本發(fā)明涉及基因
技術領域：
，尤其涉及一種基于CRISPR-Cas9的基因調控裝置及基因調控方法。
背景技術：
：真核細胞具有復雜的生物學行為，如增殖、凋亡、遷移和分化，這些均被細胞信號通路和遺傳網(wǎng)絡所密切調控。而細胞信號通路改造的關鍵節(jié)點在于建立特異性輸入信號與輸出信號的密切聯(lián)系。合成生物學家為了更好地理解不同信號通路實現(xiàn)復雜生物學反應的機制，已開始設計出各種具有新型信號通路的工程化細胞。近期已有相關研究對構建新型傳感器和信號處理系統(tǒng)做出了很好的闡述及探究，但這類信號處理系統(tǒng)并不能理想地將特異性信號的檢測與內源基因的表達建立聯(lián)系。因此，通過目前的技術手段改造細胞原有網(wǎng)絡的拓撲結構仍然是一項重要挑戰(zhàn)。CRISPR-Cas系統(tǒng)由規(guī)律性重復短回文序列簇(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats,CRISPR)及CRISPR相關蛋白(CRISPR-associatedprotein,Cas)組成，而CRISPR-Cas9技術源自于細菌Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)。備受矚目的CRISPR-Cas9是一種新興的以RNA介導的基因組編輯及修飾技術，通過向導RNA(singleguideRNA,sgRNA)導向DNA識別、編輯及修飾。最近，相關研究證實在大腸埃希氏大腸桿菌和人類細胞中重組的CRISPR-Cas9系統(tǒng)可以作為一種基因組調節(jié)工具。在這些文獻中，通過將效應器與失活核酸內切酶Cas9(endonuclease-deficientCas9)融合，達到基因轉錄抑制和激活。研究人員還設計出在藍光照射下的條件下，激活內源性基因轉錄的光誘導CRISPR-Cas9系統(tǒng)。因為sgRNA設計的便利，CRISPR-Cas9系統(tǒng)必會被在基礎生物學、合成生物學等多個領域廣泛利用。然而，受限于復雜多樣的生物學信號，CRISPR-Cas9技術未能理想地改造內源性基因網(wǎng)絡。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明提供一種基于CRISPR-Cas9的基因調控裝置及基因調控方法。根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供一種基于CRISPR-Cas9的基因調控裝置，該基因調控裝置包括一核苷酸序列，該核苷酸序列本身是一sgRNA或者經(jīng)轉錄成為一sgRNA，該sgRNA在結構上包括兩個部分：與失活Cas9蛋白結合的第一部分和連接在上述第一部分的3’端的第二部分，其中上述第一部分的5’端有一段反義序列，上述第二部分是適體序列部分，其包括配體結合部分和適體莖部；當不存在配體時，上述反義序列與上述適體莖部配對結合；當存在配體時，上述反義序列與上述適體莖部解離以與目標DNA配對結合。進一步地，上述sgRNA相對應的DNA序列如SEQIDNO:17～50中的任一序列所示。進一步地，上述配體是外源性配體或內源性配體。進一步地，上述外源性配體是茶堿或四環(huán)素，上述內源性配體是噬菌體衣殼蛋白MS2。進一步地，上述適體是茶堿適體、四環(huán)素適體或噬菌體衣殼蛋白MS2適體。進一步地，上述基因調控裝置還包括一蛋白，上述蛋白至少包括失活Cas9蛋白部分，任選地包括與上述Cas9蛋白部分融合的轉錄激活因子。進一步地，上述轉錄激活因子是VP64蛋白。進一步地，上述蛋白是dCas9-VP64融合蛋白和/或dCas9蛋白。進一步地，上述基因調控裝置還包括一配體，上述配體與上述配體結合部分結合。根據(jù)本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提供一種基于CRISPR-Cas9的基因調控方法，該基因調控方法采用第一方面的基因調控裝置，上述方法包括將上述基因調控裝置導入細胞中，并在失活Cas9蛋白和配體分子的存在下，調控目標DNA的表達。本發(fā)明的有益效果是：創(chuàng)造性地通過將結合特異生物信號的RNA核糖開關——適體序列部分整合到sgRNA，建立細胞信號強度與基因表達強度的“橋梁”，上述的重組CRISPR-Cas9系統(tǒng)能夠在識別任何生物信號的基礎上，激活或者沉默任何一個目標基因，在信號配體與細胞基因之間建立人工聯(lián)系。附圖說明圖1是一種實施方式的基因表達調控方法的工作原理示意圖，包括重組sgRNA沉默靶基因(a)或激活靶基因(b)的概述，sgRNA在結構上包括兩個部分：與失活Cas9蛋白(dCas9)結合的第一部分(M)和連接在第一部分(M)的3’端的第二部分(N)，其中第一部分(M)的5’端有一段反義序列(M1)，第二部分(N)是適體序列部分，其包括配體結合部分(N1)和適體莖部(N2)。在沒有信號A(或B)的情況下，即不存在配體時，sgRNA的反義序列(M1)與適體莖部(N2)配對結合，這時sgRNA處于“關閉”狀態(tài)；在具有信號A(或B)的情況下，即存在配體時，重組sgRNA結構改變，狀態(tài)“打開”，此時，sgRNA的反義序列(M1)與其目標DNA配對結合，通過dCas9-VP64融合蛋白或dCas9蛋白激活或沉默B(或A)信號的輸出生產(chǎn)。圖2是顯示外源性配體調節(jié)性轉錄激活與沉默的實驗結果圖，VEGF的mRNA相對表達水平采用qRT-PCR方法檢測，VEGF蛋白水平測定采用ELISA方法測定。在HEK293細胞中當四環(huán)素(a和b)/茶堿(c和d)存在時依賴dCas9/dCas9-VP64的作用，VEGFmRNA和蛋白水的表達水平被降低/升高，該圖根據(jù)三次獨立實驗結果，值取平均值加減標準差。圖3是顯示內源性配體調節(jié)性轉錄激活與沉默的實驗結果圖，MALAT1和UCA1的mRNA相對表達水平采用qRT-PCR方法檢測。在HEK293細胞中當MS2蛋白質存在時依賴dCas9/dCas9-VP64的作用，MALAT1(a和b)和UCA1(c和d)的mRNA相對表達水平被降低/升高，該圖根據(jù)三次獨立實驗結果，值取平均值加減標準差。圖4是顯示由重組CRISPR-Cas9所建立的β-catenin信號通路與NF-kB信號通路的人工聯(lián)系的結果圖，(a)重組輸入信號與輸出信號的聯(lián)系有助于建立新表型；(b)β-catenin信號轉導通路與NF-kB信號通路之間建立了人工聯(lián)系；(c)β-catenin/NF-kB信號通路下游基因的mRNA相對表達水平采用qRT-PCR方法檢測，通過檢測DPAGT1和APCDD1的mRNA相對水平體現(xiàn)LTD4的刺激作用；通過檢測BFL1和MET的mRNA相對水平體現(xiàn)LTD4在轉染CRISPR-Cas9后的刺激作用；(d)β-catenin/NF-kB信號通路下游基因的mRNA相對表達水平采用qRT-PCR方法檢測。通過檢測BFL1和MET的mRNA相對水平體現(xiàn)TNF-a的刺激作用，通過檢測DPAGT1和APCDD1的mRNA相對水平體現(xiàn)TNF-a在轉染CRISPR-Cas9后的刺激作用；該圖根據(jù)三次獨立實驗結果，值取平均值加減標準差。具體實施方式下面通過具體實施方式結合附圖對本發(fā)明作進一步詳細說明。圖1示出了一種實施方式的基因表達調控方法的工作原理示意圖，包括重組sgRNA沉默靶基因(a)或激活靶基因(b)的概述，sgRNA在結構上包括兩個部分：與失活Cas9蛋白(dCas9)結合的第一部分(M)和連接在第一部分(M)的3’端的第二部分(N)，其中第一部分(M)的5’端有一段反義序列(M1)，第二部分(N)是適體序列部分，其包括配體結合部分(N1)和適體莖部(N2)。在沒有信號A(或B)的情況下，即不存在配體時，sgRNA的反義序列(M1)與適體莖部(N2)配對結合，這時sgRNA處于“關閉”狀態(tài)；在具有信號A(或B)的情況下，即存在配體時，重組sgRNA結構改變，狀態(tài)“打開”，此時，sgRNA的反義序列(M1)與其目標DNA配對結合，通過dCas9-VP64融合蛋白或dCas9蛋白激活或沉默B(或A)信號的輸出生產(chǎn)。在本發(fā)明中，配體可以是外源性配體或內源性配體。其中，外源性配體例如茶堿或四環(huán)素，內源性配體例如噬菌體衣殼蛋白MS2。相應地，適體可以是茶堿適體、四環(huán)素適體或噬菌體衣殼蛋白MS2適體。需要說明的是，本發(fā)明所謂的“基因調控裝置”，至少包括一核苷酸序列，該核苷酸序列本身是一sgRNA或者經(jīng)轉錄成為一sgRNA，該sgRNA在結構上具有上述描述的特點。也就是說，在一些情況下，本發(fā)明的基因調控裝置本身就是sgRNA，其是在CRISPR-Cas9系統(tǒng)的sgRNA的基礎上，經(jīng)改造得到的序列結構，這種sgRNA通過一定的基因轉導策略(包括但不限于電轉)導入細胞內，在dCas9蛋白或者與dCas9蛋白融合的融合蛋白(例如dCas9-VP64)以及相應的外源性配體或內源性配體的存在下，即可激活或沉默相應的目標基因表達。在另一些情況下，本發(fā)明的基因調控裝置是通過轉錄可以得到具有上述結構特點的sgRNA的核苷酸序列，該核苷酸序列可以表現(xiàn)為重組質粒，該重組質粒轉入細胞內，能夠轉錄出具有上述結構特點的sgRNA，從而在dCas9蛋白或者與dCas9蛋白融合的融合蛋白(例如dCas9-VP64)以及相應的外源性配體或內源性配體的存在下，可激活或沉默相應的目標基因表達。需要特別強調的是，本發(fā)明的基因調控裝置只要具有上述描述的結構特征即可，對其具體序列并不做限制，也就是說任何一核苷酸序列，只要其是一具有上述結構特征的sgRNA或者經(jīng)轉錄成為一具有上述結構特征的sgRNA，即可稱為本發(fā)明的基因調控裝置。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，基因調控裝置還包括一蛋白，該蛋白至少包括失活Cas9蛋白部分，任選地包括與Cas9蛋白部分融合的轉錄激活因子(例如VP64蛋白)。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，基因調控裝置還包括一配體，該配體與sgRNA的配體結合部分結合。以下通過實施例詳細說明本發(fā)明的技術方案和技術效果。應當理解，實施例僅是示例性的，不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限制。I.技術與方法1.基因調控元件的構建通過分別轉染質粒pcDNA-dCas9-HA(Plasmid#61355,Addgene)和質粒M-SPn-VP64(Plasmid#48674,Addgene)，令HEK293T細胞瞬時表達失活Cas9蛋白或Cas9-VP64融合蛋白。sgRNA質粒的構建過程：設計相關cDNA，合成后插入到質粒pGPU6/GFP/Neo的BamHI/BbsI位點。pcDNA3-MS2的構建過程：將MS2基因的cDNA序列插入到質粒pcDNA3的BamHI/EcoRI。2.細胞培養(yǎng)和轉染T24(膀胱癌細胞)，HEK293T(人胚腎臟細胞)購自美國模式培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection，ATCC，Manassas，USA)。細胞系用10％的胎牛血清(Invitrogen)和1％的雙抗的DMEM培養(yǎng)基(Invitrogen,CA)培養(yǎng)，貼壁生長，37℃和5％CO2條件下培養(yǎng)，0.05％胰酶消化傳代。對于瞬時轉染實驗，根據(jù)Lipofectamine2000說明書，當細胞密度達到70-80％后，使用Lipofectamin2000試劑及質粒的混合液處理細胞。3.RNA提取和實時定量PCR總RNA提取按照TRIzolRNA提取試劑(Invitrogen,GrandIsland,NY,USA)操作說明進行，Nanodrop測定總RNA的含量和濃度。總RNA按照RevertAidTMFirstStrandcDNASynthesisKit(Fermentas,Hanover,MD)逆轉錄試劑盒操作說明逆轉錄成cDNA。實時定量PCR按照All-in-OneTMqPCRMix試劑(GeneCopoieaInc,Rockville,MD)操作說明利用ABIPRISM7000熒光定量PCR系統(tǒng)(AppliedBiosystems,FosterCity,CA,USA)執(zhí)行。PCR循環(huán)參數(shù)如以下所示：95℃保持15分鐘,接著40個循環(huán)：94℃保持15秒，55℃保持30秒和72℃保持30秒。每次試驗至少重復三次。內參對照基因為GAPDH基因，所有數(shù)據(jù)均參照GPADH的表達作歸一化處理。PCR用到的引物序列如表1所示。表1.實時熒光定量qPCR所用的引物名稱序列VEGF-FACAGACACCGCTCCTAGCCC(SEQIDNO:1)VEGF-RCGAGAACAGCCCAGAAGTTGG(SEQIDNO:2)MALAT1-FAAAGCAAGGTCTCCCCACAAG(SEQIDNO:3)MALAT1-RGGTCTGTGCTAGATCAAAAGGCA(SEQIDNO:4)UCA1-FACGCTAACTGGCACCTTGTT(SEQIDNO:5)UCA1-RTGGGGATTACTGGGGTAGGG(SEQIDNO:6)APCDD1-FGGATCATCTATCGGTCAGACG(SEQIDNO:7)APCDD1-RTGGGTCACATCCTGCTGGATG(SEQIDNO:8)MET-FGCAGAAACCCCCATCCAGAATGTC(SEQIDNO:9)MET-RGGCCCCTGGTTTACTGACATACGC(SEQIDNO:10)DPAGT1-FCAATGCCATCAATATCCTA(SEQIDNO:11)DPAGT1-RAATCACCTTCCAACTCTA(SEQIDNO:12)BFL1-FATAACACAGGAGAATGGAT(SEQIDNO:13)BFL1-RAGTATTGCTTCAGGAGAG(SEQIDNO:14)GAPDH-FCGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC(SEQIDNO:15)GAPDH-RATCCGTTGACTCCGACCTTCAC(SEQIDNO:16)4.酶聯(lián)免疫吸附測定VEGF蛋白濃度VEGF蛋白濃度測定按照酶聯(lián)免疫吸附測定操作說明進行。簡單而言，收集并裂解106個樣本細胞，離心后收集細胞上的清液。酶標儀(Bio-Rad,Hercules,CA)通過檢測比色反應和光密度(OD值)定量VEGF蛋白。然后OD值被轉換為通過標準曲線的蛋白濃度。每次實驗進行至少三次。II.實驗結果1.信號轉換基因調控質粒的構建發(fā)明人基于CRISPR-Cas9及其衍生技術和核酸開關構建一個建立外源性配體與內源性基因人工聯(lián)系的基因調控裝置(如圖1所示)，該裝置整合了核酸開關(是指適體序列部分)和sgRNA，接受特異外源信號后，可通過dCas9和dCas9-VP64融合蛋白沉默或激活靶基因。當特異性信號A(或B)結合適體分子結構后可誘導sgRNA的反義鏈結構改變，使其可以與其對應的DNA序列靶向結合后干擾轉錄，最終引起另一信號B(或A)的改變。當缺乏特異性信號時，因sgRNA反義鏈被適體的反義鏈的莖部結合，對靶基因的轉錄不具有影響。這種方法將現(xiàn)有sgRNA改變?yōu)槟軌驅⑿盘栞斎肱c異種信號輸出聯(lián)系在一起的RNA元件。2.外源性配體可調節(jié)性轉錄激活與沉默為了進一步在人HEK293T細胞中驗證這種調控方法，選擇內源性VEGF基因作為靶基因。設計了四個靶向VEGF的sgRNA，同時在每個sgRNA的3'端插入修飾后的四環(huán)素適體(適配體)。四環(huán)素適體反義鏈的莖部按前述修飾后可與sgRNA的反義鏈結構域互補配對。qRT-PCR和ELISA的結果表明，只有在四環(huán)素存在的條件下，dCas9和重組sgRNA復合體才具有有效的沉默效果(如圖2a所示)。當在HEK239T細胞內表達dCas9-VP64融合蛋白時，sgRNA同樣能夠在四環(huán)素刺激下激活基因表達。加入四環(huán)素后，所設計的四個sgRNA分別跟dCas9-VP64共同表達后均可顯著提高VEGFAmRNA和蛋白表達水平(如圖2b所示)。為了進一步驗證這種模塊化設計方法的有效性，通過用茶堿適體代替四環(huán)素適體來改造sgRNA。而改造后的sgRNA的莖部與先前設計的序列保持一致。當茶堿適體sgRNA與dCas9或dCas9-VP64共同表達時，且在茶堿刺激下得到與上述類似的效應(如圖2c和2d所示)。圖2中，VEGF的mRNA相對表達水平采用qRT-PCR方法檢測，VEGF蛋白水平測定采用ELISA方法測定。在HEK293T細胞中當四環(huán)素(圖a和圖b)/茶堿(圖c和圖d)存在時，依賴dCas9/dCas9-VP64的作用，VEGFmRNA和蛋白的表達水平被降低/升高。根據(jù)三次獨立實驗結果，值取平均值加減標準差。圖a中，左圖的縱坐標表示VEGFmRNA相對表達水平，坐標值由下至上分別是0.0、0.2、0.4～1.2；右圖的縱坐標表示VEGA蛋白水平，坐標值由下至上分別是0、100、200～600，單位是pg/ml；空白柱表示Tetracycline(-)，即沒有四環(huán)素刺激；實心柱表示Tetracycline(+)，即有四環(huán)素刺激；對于橫坐標，從左至右分別是dCas9、dCas9+sgRNA1、dCas9+sgRNA2、dCas9+sgRNA3和dCas9+sgRNA4。圖b中和圖a的區(qū)別是，左圖的縱坐標值由下到上是0、1、2～10，右圖的縱坐標值由下至上是0、500、1000～2500，橫坐標上，從左至右分別是dCas9-VP64、dCas9-VP64+sgRNA5、dCas9-VP64+sgRNA6、dCas9-VP64+sgRNA7和dCas9-VP64+sgRNA8。圖c和圖a的主要區(qū)別是橫坐標分別是dCas9、dCas9+sgRNA9、dCas9+sgRNA10、dCas9+sgRNA11和dCas9+sgRNA12。圖d和圖b的主要區(qū)別是橫坐標分別是dCas9-VP64、dCas9-VP64+sgRNA13、dCas9-VP64+sgRNA14、dCas9-VP64+sgRNA15和dCas9-VP64+sgRNA16。sgRNA1～16的DNA序列分別如表2中的SEQIDNO:17～32所示。3.內源性配體調節(jié)性轉錄激活與沉默。為了進一步驗證重組CRISPR-Cas9系統(tǒng)能否對內源性蛋白進行應答并調節(jié)相關基因表達，將噬菌體衣殼蛋白MS2適體整合到sgRNA的相應結構上并測試其相應的效應。選擇長鏈非編碼RNAMALAT1和UCA1作為靶基因。在HEK293T細胞測試中，表達MS2和重組CRISPR-Cas9系統(tǒng)與不表達MS2或不表達sgRNA的系統(tǒng)對比，MALAT1的表達具有差異性。其中表達dCas9可誘導沉默MALAT1表達(如圖3a所示)，而表達dCas9-VP64可誘導激活MALAT1表達(如圖3b所示)。當靶基因改為UCA1時，通過重組CRISPR-Cas9系統(tǒng)取得了同樣的效果(如圖3c和3d所示)。以上數(shù)據(jù)提示通過重組CRISPR-Cas9系統(tǒng)可建立出內源性蛋白與基因表達之間的人工聯(lián)系。圖3中，sgRNA17～32的DNA序列分別如表2中的SEQIDNO:33～48所示。4.β-catenin信號通路與NF-kB信號通路的人工聯(lián)系按以往經(jīng)驗，合成生物學家為了在細胞創(chuàng)造出新功能，常設計出可替代的基因網(wǎng)絡。由于以上的實驗結果均提示重組CRISPR-Cas9系統(tǒng)能夠有效地在兩個特異性信號建立全新的聯(lián)系，因此發(fā)明人便嘗試重塑細胞經(jīng)典信號網(wǎng)絡的拓撲結構(如圖4a所示)。通過這種方法，在β-catenin信號通路和NF-kB信號通路之間建立兩種類型的人工聯(lián)系。在這次設計中，β-catenin信號的激活可以激活NF-kB信號通路，而NF-kB信號被激活時可抑制β-catenin信號通路(如圖4b所示)。將β-catenin或NF-kB適體與sgRNA結合來識別NF-kB(p65)或β-catenin(CTNNB1)，并在膀胱癌細胞系T24中表達dCas9或dCas9-VP64。結果表明當在細胞中加入β-catenin激活劑LTD4時，β-catenin的下游基因(DPAGT1和APCDD1)表達水平提高。與陰性對照相比，僅在重組CRISPR-Cas9作用下LTD4可以明顯提高NF-kB的下游基因(BFL1和MET)的mRNA表達水平(如圖4c所示)。通過檢測BFL1和MET的表達水平來檢測TNF-a對NF-kB信號通路的刺激作用。在實驗組和對照組中，在TNF-a刺激下以上兩個基因表對均明顯提高。與此同時，僅dCas9實驗組中DPAGT1和APCDD1mRNA表達水平測明顯下調(如圖4d所示)。以上結果均證實該基因調控模式可以有效地重新改編細胞內源性的信號網(wǎng)絡。圖4中，sgRNA33～34的DNA序列分別如表2中的SEQIDNO:49～50所示。圖4由重組CRISPR-Cas9所建立的β-catenin信號通路與NF-kB信號通路的人工聯(lián)系。(a)重組輸入信號與輸出信號的聯(lián)系有助于建立新表型。(b)β-catenin信號轉導通路與NF-kB信號通路之間建立了人工聯(lián)系。(c)β-catenin/NF-kB信號通路下游基因的mRNA相對表達水平采用qRT-PCR方法檢測。通過檢測DPAGT1和APCDD1的mRNA相對水平體現(xiàn)LTD4的刺激作用。通過檢測BFL1和MET的mRNA相對水平體現(xiàn)LTD4在轉染CRISPR-Cas9后的刺激作用。(d)β-catenin/NF-kB信號通路下游基因的mRNA相對表達水平采用qRT-PCR方法檢測。通過檢測BFL1和MET的mRNA相對水平體現(xiàn)TNF-a的刺激作用。通過檢測DPAGT1和APCDD1的mRNA相對水平體現(xiàn)TNF-a在轉染CRISPR-Cas9后的刺激作用。根據(jù)三次獨立實驗結果，值取平均值加減標準差。表2sgRNAs對應的DNA序列注：本發(fā)明中，sgRNA對應的DNA序列以表2所記載的內容為準。5.結論在本次研究中，結果證實重組CRISPR-Cas9系統(tǒng)可創(chuàng)造出對自設信號進行特異性應答的細胞。通過這種方法將更好地理解自然基因網(wǎng)絡的設計原則。受益于細胞信號編輯技術的進步，各種強大的應用將會呈現(xiàn)在基礎生物學和應用生物學領域中。以上內容是結合具體的實施方式對本發(fā)明所作的進一步詳細說明，不能認定本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換。當前第1頁1 2 3