本發(fā)明涉及一種人抗體基因重組質粒的轉染方法。
背景技術：
：細胞轉染是真核細胞由于外源DNA或RNA摻入而獲得新遺傳標志的過程。它是基因功能研究、基因免疫的理論和技術基礎，也是研究基因表達調控、突變分析等的常規(guī)工具。同時也是基因治療、疫苗接種、藥物開發(fā)等應用的重要工具。細胞轉染常用的方法有：生物學方法(即以病毒為載體的轉染法)、化學方法(磷酸鈣共沉淀法、DEAE-葡聚糖法、陽離子脂質體法、陽離子聚合物法)、物理方法(顯微注射法、基因槍法、電穿孔法、激光照射法、聲孔效應法、磁性納米顆粒等)。病毒載體轉染效率高，但其目的基因容量小，制備復雜，成本高，不能體內反復使用；另外，其可能在體內發(fā)生基因的重組或互補，存在致癌、致畸的風險，安全性差，適用性窄。磷酸鈣法操作簡單實用，但對細胞有一定的選擇性，且重復性差，不能廣泛應用。顯微注射法需要特殊的技術，對細胞的損傷較大，不能廣泛應用。基因槍法需要特殊的設備，價格昂貴，在轉染時對細胞具有物理損傷而不能被普及應用。影響基因轉染效率的因素很多，包括轉染試劑、轉染方法、細胞種類、細胞狀態(tài)，轉染時間、質粒結構和純度、轉染試劑與DNA的比例等。理想的細胞轉染方法應該具有較好的生物降解性、穩(wěn)定性、靶向性強、有助于基因的表達并能應用于基因方面疾病的治療。針對目前轉染方法的不足，我們利用脂質體法將人抗體基因重組質粒體外瞬時轉染至HEK293細胞，為單克隆抗體藥物篩選提供研究基礎。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有轉染方法的不足，提供一種人抗體基因重組質粒的轉染方法。本發(fā)明是利用脂質體轉染方法，將Lipofectamine3000作為轉染試劑，HEK293細胞作為轉染的宿主細胞，邊傳代邊轉染，將人抗體重鏈基因重組質粒和人抗體輕鏈基因重組質粒體外瞬時共轉染至HEK293細胞，培養(yǎng)48h后，檢測細胞培養(yǎng)上清IgG分泌量，從而將人抗體基因重組質粒成功轉染至HEK293細胞。本發(fā)明所述轉染方法為：(1)人抗體基因重組質粒轉染HEK293細胞，包括步驟：(a)HEK293細胞傳代、接種：使用含10％FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HEK293細胞，待細胞密度達到80％左右，將0.25％的胰酶-EDTA消化終止后的細胞，按每孔10000個細胞接種96孔板，再補加培養(yǎng)液至190μL。同時設置不同的對照組，對照組1為只加單個重鏈的質粒組；對照組2為只加單個輕鏈的質粒組；對照組3只加轉染試劑和細胞，不加質粒；對照組4只加細胞，不加轉染試劑和質粒；(b)用opti-MEM分別稀釋質粒和轉染試劑，使得加入每孔的轉染試劑Lipofectamine3000為0.15μL，每孔的P3000為0.2μL，每孔的人抗體重鏈基因重組質粒和人抗體輕鏈基因重組質粒各為50ng；(c)按1：1的體積比例將稀釋的質粒和稀釋的轉染試劑混勻，室溫孵育5min后，將其加入到接種有細胞的孔中，37℃、5％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。(2)Elisa檢測細胞培養(yǎng)上清IgG分泌量：收集步驟(1)中的轉染后細胞培養(yǎng)上清，使用GoatAnti-HumanKappa蛋白和GoatAnti-HumanLambda蛋白包被酶標板，采用人IgG作為標準品，標準品對應的二抗為1:5000稀釋的HRP標記的GoatAnti-HumanIgG，待檢測的轉染后細胞培養(yǎng)上清對應的二抗為1:10000稀釋的Goatx-humanIgG-FcFragmentHRPConjugated，采用酶聯(lián)免疫吸附測定方法檢測轉染后細胞培養(yǎng)上清特異性，看其是否分泌IgG；具體操作如下：(A)用包被液(50μL/孔)將GoatAnti-HumanKappa蛋白和GoatAnti-HumanLambda蛋白(各100ng/孔)包被酶標板，4℃過夜。洗板機洗板5遍。洗液為含0.05％Tween的PBS；(B)用封閉液200μL/孔，37℃封閉2h，洗板5遍；(C)分別在對應孔中加入細胞培養(yǎng)上清，或者梯度稀釋的IgG標準品，同時用水和PBS作為陰性對照，50μL/孔，37℃放置1h。洗板5遍；(D)分別在對應孔中加入1:5000稀釋的HRP標記的GoatAnti-HumanIgG，以及1:10000稀釋的Goatx-humanIgG-FcFragmentHRPConjugated50μL/孔，37℃放置45min，洗板5遍；(E)加入顯色液100μL/孔，室溫避光顯色10min；(F)加入2mol/L硫酸50μL/孔，終止顯色反應，檢測OD450nm，參考波長為630nm。所述步驟(1)采用的轉染方法是HEK293細胞傳代與人抗體基因重組質粒轉染同時進行；所述抗體基因重組質粒種屬來源不僅限于人，抗體基因重組質粒種屬來源可以是任一動物。本發(fā)明的有益效果：采用脂質體轉染方法，將Lipofectamine3000作為轉染試劑，HEK293細胞作為轉染的宿主細胞，邊傳代邊轉染，將人抗體重鏈基因重組質粒和人抗體輕鏈基因重組質粒體外瞬時共轉染至HEK293細胞，培養(yǎng)48h后，檢測細胞培養(yǎng)上清IgG分泌量，從而將人抗體基因重組質粒成功轉染至HEK293細胞。本發(fā)明的優(yōu)點是：一種人抗體基因重組質粒的轉染方法操作簡便，安全，重復性好，可自然降解，低細胞毒性，快速，高效，經濟，適應性廣等優(yōu)點。附圖說明圖1為Elisa檢測標準曲線。具體實施方式1、人抗體基因重組質粒轉染HEK293細胞，包括步驟：(a)HEK293細胞傳代、接種：使用含10％FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HEK293細胞，待細胞密度達到80％左右，將0.25％的胰酶-EDTA消化終止后的細胞，按每孔10000個細胞接種96孔板，再補加培養(yǎng)液至190μL。同時設置不同的對照組，對照組1為只加單個重鏈的質粒組；對照組2為只加單個輕鏈的質粒組；對照組3只加轉染試劑和細胞，不加質粒；對照組4只加細胞，不加轉染試劑和質粒；其中表1為Elisa檢測的96孔板整體布局；(b)用opti-MEM分別稀釋質粒和轉染試劑，使得加入每孔的轉染試劑Lipofectamine3000為0.15μL，每孔的P3000為0.2μL，每孔的人抗體重鏈基因重組質粒和人抗體輕鏈基因重組質粒各為50ng；(c)按1：1的體積比例將稀釋的質粒和稀釋的轉染試劑混勻，室溫孵育5min后，將其加入到接種有細胞的孔中，在37℃及5％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。2、Elisa檢測細胞培養(yǎng)上清IgG分泌量使用酶聯(lián)免疫吸附測定方法檢測轉染效果，其中表2為Elisa檢測細胞培養(yǎng)上清IgG的OD值，表3為Elisa檢測樣品的IgG濃度。具體操作如下：(A)用包被液(50μL/孔)將GoatAnti-HumanKappa蛋白和GoatAnti-HumanLambda蛋白(各100ng/孔)包被酶標板，4℃過夜。洗板機洗板5遍。洗液為含0.05％Tween的PBS；(B)用封閉液200μL/孔，37℃封閉2h，洗板5遍；(C)分別在對應孔中加入細胞培養(yǎng)上清，或者梯度稀釋的IgG標準品，同時用水和PBS作為陰性對照，50μL/孔，37℃放置1h。洗板5遍；(D)分別在對應孔中加入1:5000稀釋的HRP標記的GoatAnti-HumanIgG，以及1:10000稀釋的Goatx-humanIgG-FcFragmentHRPConjugated50μL/孔，37℃放置45min，洗板5遍；(E)加入顯色液100μL/孔，室溫避光顯色10min；(F)加入2mol/L硫酸50μL/孔，終止顯色反應，檢測OD450nm，參考波長為630nm。表1Elisa檢測的96孔板整體布局對照組1為只加單個重鏈的質粒組；對照組2為只加單個輕鏈的質粒組；對照組3只加轉染試劑和細胞，不加質粒；對照組4只加細胞，不加轉染試劑和質粒。表2值123456789101112A1.1261.1421.1320.0650.0670.0640.0670.0660.0630.0610.0620.063B0.9761.0220.9971.0691.0861.0951.0341.0161.0171.0761.0721.081C0.7520.8980.8311.0731.0641.0681.1261.1091.1051.061.0761.066D0.6010.6220.6081.1121.1151.1181.0261.0091.0290.0630.0610.161E0.4050.3890.3951.0521.0571.0541.1021.1061.1070.0720.0690.068F0.2110.2060.2091.0631.0811.0921.0631.0791.0650.0690.0880.079G0.1430.1340.1411.0591.0621.0691.0831.0971.1010.0550.0570.056H0.1140.1060.1090.0650.0650.0620.0610.0610.0620.0640.0610.062表3當前第1頁1 2 3