人偏肺病毒多表位抗原及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及人偏肺病毒B細(xì)胞、T細(xì)胞多表位抗原，屬于基因工程領(lǐng)域，依據(jù)人偏 肺病毒B細(xì)胞表位、CTL細(xì)胞表位和化細(xì)胞表位基因片段的制備、串聯(lián)及表達(dá)，制備人偏肺 病毒多表位抗原，并評(píng)價(jià)其激活細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答水平。
【背景技術(shù)】
[0002] 人偏肺病毒（Humanmetapneumovirus,hMPV)是荷蘭學(xué)者于2001年從呼吸道感染 的嬰幼兒標(biāo)本中分離到的一種新現(xiàn)病毒，其屬于副粘病毒科肺病毒亞科偏肺病毒屬。hMPV 為有包膜的單負(fù)鏈RNA病毒，基因組含有8個(gè)基因編碼9種不同蛋白，分別是核衣殼蛋白 (腳、憐酸化蛋白（P)、基質(zhì)蛋白（M)、融合蛋白（F)、轉(zhuǎn)錄延伸因子（M2-1)、RNA合成調(diào)節(jié)因 子（M2-2)、小疏水蛋白（SH)、主要黏附蛋白（G)、和RNA聚合酶大亞單位化）。從3'至5' 端分別是3' -N-PM-F-M2-1-M2-2-SH-G-L-5'。種系發(fā)生分析表明，HMPV可分為A、B兩個(gè)基 因型。A、B兩個(gè)型別又可根據(jù)黏附蛋白G和融合蛋白F基因序列分別分為A1、A2和B1、B2 兩個(gè)亞型。除G蛋白外，hMPV其它蛋白均高度保守。
[0003] 研究證實(shí)，hMPV是僅次于呼吸道合胞病毒的引起兒童急性呼吸道感染的第二位 病毒病原，其也是老年人、免疫缺陷患者及有基礎(chǔ)疾病人群急性呼吸道感染的重要病原體。 hMPV不能引起感染后持久免疫，可反復(fù)感染。
[0004] 目前尚缺乏抗hMPV的有效藥物和疫苗。研究表明hMPV甲醒滅活疫苗免疫動(dòng)物后 能使再次感染時(shí)疾病加重。表位疫苗具有安全、無(wú)毒、穩(wěn)定、容易生產(chǎn)、可根據(jù)需要組合等優(yōu) 點(diǎn)，而成為最具開發(fā)前景的新型疫苗之一。一個(gè)理想的病毒疫苗不僅要能激發(fā)體液免疫，產(chǎn) 生特異性的中和抗體，還應(yīng)該能激活CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL)免疫來(lái)清除病毒。而CD4+ 輔助性T細(xì)胞燈h)既參與細(xì)胞免疫燈hi細(xì)胞），有利于機(jī)體胞內(nèi)病原體的清除，也有重要 的輔助抗體產(chǎn)生的作用（Th2細(xì)胞）。為發(fā)揮更好的抗病毒作用，T/B細(xì)胞聯(lián)合表位可能更 為合理和有效。目前尚未見將hMPVB細(xì)胞表位和C化、化表位修飾串聯(lián)構(gòu)建為多表位抗 原，評(píng)價(jià)其免疫應(yīng)答的報(bào)道。
[0005]常用的表位篩選方法有化學(xué)或生物法、膚探針掃描技術(shù)、隨機(jī)膚庫(kù)技術(shù)及人工預(yù) 測(cè)法等。前=者有操作繁瑣，工作量大，耗時(shí)長(zhǎng)，成本高，特異性抗體制備困難等缺點(diǎn)，使用 受到一定的限制。生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展，為多表位疫苗的快速發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。近年來(lái)， 研究者開發(fā)了大量的算法和軟件來(lái)進(jìn)行T和B細(xì)胞表位的預(yù)測(cè)，有效性及準(zhǔn)確率等方面有 了很大提高。許多免費(fèi)的在線軟件為研究者的應(yīng)用提供了方便，每種軟件的預(yù)測(cè)都有其局 限性，將多種計(jì)算方法和軟件綜合運(yùn)用，可使抗原表位預(yù)測(cè)的有效性和準(zhǔn)確率大大提高。
[0006] 已有諸多研究證實(shí)副粘病毒科病毒的F蛋白是主要的保護(hù)性抗原，可刺激機(jī)體產(chǎn) 生保護(hù)性中和抗體，且hMPVF蛋白相對(duì)保守（A、B型間同源性約為94%)，可對(duì)所有型別 hMPV有交叉免疫，故F蛋白可作為B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)蛋白。因hMPV的L蛋白較大（約2000aa)， 不適于表位預(yù)測(cè)，參照hRSV的研究，P蛋白無(wú)CTL表位，故hMPV的N、M、F、M2-1、M2-2、甜 和G等7個(gè)蛋白可進(jìn)行CTL和化表位預(yù)測(cè)。
[0007] 本發(fā)明中3段CTL表位（Cl、C2和C3)已有文獻(xiàn)報(bào)道（MelendiGA,Zavala F,BuchholzUJ,etal.Mappingandcharacterizationoftheprimaryandanamnestic H-2 (d)-restrictedcytotoxicT-Iymphocyteresponseinmiceagainsthuman metapneumovirus.Journalofvirology,Oct. 2007,p. 11461-11467;HerdKA,Mahalingam S,MackayIM,etal.CytotoxicT-Iymphocyteepitopevaccinationprotects againsthumanmetapneumovirusinfectionanddiseaseinmice.Journalof virology,Feb. 2006,p. 2034-2044)，可增強(qiáng)CTL細(xì)胞免疫應(yīng)答，可降化攻毒小贏肺部病毒 載量，并減輕肺部組織病理學(xué)改變。本發(fā)明將文獻(xiàn)報(bào)道的CTL表位和自行預(yù)測(cè)的B細(xì)胞表 位、CTL表位和化表位進(jìn)行串聯(lián)，既可激活細(xì)胞免疫中的CTL免疫和化免疫，也可激活體 液免疫，體外實(shí)驗(yàn)對(duì)hMPV有一定中和作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明首先利用在線軟件進(jìn)行人偏肺病毒的T和B細(xì)胞表位的預(yù)測(cè)，本發(fā)明的某 些實(shí)施例給出了B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)、T細(xì)胞表位預(yù)測(cè)的具體方法，預(yù)測(cè)的各優(yōu)選表位序列為：
[0009] 序號(hào)表位序列
[0022] 其中：CUC2、C3為上文列出的文獻(xiàn)報(bào)道的CTL表位。
[0023] 本發(fā)明構(gòu)建的人偏肺病毒的多表位抗原是由6細(xì)胞表位度1、82、83、84、85、86)、 化細(xì)胞表位燈1、1?、CTL細(xì)胞表位序列（CUC2、C3、T4)組合而成。通過(guò)串聯(lián)方式，并用 連接子將上述各類型表位序列連接在一起。
[0024] 多表位抗原的構(gòu)建次序可W為各表位序列的任意排序，優(yōu)選為：
[00巧]B1-B2-B3-B4-B5-B6-C1-C2-C3-C4-T1-T2 ;
[0026] 或T1-T2-C1-C2-C3-C4-B1-B2-B3-B4-B5-B6 ;
[0027] 或T1-T2-B1-B2-B3-B4-B5-B6-C1-C2-C3-C4。
[0028] 各表位序列之間的連接子可W為W甘氨酸一脯氨酸一甘氨酸一脯氨酸一甘氨酸 (GPGPG)、賴氨酸一賴氨酸（KK)、丙氨酸一丙氨酸一酪氨酸（AAY)、甘氨酸一絲氨酸（G巧、甘 氨酸一絲氨酸-甘氨酸一甘氨酸一絲氨酸（GSGG巧中的任意一種。
[0029] 本發(fā)明優(yōu)選的多表位抗原序列為：B1-B2-B3-B4-B5-B6-C1-C2-C3-C4-T1-T2,其 中同類型表位間隔序列為GPGPG，不同類型表位間隔序列為KK;其氨基酸序列為SEQID N0:1 ：
[0031] 上述氨基酸序列相對(duì)應(yīng)的核巧酸序列即為多表位抗原基因hMPV-mea，hMPV-mea 核巧酸序列按大腸桿菌宿主偏愛密碼子進(jìn)行優(yōu)化并合成；當(dāng)然任何可翻譯為多表位抗原氨 基酸序列的核巧酸密碼子序列均可用于該發(fā)明；本發(fā)明優(yōu)選=種核巧酸序列：
[00礎(chǔ) （1)病毒表位自身序列+間隔序列（SEQIDNO:2)
[0034] (2化.Coli偏愛密碼子序列（SEQIDNO:3)
[003引 做小鼠偏愛密碼子序列（SEQIDNO:4)
[0039] 其中：帶下劃線"_"部分為間隔序列GPGPG對(duì)應(yīng)核巧酸，帶雙下劃線"_"為 間隔序列KK對(duì)應(yīng)核巧酸。
[0040] 本發(fā)明還提供hMPV-MEA的表達(dá)及純化方法，某實(shí)施例給出針對(duì)優(yōu)選的多表位抗 原序列度1-B2-B3-B4-B5-B6-C1-C2-C3-C4-T1-T2,其中同類型表位間隔序列為GPGPG，不 同類型表位間隔序列為KK)，W載體祀T32a(+)質(zhì)粒為例進(jìn)行表達(dá)純化。但不僅限于此載 體，其他載體如真核表達(dá)載體PCDNA3. 1載體，pCMVp-NEO-BAN載體，昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng) 等均可。本發(fā)明某實(shí)施例中給出了具體的表達(dá)及純化方法。
[0041] 進(jìn)一步，本發(fā)明針對(duì)上述制備的人偏肺病毒的多表位抗原，評(píng)價(jià)其激活細(xì)胞免疫 和體液免疫應(yīng)答水平。本發(fā)明某實(shí)施例給出了具體的評(píng)價(jià)方法及結(jié)果。
[0042] 本發(fā)明的人偏肺病毒的多表位抗原，通過(guò)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)表明，其既可激活細(xì)胞免疫中 的CTL免疫和化免疫，也可激活體液免疫，體外實(shí)驗(yàn)對(duì)hMPV有一定中和作用。
[0043] 本發(fā)明的人偏肺病毒的多表位抗原可用于表位疫苗的開發(fā)，建立免疫學(xué)診斷方 法，疾病流行病學(xué)研究W及hMPV感染性疾病的免疫治療等。
【附圖說(shuō)明】
[0044] 圖 1.pET32a(+)-hMPV-mea酶切結(jié)果，其中 1 :DL2000Marker，2 :pET32a(+)-mea雙 酶切后，3 :pET32a(+) -mea未酶切
[0045] 圖2.pET32a(+)-hMPV-mea30°C誘導(dǎo)表達(dá)化后產(chǎn)物SDS-PAGE分析，其中1 :蛋白 分子量1日'461'，2:口6132日(+)未誘導(dǎo)，3:口6132日(+)-1116日誘導(dǎo)后上清，4:口6132日(+)-1116日誘 導(dǎo)后沉淀
[004引 圖3.祀T32a(+) -hMPV-mea誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物Westernblot分析（抗His抗體），其 中1:蛋白分子量1曰'461'，2:口6132曰(+)未誘導(dǎo)，3:口6132曰(+)-1116曰誘導(dǎo)后
[0047]圖 4.pET32a(+)-hMPV-mea誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物Westernblot分析化MPV-MEA抗血清）， 其中1:蛋白分子量1曰'461'，2:口6132曰(+)未誘導(dǎo)，3:口6132曰(+)-1116曰誘導(dǎo)后
[004引 圖5.hMPV-MEA抗血清IFA檢測(cè)結(jié)果，其中aAMPV-MEA抗血清IFA檢測(cè)；b:陽(yáng)性 對(duì)照；C:陰性對(duì)照
[0049] 圖6.hMPV-MEA免疫動(dòng)物后淋己細(xì)胞增殖指數(shù)
[0050] 圖7. hMPV-MEA免疫動(dòng)物后CTL殺傷活性
[0051] 圖8.脾細(xì)胞分泌細(xì)胞因子
【具體實(shí)施方式】
[0052] 1.主要試驗(yàn)材料及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
[0053]RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清（GIBC0,美國(guó)）山-谷氨酷胺化-G)D-Hanks'液：和青、 鏈霉素、F*henazinemethosulfate(P]VB) (SIGMA,美國(guó)）；CpGODN1826:美國(guó)Invitrogen 公司；ImjectAlum(ThermC)Scientifi