c,美國）；抗hMPV單克隆抗體clone507khemicon， 美國）；CellTiter96@A如eousMTSReagentPowder(Promega，美國）；HRP-羊抗鼠 IgG、IgGUIgG2a、IgA(Santa,美國）；TMB顯色液（KPL美國）；如ickAntibody-mouse 5W(北京博奧龍）；切toTox-(M^?HomogeneousMembraneIntegrityAssay(P;romega，美 國）；F]；TC-antimouseCD4、CD8(Biolegend，美國）；Bi〇-PlexP;ro?Mouse切tokineThl/ Th2Assay度lO-RAD，美國）；無特殊病原體（SP巧級4-6周雌性BALB/c小鼠，購自中國人民 解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中屯、。TJ-hMPV-2 (A型）、TJ-hMPV-2度型）hMPV毒株為本 實驗分離、鑒定并測序分型保存；Vero-ES和P518細胞為本實驗保存。
[0054] 2.主要儀器
[00巧]C〇2細胞培養(yǎng)箱：美國ThermoSCIENTIFIC公司，型號：F0RMADIRECTHEATC02Incub過tor
[0056] 電子分析天平：德國Sartorius公司，型號：BS110S
[0057] 倒置顯微鏡：日本Olympus公司，型號：CK40
[0058] 離屯、機：德國Eppendoi^f公司，型號：5804R
[0059] 全自動酶標板分析儀：瑞:tSUNRI沈公司，型號：SUNRISE-3
[0060] 3.本發(fā)明使用的人偏肺病毒分離培養(yǎng)方法
[0061]RT-PCR檢測為hMPV陽性的呼吸道標本（如咽拭子、鼻拭子，鼻咽吸取物等），接種 于ver〇-E6細胞或LLC-MK2細胞，37它吸附Ih，棄掉接種液，加入病毒生長液（含2%胎牛 血清、0. 013%膜酶的MEM，或含終濃度2Ug/mlTPCK膜酶的MEM)，5%C0237它培養(yǎng)，每日觀 察病變，2-3d換一次病毒生長液，75%~100%細胞均出現(xiàn)病變時，收獲病毒液，RT-PCR法 鑒定培養(yǎng)物。參考文獻如下：
[0062] ]_)RegevL,HindiyehM,ShulmanLM,BarakA,LevyV，AzarR,ShalevY,Grossman Z,MendelsonE(2006)Characterizationofhumanmetapneumovirusinfectionsin Israel.JClinMicrobiol44:1484 - 1489
[0063] 2)SarasiniA,PercivalleE,民ovidaF,CampaniniG,GeniniE,Torsellini M,PaolucciS,BaldantiF,MarchiA,Grazia民evelloM,GernaG(2006)Detectionand pathogenicityofhumanmetapneumovirusrespiratoryinfectioninpediatric Italianpatientsduringawinter-springseason.JClinVirol35:59 - 68
[0064] 3)AbikoC,MizutaK,ItagakiT,KatsushimaN,ItoS,MatsuzakiY,Okamoto !,NishimuraH,AokiY,MurataT,HoshinaH,HongoS,OotaniK(2007)Outbreakofhuman metapneumovirusdetectedbyuseoftheVeroE6celllineinisolatescollectedin Yamagata,Japan,in2004and2005.JClinMicrobiol45:1912-1919
[006引 4)LiXY,QienJY,KongM,SuX，YiYP,ZouM,Zhang比Prevalenceofhuman metapneumovirusinhospitalizedchildrenwithrespiratorytractinfectionsin Tianjin,China.ArchVirol. 2009 :154(11) :1831-6.doi:10. 1007/s00705-009-0492-8. Epub2009Sep23.
[0066]實施例I :B細胞表位預(yù)測：
[0067]WhMPVA型參考株化/1/OOF蛋白（539aa，GenBank登錄號AF371337)為模板，采 用下列軟件進行預(yù)測：
[0068]l)BepiPred(ht1:p://www.cbs.化U.化/services/BepiPred/)，闊值設(shè)定為 0. 35， 〉〇. 35的位點即可能為B細胞表位；
[0069]2)ABCpred(ht1:p://www.imtech.res.in/ra曲ava/油cpred/)，闊值設(shè)定為 0. 51;
[0070] 3)8。巧'6(1化1：化：//\￥麗.；[11116油.的3.；[]1/^日曲日￥日/13。巧'6(1/)，當闊值設(shè)定為 2. 38 ；
[0071] 4化6口5化1:1口://16口3.。3.]11:〇11.6(111.切/，綜合考慮二級結(jié)構(gòu)、親水性、表面可及 性、可塑性、極性和抗原性等參數(shù)進行線性表位預(yù)測；
[0072]5)LBTOPE(ht1:p: //crdd.osdd.net/ra曲ava/lbtope/lndex.php)，可能性 >60 % 即 為可能的表位，選擇軟件判斷為高抗原性的片段，與其他方法預(yù)測片段綜合考慮，最終確定 候選表位；
[0073]6)利用blas1:p軟件化ttp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.Cgi)分別對預(yù)測 的每個B細胞表位膚進行氨基酸序列保守性分析，選擇A、B型間保守的表位，作為B細胞候 選表位，見表1。
[0074] 表1HMPVF蛋白B細胞表位預(yù)測結(jié)果
[0076] *:Y-表示經(jīng)Bcepred預(yù)測為B細胞表位。
[0077] 實施例2.T細胞表位預(yù)測
[0078] 分別WGenBank上登錄的A型參考毒株化/l/00的N、M、F、G、SH、M2-l和M2-2等 7個蛋白的氨基酸序列（GenBank登錄號：AF371337)為模板，采用下列軟件進行預(yù)測，結(jié)合 力數(shù)值〉〇. 426即為可能的CTL和化表位：
[0079] 針對小鼠M肥-I限制性的CTL表位：
[0080] 1)NetMHCpan2.Sserver(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/)；
[0081] 2)NetMHC3.4server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/)；
[0082] 針對小鼠M肥-II限制性化表位：
[0083] 3)NetMHCII2. 2server(http://genome,cbs.dtu.dk/services/NetMHCII/)：
[0084] 4)ClustalX將篩選出的CTL和化候選表位與GenBank上登錄的不同型別hMPV 進行氨基酸保守性比對，選擇A、B型間保守的表位，作為CTL和化候選表位，表2、3。
[0085] 表2HMPV小鼠CTL細胞表位
[0087] #:文獻報道的CTL表位
[008引 表3HMPV小鼠限制性化表位
[0090]SSB-Strongbinding,強結(jié)合力 [00川實施例3:
[0092]hMPV-mea核巧酸序列由Invitrogen德國公司合成，具體方法是采用化學(xué)法合成 Oligo,通過PCR拼接而成，全長hMPV-mea片段兩端加入酶切位點，將該片段與T載體連接， 轉(zhuǎn)化E.Coli宿主細胞進行大量擴增。
[0093] 實施例4AMPV-MEA表達及純化
[0094]W下為W載體祀T32a(+)質(zhì)粒為例進行表達純化。
[0095] 限制性內(nèi)切酶BamHI、HindIII雙酶切人工合成hMPV-mea(62化P)及祀T32a(+) 質(zhì)粒巧90化P)，T4DNA連接酶連接獲得祀T32a-hMPV-mea表達重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化E.coli BL21 〇)E3)宿主菌，經(jīng)含100yg/mlAmp的LB平板培養(yǎng)基篩選，選取抗性菌落培養(yǎng)后，提取 重組質(zhì)粒，酶切（圖1)、測序鑒定重組質(zhì)粒。鑒定正確菌株用Imol/LIPTG分別于30°C誘 導(dǎo)表達外源蛋白，于誘導(dǎo)后化取菌液超聲破碎后上清及沉淀分別進行SDS-PAGE(圖2)。 采用儀親和層析法進行純化，0.OlMPBS(抑7. 5)透析，化a壯ord法測定蛋白含量。重組外 源蛋白對應(yīng)核巧酸長度為1158bp，編碼氨基酸長度為385aa，預(yù)測分子量為40. 55邸，Pl為 6. 21。用抗His抗體或免疫小鼠后獲得的hMPV-MEA抗血清進行WesternBlot檢測，鑒定 表達蛋白，在45kD附近見特異條帶（圖3,圖4)，表明表達的hMPV-MEA可與抗化S抗體及 hMPV-MEA抗血清發(fā)生結(jié)合反應(yīng)。
[0096] 實施例5AMPV-MEA動物免疫
[0097] 4-6w齡SPF級雌性BALB/c小鼠分為W下S組，6只/組，如下：hMPV-MEA20yg+如 ickantibodySW/肌肉注射組（W下稱為hMPV-MEAQ組），于初次免疫后3周加強免疫一次， 劑量及免疫方式同前；hMPV-MEA20yg+Alum100y1+CpG0DN5yg腹腔注射組（W下稱為 hMPV-MEAA+C組），于0、2、4周各免疫一次，劑量及免疫方式同前；正常對照組。末次免疫后 2周采血進行蛋白抗體效價測定，免疫巧光法對特異性進行檢測，同時取脾細胞進行淋己細 胞增殖試驗、CTL細胞殺傷活性檢測，脾細胞分泌細胞因子檢測。
[009引實施例6 :間接