性腦膜炎和脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹，病癥嚴(yán)重者可引起死亡。目前還無有效的措施阻止EV71疾病的流行，在疫情爆發(fā)時(shí)唯一控制EV71流行的方法就是公共衛(wèi)生監(jiān)督和隔離。

目前國內(nèi)外EV71疫苗的研究主要集中在全病毒滅活疫苗。雖然滅活疫苗能夠誘導(dǎo)高水平的中和抗體，可是制備滅活疫苗的種毒是活病毒，在生產(chǎn)過程中存在散毒的風(fēng)險(xiǎn)。因此，開發(fā)更加安全有效的新型疫苗是未來的發(fā)展方向。

腺病毒(Adenovirus，Ad)載體在多種哺乳動物細(xì)胞上能夠高效地進(jìn)行基因轉(zhuǎn)導(dǎo)和蛋白表達(dá)，使其在疫苗開發(fā)及基因治療的研究中廣受青睞。最常用的腺病毒載體是缺損腺病毒5型，它是一種復(fù)制缺陷性型病毒，因缺失了復(fù)制所必須的E1和E3基因，導(dǎo)致其在體內(nèi)不能復(fù)制，這就保證了該病毒作為疫苗載體的安全性，也因此排除了針對載體免疫應(yīng)答的干擾，保證了載體疫苗在重復(fù)使用時(shí)的有效性。

缺損腺病毒5型載體具有較好的誘導(dǎo)特異性細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力；使用重組腺病毒疫苗時(shí)，不用佐劑即可以達(dá)到良好的免疫效果；同時(shí)， 腺病毒在感染細(xì)胞內(nèi)不發(fā)生整合，這就排除了致癌和致突變的危險(xiǎn)；Ad4和Ad7活載體疫苗已在美國批準(zhǔn)使用30年，缺損型Ad5應(yīng)用于基因治療也有30年歷史，至今在人類腫瘤細(xì)胞中尚未發(fā)現(xiàn)有腺病毒基因的整合。目前，已用腺病毒載體表達(dá)了多種病原體(包括細(xì)菌、病毒等病原微生物)的基因。動物試驗(yàn)表明，腺病毒載體疫苗由于能夠同時(shí)誘導(dǎo)堅(jiān)強(qiáng)的體液免疫和細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答反應(yīng)，所以用相應(yīng)病原體攻擊時(shí)的免疫保護(hù)效果均比較理想。

P1是EV71病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，在非結(jié)構(gòu)蛋白3CD的作用下可裂解為衣殼蛋白VP0、VP1和VP3，并且能自動組裝成病毒空衣殼?？找職ぴ谛螒B(tài)結(jié)構(gòu)上與天然的病毒顆粒相似，具有很強(qiáng)的免疫原性和生物學(xué)活性，但不具有感染性，因此不存在散毒的風(fēng)險(xiǎn)。

有研究者嘗試開發(fā)以腺病毒為載體表達(dá)EV71病毒衣殼蛋白的新型疫苗，但是由于構(gòu)建策略不合理以及獲得的重組腺病毒不穩(wěn)定等因素，致使EV71病毒衣殼蛋白表達(dá)量極低而無應(yīng)用前景(戈小琴等，中國生物制品學(xué)雜志，2010)。因此，構(gòu)建穩(wěn)定、高效表達(dá)EV71病毒衣殼蛋白的重組腺病毒，對于研制防治人手足口病的新型疫苗具有非常重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一是提供兩組含有EV71病毒衣殼蛋白P1基因和3CD基因的EV71亞基因組；

本發(fā)明的目的之二是提供兩株穩(wěn)定、高效表達(dá)人腸道病毒71型衣殼蛋白的重組腺病毒，該重組腺病毒能穩(wěn)定、高效的表達(dá)EV71病毒的衣殼蛋白且遺傳穩(wěn)定，能夠?qū)⑵鋺?yīng)用于制備預(yù)防或治療人手足口病的疫苗。

本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案來現(xiàn)實(shí)的：

本發(fā)明分別以堿性蛋白酶裂解位點(diǎn)和口蹄疫病毒2A基因相連接的融合基因、具有高翻譯起始效率的口蹄疫病毒IRES元件為Linker，分別構(gòu) 建了兩組含有人腸道病毒71型(EV71)病毒結(jié)構(gòu)蛋白前體P1基因和病毒蛋白酶3CD基因的亞基因組，即：P1-F2A-3CD和P1-IRES-3CD，兩組亞基因組的核苷酸序列分別為SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示。

口蹄疫病毒(FMDV)的2A蛋白和IRES元件常用于構(gòu)建多個(gè)基因共表達(dá)的linker。但是，口蹄疫病毒的2A蛋白作為linker時(shí)，往往會與其前面的蛋白形成一個(gè)融合蛋白，2A的殘留可能會影響該蛋白的折疊，進(jìn)而影響蛋白的活性及空衣殼的組裝。本發(fā)明通過大量的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：在VP1蛋白和2A蛋白之間引入堿性蛋白酶裂解位點(diǎn)(Furin cleavage site)，蛋白翻譯后細(xì)胞內(nèi)的堿性蛋白酶可將linker 2A蛋白剪切掉，成功解決了2A蛋白殘留對EV71VP1蛋白折疊以及空衣殼組裝帶來的影響。

IRES元件的起始蛋白合成效率受其來源以及序列差異的影響較大。不同種屬病毒來源的IRES元件，其翻譯起始效率差異非常大；即便是同一種屬病毒，不同毒株來源的IERS翻譯起始效率也不盡相同。另外，即使是同一IRES在不同的表達(dá)系統(tǒng)中起始蛋白的合成效率也存在較大的差異，即IRES的使用需要與表達(dá)系統(tǒng)相匹配。本發(fā)明通過大量的篩選實(shí)驗(yàn)最終發(fā)現(xiàn)，只有選用FMDV O/YS/CHA/05病毒株的IRES作為連接人腸道病毒71型(EV71)病毒結(jié)構(gòu)蛋白前體P1基因和病毒蛋白酶3CD基因的linker，才能在腺病毒表達(dá)系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)起始3CD基因的高效表達(dá)。

本發(fā)明還公開了含有所述亞基因組P1-F2A-3CD或亞基因組P1-IRES-3CD的表達(dá)載體以及含有所述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞；其中，所述的表達(dá)載體優(yōu)選為腺病毒表達(dá)載體。

本發(fā)明將EV71亞基因組P1-F2A-3CD和P1-IRES-3CD插入到腺病毒穿梭載體中并與人缺損型腺病毒5型基因組進(jìn)行同源重組，經(jīng)大量的噬斑篩選和鑒定，最終篩選獲得了兩株能夠高效、穩(wěn)定表達(dá)EV71衣殼蛋白的重組腺病毒Ad5-A和Ad5-B：

本發(fā)明經(jīng)多輪噬斑篩選獲得了4株能夠快速、穩(wěn)定致HEK-293細(xì)胞 病變的重組腺病毒，分別為Ad5-A、Ad5-A13、Ad5-B和Ad5-B17。這4株重組腺病毒對HEK-293細(xì)胞致細(xì)胞病變效應(yīng)與野生型腺病毒Ad5-WT相似。將上述4株重組腺病毒在HEK-293細(xì)胞上連續(xù)傳10代，細(xì)胞均在60h左右完全病變。4株重組腺病毒的增殖滴度略低于野生型腺病毒Ad5-WT，但生長曲線動態(tài)相似。

本發(fā)明進(jìn)一步將重組腺病毒Ad5-A、Ad5-A13、Ad5-B和Ad5-B17在HEK-293細(xì)胞上傳代，對傳至第3和第10代的病毒用特異性引物擴(kuò)增EV71VP1基因。結(jié)果表明，第3代的4株重組腺病毒經(jīng)PCR擴(kuò)增VP1基因豐度相似；然而，第10代重組腺病毒Ad5-A13、Ad5-B17的VP1基因豐度明顯低于Ad5-A、Ad5-B。推測Ad5-A13、Ad5-B17在傳代過程中目的基因可能發(fā)生了丟失，而Ad5-A、Ad5-B具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

Western blot結(jié)果表明，本發(fā)明獲得的重組腺病毒(Ad5-A、Ad5-A13、Ad5-B和Ad5-B17)在感染的HEK-293細(xì)胞中能夠表達(dá)EV71病毒完整的P1和3CD蛋白，同時(shí)3CD對P1進(jìn)行了正確切割。另外，第3代和第10代重組腺病毒Ad5-A、Ad5-B與MAb 22A12反應(yīng)條帶的眼觀顯示密度相似，而第10代重組腺病毒Ad5-A13、Ad5-B17較其第3代與MAb 22A12反應(yīng)條帶的眼觀顯示密度明顯減弱，Western blot結(jié)果與PCR檢測結(jié)果相一致。上述結(jié)果表明，重組腺病毒Ad5-A以及Ad5-B能夠穩(wěn)定、高效表達(dá)EV71病毒衣殼蛋白。本發(fā)明通過大量的噬斑篩選，最終篩選獲得復(fù)制能力好、遺傳穩(wěn)定而且蛋白表達(dá)量高的兩株重組腺病毒Ad5-A和Ad5-B，這也是后期鼠體免疫效果好的重要原因。

本發(fā)明將篩選獲得的重組腺病毒Ad5-A提交專利認(rèn)可的機(jī)構(gòu)進(jìn)行保藏，其微生物保藏編號為：CGMCC No.10889；分類命名為：人腺病毒5型。保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏時(shí)間是2015年6月16日；保藏地址：中國北京朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所。

本發(fā)明將篩選獲得的重組腺病毒Ad5-B提交專利認(rèn)可的機(jī)構(gòu)進(jìn)行保藏，其微生物保藏編號為：CGMCC No.10890；分類命名為：人腺病毒5型。保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏時(shí)間是2015年6月16日；保藏地址：中國北京朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所。

由于長片段的外源基因的插入，導(dǎo)致重組腺病毒不穩(wěn)定，這是很多研究者構(gòu)建的重組腺病毒不穩(wěn)定和蛋白量表達(dá)低的重要原因。有研究者嘗試開發(fā)以腺病毒為載體表達(dá)EV71病毒衣殼蛋白的疫苗，但是由于構(gòu)建策略不合理以及獲得的重組腺病毒不穩(wěn)定等因素，致使EV71病毒衣殼蛋白表達(dá)量極低而無應(yīng)用前景(戈小琴等，中國生物制品學(xué)雜志，2010)。本發(fā)明克服了上述技術(shù)困難，創(chuàng)造性地使用融合了堿性蛋白酶裂解位點(diǎn)的口蹄疫病毒2A基因和具有高翻譯起始效率的口蹄疫病毒IRES元件作為Linker構(gòu)建的EV71亞基因組，所獲得的兩株重組腺病毒能夠高效、穩(wěn)定的表達(dá)EV71病毒衣殼蛋白，且在鼠體內(nèi)的免疫效果好。

對重組腺病毒Ad5-A、Ad5-B免疫鼠血清樣品中的EV71特異性IgG抗體動態(tài)水平的評價(jià)結(jié)果表明，重組腺病毒Ad5-A、Ad5-B免疫組的EV71特異性IgG抗體在二次免疫后迅速升高，并在二免后兩周達(dá)到高峰，隨后開始緩慢下降。Ad5-A和Ad5-B免疫組的特異性IgG抗體水平略低于滅活EV71全病毒抗原免疫組，但無顯著差異。

重組腺病毒Ad5-A、Ad5-B接種小鼠后誘導(dǎo)的針對EV71中和抗體水平及其動態(tài)變化檢測結(jié)果表明，重組腺病毒Ad5-A、Ad5-B免疫組在一次免疫后，中和抗體水平逐漸上升，在二免后兩周達(dá)到高峰，Ad5-A和Ad5-B的中和抗體滴度最高可達(dá)1：256，EV71滅活病毒對照組的中和抗體滴度最高為1：512。隨后中和抗體滴度逐漸下降，在第12周時(shí)重組腺病毒Ad5-A、Ad5-B以及EV71滅活病毒組的中和抗體滴度下降到相近的水平。

由于本發(fā)明構(gòu)建的重組腺病毒表達(dá)的EV71空衣殼基因來源于C4亞型的毒株EV71/Fuyang.Anhui.CHN/1708/1。為了確定該重組腺病毒在小鼠體內(nèi)能否誘導(dǎo)EV71病毒的廣譜型中和抗體，本發(fā)明用EV71不同基因型和基因亞型毒株與免疫鼠血清進(jìn)行交叉中和試驗(yàn)。結(jié)果表明，二免后2周的鼠血清對EV71的B5、B4、C5、C4以及C2亞型病毒均能中和，且中和滴度均略高于1:128水平。上述結(jié)果表明，本發(fā)明構(gòu)建的兩株表達(dá)EV71衣殼蛋白的重組腺病毒在小鼠體內(nèi)均能誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的廣譜中和抗體。

重組腺病毒免疫鼠的細(xì)胞因子檢測結(jié)果顯示，Ad5-A，Ad5-B免疫組小鼠單核淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ、IL-2和IL-4的水平均顯著高于滅活EV71病毒抗原免疫組，表明重組腺病毒誘導(dǎo)抗EV71特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力較滅活EV71病毒抗原具有顯著的優(yōu)勢。

根據(jù)上述小鼠免疫接種實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本發(fā)明構(gòu)建獲得的兩株表達(dá)EV71衣殼蛋白的重組腺病毒可作為防控兒童手足口病的候選疫苗株，能夠應(yīng)用于制備預(yù)防或治療由EV71引起的人手足口病疫苗。

因此，本發(fā)明進(jìn)一步公開了一種預(yù)防或治療由EV71引起的人手足口病的疫苗組合物，包括：免疫上有效量的所述人缺損型腺病毒5型重組腺病毒和藥學(xué)上可接受的佐劑。

本發(fā)明技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下有益效果：

本發(fā)明使用融合了堿性蛋白酶裂解位點(diǎn)的口蹄疫病毒2A基因和具有高翻譯起始效率的口蹄疫病毒IRES元件作為Linker構(gòu)建EV71亞基因組；在腺病毒5型表達(dá)系統(tǒng)中，以這兩種linker構(gòu)建的EV71亞基因組均能正確表達(dá)EV71病毒的衣殼蛋白。經(jīng)大量的噬斑篩選和傳代，本發(fā)明最終篩選獲得了兩株高效表達(dá)EV71病毒衣殼蛋白的重組腺病毒，其在感染的細(xì)胞中能夠表達(dá)EV71病毒完整的P1和3CD蛋白，同時(shí)3CD對P1進(jìn)行了正確切割；在小鼠體內(nèi)能夠誘導(dǎo)高水平的廣譜中和抗體，其誘導(dǎo)抗EV71特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力較滅活EV71病毒抗原具有顯著的優(yōu)勢，能夠 作為預(yù)防或治療由EV71引起的人手足口病的候選疫苗株，具有良好的應(yīng)用前景。

本發(fā)明所涉及到的術(shù)語定義

除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)及科學(xué)術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所了解相同的含義。

術(shù)語“核苷酸”或“多核苷酸”意指單股或雙股形式的脫氧核糖核苷酸、脫氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否則所述術(shù)語涵蓋含有天然核苷酸的已知類似物的核酸，所述類似物具有類似于參考核酸的結(jié)合特性并以類似于天然產(chǎn)生的核苷酸的方式進(jìn)行代謝。除非另外特定限制，否則所述術(shù)語也意指寡核苷酸類似物，其包括PNA(肽核酸)、在反義技術(shù)中所用的DNA類似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等)。除非另外指定，否則特定核酸序列也隱含地涵蓋其保守修飾的變異體(包括(但不限于)簡并密碼子取代)和互補(bǔ)序列以及明確指定的序列。特定而言，可通過產(chǎn)生其中一個(gè)或一個(gè)以上所選(或所有)密碼子的第3位經(jīng)混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列來實(shí)現(xiàn)簡并密碼子取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Cassol等人,(1992)；Rossolini等人,Mol Cell.Probes 8:91-98(1994))。

術(shù)語“宿主細(xì)胞”或“重組宿主細(xì)胞”意指包含本發(fā)明多核苷酸的細(xì)胞，而不管使用何種方法進(jìn)行插入以產(chǎn)生重組宿主細(xì)胞，例如直接攝取、轉(zhuǎn)導(dǎo)、配對或所屬領(lǐng)域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持為例如質(zhì)粒的非整合載體或者可整合入宿主基因組中。宿主細(xì)胞可為原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。

術(shù)語“表達(dá)”意指內(nèi)源性基因或轉(zhuǎn)基因在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。

可互換使用的術(shù)語“疫苗”或“疫苗組合物”指這樣的藥物組合物，其包 括在動物中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的至少一種免疫原性組合物。疫苗或疫苗組合物可以保護(hù)動物免受由于感染的疾病或可能的死亡，并且可以包括或不包括增強(qiáng)活性組分的免疫活性的一種或多種另外組分。疫苗或疫苗組合物可以另外包括對于疫苗或疫苗組合物典型的進(jìn)一步組分，包括例如佐劑或免疫調(diào)節(jié)劑。疫苗的免疫活性組分可以包括以其原始形式的完全活生物體或在經(jīng)修飾的活疫苗中作為經(jīng)減毒的生物體，或在經(jīng)殺死或滅活的疫苗中通過合適方法滅活的生物體，或包括病毒的一種或多種免疫原性組分的亞單位疫苗，或通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備的遺傳改造、突變或克隆的疫苗。疫苗或疫苗組合物可以包括一種或同時(shí)超過一種上述組分。

術(shù)語“佐劑”意指包括一種或多種物質(zhì)的組合物，所述物質(zhì)增強(qiáng)疫苗組合物的抗原性。佐劑可以充當(dāng)緩慢釋放抗原的組織儲存，并且還充當(dāng)非特異性增強(qiáng)免疫應(yīng)答的淋巴樣系統(tǒng)激活。通常，在不存在佐劑的情況下，用單獨(dú)抗原的初次疫苗接種將無法引發(fā)體液或細(xì)胞免疫應(yīng)答。佐劑包括但不限于完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑、礦物質(zhì)凝膠例如氫氧化鋁、表面活性物質(zhì)。

附圖說明

圖1為兩種EV71亞基因組拼接示意圖；其中，A：P1-F2A-3CD亞基因組；B：P1-IRES-3CD亞基因組；

圖2為重組腺病毒Ad5-A、Ad5-A13、Ad5-B和Ad5-B17感染的HEK-293細(xì)胞引起的細(xì)胞病變；

圖3為Ad5-A、Ad5-A13、Ad5-B和Ad5-B17的一步生長曲線；

圖4為重組腺病毒Ad5-A、Ad5-A13、Ad5-B和Ad5-B17的PCR鑒定結(jié)果；

圖5為Western blot檢測EV71衣殼蛋白在Ad5-A、Ad5-A13、Ad5-B和Ad5-B17感染細(xì)胞中的表達(dá)；

圖6為重組腺病毒免疫小鼠誘導(dǎo)的EV71特異性IgG抗體；

圖7為重組腺病毒免疫鼠血清對不同基因型和基因亞型EV71毒株的中和作用；其中，A：重組腺病毒Ad5-A、Ad5-B接種小鼠后誘導(dǎo)的針對EV71中和抗體水平及其動態(tài)變化；B：EV71不同基因型和基因亞型毒株與免疫鼠血清的交叉中和試驗(yàn)結(jié)果；

圖8為重組腺病毒免疫小鼠的細(xì)胞因子水平檢測結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會隨著描述而更為清楚。但是應(yīng)理解所述實(shí)施例僅是范例性的，不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。

1、材料

1.1細(xì)胞、載體和毒株

腺病毒穿梭載體pShuttle-CMV、E.coli BJ5183感受態(tài)菌以及HEK-293細(xì)胞均購自Stratagene公司。大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、pOK12載體由本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室保存。含O型FMDV全長cDNA感染性克隆質(zhì)粒PYS(中國發(fā)明專利，授權(quán)公告號CN 101838658B)，野生型腺病毒5型(Ad5-WT)，由本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室保存。EV71各基因亞型毒株JS52-3(C4亞型)、TW-2006-02203(B4亞型)、XMCDC-5535(B5亞型)、TW-2008-02969(C5亞型)、TW-2008-03149(C2亞型)以及滅活的EV71全病毒純化抗原均由中國食品藥品檢定研究院病毒室保存。

1.2工具酶與主要試劑

C4亞型EV71VP1單克隆抗體(MAb)22A12由中國疾病預(yù)防控制 中心的畢勝利教授饋贈，限制性內(nèi)切酶Pme I和Pac I購自NEB公司。PrimeSTAR DNA聚合酶和其他限制性內(nèi)切酶均購自TaKaRa公司。T₄DNA連接酶購自NEB公司。轉(zhuǎn)染試劑采用QIAGEN公司的Effenctene Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑盒。質(zhì)粒提取試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒以及小量膠回收試劑盒購自上海華舜生物技術(shù)有限公司。辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗鼠IgG(HRP-IgG)購自Sigma公司。EV71全病毒抗原包被的ELISA試劑盒，購自北京貝爾生物工程有限公司(北京)。

實(shí)施例1表達(dá)人腸道病毒71型衣殼蛋白的重組腺病毒的構(gòu)建

1、實(shí)驗(yàn)方法

1.1引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GeneBank上已登錄的C4亞型EV71/Fuyang.Anhui.CHN/1708/1毒株基因組序列，人工合成EV71P1-F2A-3CD亞基因組，并克隆于pUC57載體上，命名為pUC57-A。用于構(gòu)建EV71P1-IRES-3CD亞基因組的引物見表1。引物設(shè)計(jì)使用Oligo 6.0軟件，引物及EV71P1-F2A-3CD基因均由上海生物工程有限公司合成。

P1-F2A-3CD亞基因組，其核苷酸序列為SEQ ID NO.1所示；P1-IRES-3CD亞基因組，其核苷酸序列為SEQ ID NO.2所示。

表1用于構(gòu)建EV71P1-IRES-3CD亞基因組的引物

1.2重組腺病毒穿梭載體的構(gòu)建

分別以質(zhì)粒pUC57-A和pYS為模板，用表1中引物擴(kuò)增含相應(yīng)酶切位點(diǎn)的P1、3CD和IRES基因片段，并按圖1的設(shè)計(jì)方案，拼接、克隆于 pOK12載體中，獲得的重組質(zhì)粒命名為pOK-B。

經(jīng)測序驗(yàn)證正確的pOK-B重組質(zhì)粒與pUC57-A重組質(zhì)粒，經(jīng)限制性內(nèi)切酶Hind III和Not I雙酶切后，將兩個(gè)EV71亞基因組分別定向克隆至pShuttle-CMV載體中，獲得的重組穿梭質(zhì)粒分別命名為pShuttle-A和pShuttle-B。

1.3重組腺病毒質(zhì)粒的構(gòu)建

將pShuttle-A和pShuttle-B用限制性內(nèi)切酶PmeI線性化，電轉(zhuǎn)化至含有腺病毒骨架載體AdEasy-1的BJ5183感受態(tài)菌(AdEasy-1-BJ5183)中。經(jīng)卡那霉素抗性篩選，提取質(zhì)粒，用Pac I酶切鑒定，選擇3個(gè)陽性重組腺病毒質(zhì)粒進(jìn)行測序，確定正確的命名為pAd5-A和pAd5-B。

1.4轉(zhuǎn)染

陽性質(zhì)粒pAd5-A和pAd5-B轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)菌，大量增殖重組質(zhì)粒。用中量質(zhì)粒提取試劑盒提取腺病毒重組質(zhì)粒，用Pac I酶切，乙醇沉淀滅菌，超凈工作臺無菌吹干并以無菌超純水溶解沉淀，使質(zhì)粒的終濃度為1～2mg/ml。用QIAGEN公司轉(zhuǎn)染試劑Effectene Transfection Reagent轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞，具體操作按說明書進(jìn)行。

將收獲的重組腺病毒反復(fù)凍融后，離心取上清，接種HEK-293細(xì)胞，連續(xù)傳10代，觀察細(xì)胞病變情況。

2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將含有EV71亞基因組的重組腺病毒質(zhì)粒pAd5-A和pAd5-B經(jīng)限制性內(nèi)切酶PacI線性化后轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后7天細(xì)胞開始出現(xiàn)病變，細(xì)胞變圓、變大、脫落，這表明重組腺病毒已成功拯救。將兩種以不同方式構(gòu)建的重組腺病毒分別經(jīng)多輪噬斑篩選，獲得了4株能夠快速、穩(wěn)定致HEK-293細(xì)胞病變的重組腺病毒，分別命名為Ad5-A、Ad5-A13、Ad5-B和Ad5-B17。這4株重組腺病毒對HEK-293細(xì)胞致細(xì)胞病變效應(yīng) 與野生型腺病毒Ad5-WT相似，正常對照細(xì)胞HEK-293細(xì)胞生長良好(圖2)。

將重組腺病毒Ad5-A、Ad5-A13和Ad5-B、Ad5-B17在HEK-293細(xì)胞上連續(xù)傳10代，細(xì)胞均在60h左右完全病變。

實(shí)驗(yàn)例1表達(dá)人腸道病毒71型衣殼蛋白的重組腺病毒的鑒定

1、實(shí)驗(yàn)方法

1.1重組腺病毒的PCR鑒定

將實(shí)施例1獲得的重組腺病毒Ad5-A、Ad5-A13和Ad5-B、Ad5-B17接種HEK-293細(xì)胞，連續(xù)傳10代；取第3代和第10代病毒，用DNA抽提試劑盒提取DNA后，使用EV71VP1基因特異性引物(VP1-U:5'GGG GAT AGA GTG GCA GAT GTG AT 3'，VP1-L:5'AAG AGT AGT GAT GGC ATT GCG AC 3')對目的基因VP1進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測。

1.2Western blot

將感染第3和第10代重組腺病毒的HEK-293細(xì)胞進(jìn)行SDS-PAGE分析，同時(shí)分別設(shè)立野生型腺病毒(Ad5-WT)感染的HEK-293細(xì)胞和HEK-293細(xì)胞作為陰性對照，以MAb 22A12(1:1000稀釋)為一抗，37℃作用1h，用PBST洗滌后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠IgG(1:10,000稀釋)，37℃作用1h，洗滌后加入DAB溶液顯色。

1.3重組腺病毒增殖比較試驗(yàn)

用10MOI劑量的第10代重組腺病毒(Ad5-A、Ad5-A13、Ad5-B和Ad5-B17)以及Ad5-WT分別接種HEK-293細(xì)胞，在接種后12、24、36、48、60和72h收取病毒并進(jìn)行毒價(jià)測定，繪制重組腺病毒與野生型腺病毒的一步生長曲線。

2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1重組腺病毒的生長特性

為比較重組腺病毒的生長特性，本發(fā)明分別繪制了Ad5-A、Ad5-A13、Ad5-B、Ad5-B17的第10代重組腺病毒以及Ad5-WT的一步生長曲線并進(jìn)行比較(圖3)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，噬斑篩選獲得的四株重組腺病毒的增殖滴度雖略低于野生型腺病毒Ad5-WT，但生長曲線動態(tài)相似。隨著重組腺病毒感染HEK-293細(xì)胞時(shí)間的延長，病毒滴度逐漸升高，在60h時(shí)重組腺病毒的滴度達(dá)到峰值，隨后開始下降。

2.2EV71衣殼蛋白在重組腺病毒中的表達(dá)及其穩(wěn)定性

將重組腺病毒Ad5-A、Ad5-A13、Ad5-B和Ad5-B17在HEK-293細(xì)胞上傳代，對傳至第3代和第10代的病毒，用DNA抽提試劑盒提取重組病毒DNA，用特異性引物擴(kuò)增EV71VP1基因。結(jié)果如圖4所示，第3代的4株重組腺病毒經(jīng)PCR擴(kuò)增VP1基因豐度相似(圖4)，Ad5-WT未擴(kuò)增出相應(yīng)條帶。然而，第10代重組腺病毒Ad5-A13、Ad5-B17的VP1基因豐度明顯低于Ad5-A、Ad5-B。推測Ad5-A13、Ad5-B17在傳代過程中目的基因可能發(fā)生了丟失。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相比重組腺病毒Ad5-A13和Ad5-B17，重組腺病毒Ad5-A、Ad5-B具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

對重組腺病毒Ad5-A、Ad5-A13、Ad5-B和Ad5-B17表達(dá)EV71衣殼蛋白的能力進(jìn)行Western blot分析。由于本發(fā)明在EV71VP1蛋白與linker2A蛋白之間引入堿性蛋白酶裂解位點(diǎn)，因此linker 2A蛋白能夠在細(xì)胞內(nèi)被剪切去除，從而形成完整的VP1蛋白，不影響病毒空衣殼的包裝。結(jié)果如圖5所示，4株重組腺病毒表達(dá)的蛋白與MAb 22A12發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的條帶與EV71VP1的大小相當(dāng)，野生型腺病毒和正常細(xì)胞未出現(xiàn)特異性條帶。這些結(jié)果表明，本發(fā)明獲得的重組腺病毒在感染的HEK-293細(xì)胞中能夠表達(dá)EV71病毒完整的P1和3CD蛋白，同時(shí)3CD對P1進(jìn)行了正確切割。另外，第3代和第10代重組腺病毒Ad5-A、Ad5-B與MAb 22A12反應(yīng)條帶的眼觀顯示密度相似，而第10代重組腺病毒Ad5-A13、Ad5-B17較其第3代與MAb 22A12反應(yīng)條帶的眼觀顯示密度明顯減弱，Western blot結(jié)果與PCR檢測結(jié)果相一致。這些結(jié)果表明，相比重組腺病毒Ad5-A13和Ad5-B17，重組腺病毒Ad5-A以及Ad5-B能夠更加穩(wěn)定、高效的表達(dá)EV71病毒衣殼蛋白。

本發(fā)明將重組腺病毒Ad5-A、Ad5-B分別提交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心進(jìn)行保藏，其微生物保藏編號分別為：CGMCC No.10889、CGMCC No.10890。

實(shí)驗(yàn)例2表達(dá)人腸道病毒71型衣殼蛋白的重組腺病毒的免疫實(shí)驗(yàn)

1、實(shí)驗(yàn)方法

1.1重組腺病毒免疫BALB/c鼠

選用6周齡SPF級BALB/c雌鼠140只，購自于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動物中心。隨機(jī)分成4組，每組35只，其中第1組免疫重組腺病毒Ad5-A(微生物保藏編號為：CGMCC No.10889)；第2組免疫重組腺病毒Ad5-B(微生物保藏編號為：CGMCC No.10890)；第3組為陰性對照組，免疫重組腺病毒Ad5-WT；第4組為陽性對照組，免疫滅活的EV71全病毒純化抗原0.25μg/次/只。重組腺病毒接種劑量為3×10⁷TCID₅₀/ml的病毒液200μl，接種方式為腿部肌肉注射。在第一次免疫后4周以相同劑量加強(qiáng)免疫，分別在一免后0、3、6、9、12周隨機(jī)抽取5只小鼠，摘取眼球采血。

1.2間接ELISA

采集小鼠免疫血清置于37℃1h，然后4℃過夜。4,000rpm離心10min后分離血清，按1:100稀釋用北京貝爾生物工程有限公司的EV71全病毒包被的ELISA試劑盒檢測血清樣品中的特異性IgG抗體水平，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3微量病毒中和試驗(yàn)

待檢血清按1:8比例稀釋后，56℃滅活30min；于96孔板中2倍系列稀釋，分別與100TCID₅₀的EV71混合，37℃作用2h，每塊細(xì)胞培養(yǎng)板均設(shè)細(xì)胞對照、血清對照和病毒對照；加入人橫紋肌肉瘤(RD)細(xì)胞懸液，100μl/孔，細(xì)胞終濃度為2×10⁵個(gè)/ml，置CO₂培養(yǎng)箱中35℃培養(yǎng)7d，將能抑制50％細(xì)胞病變的最高稀釋度判定為血清中和效價(jià)。

1.4細(xì)胞因子檢測

小鼠在加強(qiáng)免疫后3周，無菌取小鼠的脾臟，制備脾細(xì)胞懸液，800g離心30min，分離小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞，96孔板按5×10⁶個(gè)/ml的細(xì)胞密度加入100μl/孔，經(jīng)EV71VP2-36(0.8g/ml，10μl/孔)刺激60h后，按Platinum ELISA試劑盒(eBioscience,San Diego,CA)說明書分別檢測小鼠脾單核淋巴細(xì)胞分泌IL-2、IL-4、IFN-γ的水平，實(shí)驗(yàn)設(shè)培養(yǎng)基對照孔、空白對照孔和刀豆蛋白(ConA)刺激對照孔。

2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1重組腺病毒免疫小鼠誘導(dǎo)的特異性IgG抗體應(yīng)答

用全病毒作為包被抗原的商品化EV71IgG抗體ELISA檢測試劑盒，對免疫鼠血清樣品中的EV71特異性IgG抗體動態(tài)水平進(jìn)行評價(jià)(圖6)。重組腺病毒Ad5-A、Ad5-B以及滅活EV71全病毒抗原免疫組的EV71特異性IgG抗體，在二次免疫后迅速升高，并在二免后兩周(初免后第6周)達(dá)到高峰，隨后開始緩慢下降。Ad5-A和Ad5-B免疫組的特異性IgG抗體水平略低于滅活EV71全病毒抗原免疫組，但無顯著性差異。Ad5-WT免疫組作為陰性對照，無EV71特異性IgG抗體產(chǎn)生。

2.2重組腺病毒在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的中和抗體及其對不同基因亞型EV71病毒的交叉中和能力

利用病毒微量中和試驗(yàn)方法跟蹤檢測重組腺病毒Ad5-A、Ad5-B接種 小鼠后誘導(dǎo)的針對EV71中和抗體水平及其動態(tài)變化(圖7A)。重組腺病毒Ad5-A、Ad5-B以及EV71滅活病毒免疫組在一次免疫后，中和抗體水平逐漸上升，在二免后兩周達(dá)到高峰，其中Ad5-A和Ad5-B的中和抗體滴度最高可達(dá)1:256，EV71滅活病毒對照組的中和抗體滴度最高為1:512。隨后，中和抗體滴度逐漸下降，在第12周時(shí)，重組腺病毒Ad5-A、Ad5-B以及EV71滅活病毒組的中和抗體滴度下降到相近的水平。野生型腺病毒對照組未能檢出EV71中和抗體。

由于本發(fā)明構(gòu)建的重組腺病毒表達(dá)的EV71空衣殼基因來源于C4亞型的毒株EV71/Fuyang.Anhui.CHN/1708/1。為了確定該重組腺病毒在小鼠體內(nèi)能否誘導(dǎo)EV71病毒的廣譜型中和抗體，本發(fā)明用EV71不同基因型和基因亞型毒株與免疫鼠血清進(jìn)行交叉中和試驗(yàn)(圖7B)。結(jié)果表明，二免后2周的鼠血清對EV71的B5、B4、C5、C4以及C2亞型病毒均能中和，且中和滴度均略高于1:128水平。這些結(jié)果表明，本發(fā)明構(gòu)建的兩株表達(dá)EV71衣殼蛋白的重組腺病毒Ad5-A和Ad5-B在小鼠體內(nèi)均能誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的廣譜中和抗體。

2.3重組腺病毒在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)EV71特異性細(xì)胞介導(dǎo)免疫的評價(jià)

目前，EV71疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答研究多集中于體液免疫方面?？墒墙陙淼难芯堪l(fā)現(xiàn)，細(xì)胞免疫應(yīng)答在抗EV71感染過程中尤為重要。輔助性T細(xì)胞主要分Th1和Th2兩個(gè)細(xì)胞亞群，Th1細(xì)胞主要分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α等細(xì)胞因子，主要效應(yīng)功能是增強(qiáng)吞噬細(xì)胞介導(dǎo)的抗感染機(jī)制，特別是抗細(xì)胞內(nèi)寄生菌或病毒的感染。Th2細(xì)胞分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等細(xì)胞因子，主要作用是增強(qiáng)B細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答。輔助性T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的水平代表相應(yīng)T細(xì)胞的活化程度以及細(xì)胞免疫強(qiáng)度。

重組腺病毒免疫鼠的細(xì)胞因子檢測結(jié)果顯示，滅活EV71病毒抗原免疫組小鼠，其脾臟單核淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ、IL-2和IL-4的水平較低，與野生型腺病毒對照組誘導(dǎo)水平相似(圖8)。然而，Ad5-A，Ad5-B免疫 組小鼠，其單核淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ、IL-2和IL-4的水平均顯著高于滅活EV71病毒抗原免疫組(圖8)。這些結(jié)果表明，本發(fā)明構(gòu)建的兩株重組腺病毒Ad5-A和Ad5-B誘導(dǎo)抗EV71特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力較滅活EV71病毒抗原具有顯著的優(yōu)勢。

根據(jù)小鼠免疫接種試驗(yàn)結(jié)果，本發(fā)明構(gòu)建的兩株重組腺病毒Ad5-A和Ad5-B可作為防控兒童手足口病的候選疫苗株。