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一種人抗體基因重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染方法與流程

文檔序號(hào):12577565閱讀:來(lái)源:國(guó)知局

技術(shù)特征:

1.一種人抗體基因重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染方法,其特征在于,包括如下步驟:

(1)人抗體基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,包括步驟:

(a) HEK293細(xì)胞傳代、接種:使用含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HEK293細(xì)胞,待細(xì)胞密度達(dá)到80%左右,將0.25%的胰酶-EDTA消化終止后的細(xì)胞,按每孔10000個(gè)細(xì)胞接種96孔板,再補(bǔ)加培養(yǎng)液至190μL;

同時(shí)設(shè)置不同的對(duì)照組,對(duì)照組1為只加單個(gè)重鏈的質(zhì)粒組;對(duì)照組2為只加單個(gè)輕鏈的質(zhì)粒組;對(duì)照組3只加轉(zhuǎn)染試劑和細(xì)胞,不加質(zhì)粒;對(duì)照組4只加細(xì)胞,不加轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒;

(b)用opti-MEM分別稀釋質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑,使得加入每孔的轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000為0.15μL,每孔的P3000為0.2μL,每孔的人抗體重鏈基因重組質(zhì)粒和人抗體輕鏈基因重組質(zhì)粒各為50ng;

(c) 按1:1的體積比例將稀釋的質(zhì)粒和稀釋的轉(zhuǎn)染試劑混勻,室溫孵育5min后,將其加入到接種有細(xì)胞的孔中,在37℃及5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h;

(2)Elisa檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清IgG分泌量:收集步驟(1)中的轉(zhuǎn)染后細(xì)胞培養(yǎng)上清,使用Goat Anti-Human Kappa 蛋白和Goat Anti-Human Lambda蛋白包被酶標(biāo)板,采用人IgG作為標(biāo)準(zhǔn)品,標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)的二抗為1:5000稀釋的HRP標(biāo)記的Goat Anti-Human IgG,待檢測(cè)的轉(zhuǎn)染后細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)應(yīng)的二抗為1:10000稀釋的Goat x-human IgG-Fc Fragment HRP Conjugated,采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞培養(yǎng)上清特異性,看其是否分泌IgG;

具體操作如下:

(A)用50μL/孔包被液將Goat Anti-Human Kappa 蛋白和Goat Anti-Human Lambda蛋白,各100ng/孔,包被酶標(biāo)板,4℃過(guò)夜,洗板機(jī)洗板5遍,洗液為含0.05% Tween的PBS;

(B)用封閉液200μL /孔,37℃封閉2h,洗板5遍;

(C)分別在對(duì)應(yīng)孔中加入細(xì)胞培養(yǎng)上清,或者梯度稀釋的IgG標(biāo)準(zhǔn)品,同時(shí)用水和PBS作為陰性對(duì)照,50μL/孔,37℃放置1h,洗板5遍;

(D)分別在對(duì)應(yīng)孔中加入1:5000稀釋的HRP標(biāo)記的Goat Anti-Human IgG,以及1:10000稀釋的Goat x-human IgG-Fc Fragment HRP Conjugated 50μL/孔,37℃放置45min,洗板5遍;

(E)加入顯色液100μL/孔,室溫避光顯色10min;

(F)加入2mol/L硫酸50μL/孔,終止顯色反應(yīng),檢測(cè)OD450nm,參考波長(zhǎng)為630nm。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人抗體基因重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染方法,其特征在于:所述步驟(1)采用的轉(zhuǎn)染方法是HEK293細(xì)胞傳代與人抗體基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染同時(shí)進(jìn)行。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人抗體基因重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染方法,其特征在于:所述抗體基因重組質(zhì)粒種屬來(lái)源是人或任一動(dòng)物。

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