專利名稱：Nr2b重組腺病毒疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物制劑，具體涉及一種攜帶有NR2B抗原 基因的NR2B重組腺病毒疫苗。技術(shù)背景神經(jīng)病理性疼痛是神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性損傷或功能異常所 導致的痛覺異?；蛲从X過敏。創(chuàng)傷、缺血性損傷、感染或炎癥、腫瘤、 藥物和壓迫等原因均可以引起神經(jīng)病理性疼痛。非甾體類抗炎藥和阿 片類鎮(zhèn)痛藥治療神經(jīng)病理性疼痛的效果差，臨床上常使用三環(huán)類抗抑 郁藥和抗癲癇藥物進行治療，但療效差，副作用大，能夠有效緩解50 %以上疼痛癥狀的患者不足50%。因此尋找一種安全有效、作用持久 的鎮(zhèn)痛方法已成為神經(jīng)病理性疼痛研究的重要方向。神經(jīng)病理性痛的受體機制研究表明，神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞膜上 的N-甲基一D—天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate rec印tor， 麗DAR)表達上調(diào)或過度激活可引起中樞敏感化，在神經(jīng)病理性痛的 產(chǎn)生如自發(fā)性痛、觸誘發(fā)痛及痛覺過敏等起重要作用。NMDA受體拮抗 劑如氯胺酮、MK-801等對神經(jīng)病理性痛具有良好的鎮(zhèn)痛作用，但由于 這些藥物具有如認知功能障礙、神經(jīng)空泡樣改變等副作用限制了它們 的臨床廣泛應用。近期研究表明，麗DA受體亞型——NR2B型麗DA受體 (NR2B)在體內(nèi)呈選擇性分布，主要集中于脊髓背角、前腦等與痛傳 遞和痛情緒有關(guān)的區(qū)域，與痛感覺和痛情緒的形成密切相關(guān)，這提示 NR2B可能是一個潛在的鎮(zhèn)痛治療的靶點。據(jù)此，以NR2B為抗原制備疫 苗誘導機體產(chǎn)生NR2B抗體，該抗體與神經(jīng)元或膠質(zhì)細胞膜上的NR2B結(jié)合，下調(diào)NR2B的表達或阻斷NR2B的激活，可能發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。現(xiàn)在疫苗技術(shù)的發(fā)展提供了一種新的免疫方法一一基因疫苗。基 因疫苗作為第三代疫苗，構(gòu)建和改造相對方便，抗原性強，且保護時 間長。重組腺病毒載體是目前最常用的基因疫苗載體之一，具有感染 滴度高、熱穩(wěn)定性好、基因容量大、可以口服、能產(chǎn)生粘膜免疫等諸 多優(yōu)點。因此，構(gòu)建NR2B重組腺病毒(Recombinant adenovirus serotype 5 encoding NR2B gene， rAd5/NR2B)鎮(zhèn)痛疫苗，并通過口 服免疫，可能對神經(jīng)病理性痛痛感覺和痛情緒產(chǎn)生抑制作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決上述背景技術(shù)存在的不足， 提出一種攜帶有NR2B抗原基因的NR2B重組腺病毒疫苗，使其為神經(jīng)病 理性痛的治療開辟了新途徑。本發(fā)明所述NR2B重組腺病毒疫苗是通過將服2B基因插入腺病毒 載體構(gòu)建的，其保藏號為CCTCC NO: V200713,保藏單位中 國武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期2007年11月23日， 分類命名；腺病毒血清5型(C12N15/861) Adenovirus V type。 所述NR2B基因插入腺病毒載體的方法是1) 分別取NR2B基因質(zhì)粒和腺病毒穿梭pDC515，以EcoR I和BamHI雙酶切后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，再利用低熔點瓊脂糖挖塊法 純化回收目的基因片段NR2B和載體片段pDC515，在T4DNA連接酶作用 下獲得質(zhì)粒pDC515-NR2B;2) 以攜帶NR2B基因的腺病毒穿梭質(zhì)粒p515-NR2B和腺病毒骨架 質(zhì)粒pBHGfrt(del)El, 3FLP共轉(zhuǎn)染腺病毒包裝細胞293，獲得NR2B重組腺病毒；3)通過上述293細胞大量擴增重組腺病毒，并采用氯化銫溴化 乙錠平衡密度梯度離心純化法，得到大量高滴度高純度的NR2B重組腺 病毒疫苗。 '本發(fā)明所述NR2B重組腺病毒疫苗的特征疫苗名稱NR2B重組腺病毒疫苗(Recombinant adenovirus serotype 5 encoding NR2B gene, rAd5/NR2B vaccine)病毒種名(Species):雙鏈DNA病毒(一種復制缺陷、非輔助病 毒依賴型載體)血清型Ad5分子生物學特性腺病毒顆粒是二十面體的無包膜雙鏈DNA病毒， 直徑為70-90um，基因組大小為36kb。該疫苗是復制缺陷型重組腺病 毒，無致瘤性。rAd5/NR2B經(jīng)擴增和純化后的滴度及純度rAd5/服2B經(jīng)大量擴增 及純化后滴度達到5X10"(V.P./ml)，純度(HPLC法測定)達到IOO/o 。將NR2B基因插入腺病毒載體，成功構(gòu)建NR2B重組腺病毒疫苗 rAd5/NR2B。該疫苗口服免疫可誘導機體產(chǎn)生高滴度的NR2B抗體，其 滴度和持續(xù)時間優(yōu)于多肽疫苗。rAd5/NR2B疫苗口服免疫不但對神經(jīng) 病理性痛痛感覺產(chǎn)生超前鎮(zhèn)痛作用，而且對神經(jīng)病理性痛伴隨的痛情 緒反應也有抑制作用。本發(fā)明用途及意義.直接用途通過口服免疫對大鼠神經(jīng)病理性痛具有鎮(zhèn)痛作用。 間接用途可作為一種載體用于NR2B基因相關(guān)機制的研究。 本發(fā)明對基因疫苗治療神經(jīng)病理性痛具有重要的參考價值。


圖l是rAd5/NR2B感染293細胞后出現(xiàn)的病毒空斑(標尺100um)。 圖2是rAd5/NR2B的PCR鑒定。其中，M . DL2000Marker ; 1. rAd5/NR2B原液；2. rAd5/NR2B稀釋10倍；3. rAd5/NR2B稀釋100 倍；4. rAd5/NR2B稀釋1000倍；5.陽性對照pDC515-NR2B質(zhì)粒；6.陰性對照。圖3是rAd5/NR2B的RT-PCR鑒定。其中，M. 100bpMarker; 1.未 感染rAd5-NR2B的293細胞；2.感染rAd5-NR2B的293細胞。圖4是rAd5/NR2B的ImmunobloUing鑒定。其中，1.感染rAd5/NR2B 的293細胞；2.未感染rAd5/NR2B的293細胞。圖5是免疫后10周內(nèi)各組大鼠血清NR2B抗體滴度的改變。圖6是各組大鼠機械觸誘發(fā)痛的比較。與術(shù)前比較，#代0.05; 與naive組和rAd5/EGFP組相比，*代O. 05圖7是各組大鼠各時間點熱痛縮爪時間變化的比較。與術(shù)前比較， #P〈0. 05;與na'ive組和rAd5/EGFP組相比，*P〈0. 05。圖8是各組免疫大鼠SNI條件性位置回避時間的比較。與na'ive 和rAd5/EGFP組比較，*尸<0. 05。 具體實施步驟一、NR2B重組腺病毒(rAd5/NR2B)的構(gòu)建1. rAd5/NR2B的包裝分別取質(zhì)粒pcDNA3. l-NR2B (由浙江大學神經(jīng)生物研究所羅建紅 教授惠增)和腺病毒穿梭pDC515,以EcoRI禾卩BamHI雙酶切后經(jīng)lX 瓊脂糖凝膠電泳分離，再利用低熔點瓊脂糖挖塊法純化回收目的基因 片段NR2B和載體片段pDC515，在T4DNA連接酶作用下獲得質(zhì)粒 pDC515-NR2B，并行酶切、電泳及DNA測序鑒定，證實穿梭質(zhì)粒 pDC515-NR2B構(gòu)建成功；在脂質(zhì)體介導下將pDC515-NR2B轉(zhuǎn)染293細胞，并通過RT-PCR及 Western blotting方法分別從轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平檢測到目的基因 NR2B在包裝細胞293中能夠有效表達；以攜帶NR2B基因的腺病毒穿梭質(zhì)粒p515-NR2B和腺病毒骨架質(zhì)粒 pBHGfrt(del)El， 3FLP共轉(zhuǎn)染腺病毒包裝細胞293， 12天后可見293細 胞變圓并逐漸從壁上脫落，細胞核占據(jù)細胞大部分，形成所謂的細胞 病理效應(CPE) ， 15天后較多出現(xiàn)CPE的細胞聚集在一起形成肉眼可 見的病毒空斑(圖l),表明rAd5/NR2B包裝成功。2. rAd5/NR2B的鑒定病毒空斑出現(xiàn)后，挑取病毒空斑再感染293細胞提取病毒DNA、RNA 及蛋白，分別以PCR、 RT-PCR及western blotting從基因水平、轉(zhuǎn)錄 水平和蛋白水平對病毒空斑進行鑒定和篩選①分別以rAd5/NR2B原液、10倍、100倍，1000倍稀釋液的PCR 產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示600bp處均可見到特異性DNA 條帶，與陽性對照pDC515-NR2B的結(jié)果相同，而陰性對照(未用病毒感染的293細胞上清)未見到相應條帶(圖2),證明重組腺病毒中含有NR2B目的基因。② 以被rAd5/NR2B感染的293細胞的RNA行RT- PCR反應，可擴 增出600bp大小的DNA條帶，而未感染病毒rAd5/NR2B的293細胞未 擴增出相應條帶(圖3)，表明重組腺病毒中NR2B基因在轉(zhuǎn)錄水平表達正常。③ 提取rAd5/NR2B感染293細胞的蛋白進行western blotting 檢測，結(jié)果顯示感染病毒rAd5/NR2B的293細胞有180kDa的蛋白條 帶，而未感染該病毒的293細胞無此蛋白條帶(圖4)，證明重組腺 病毒中NR2B基因能夠正常表達翻譯為蛋白質(zhì)。以上的結(jié)果證實我們構(gòu)建的NR2B重組腺病毒(rAd5/NR2B)不僅 結(jié)構(gòu)完整，而且在293細胞內(nèi)能夠有效表達。之后，通過293細胞大量 擴增重組腺病毒，并采用氯化銫溴化乙錠平衡密度梯度離心純化法， 得到大量高滴度高純度的rAd5/NR2B。 二、 rAd5/NR2B口服免疫對神經(jīng)病理性痛的鎮(zhèn)痛作用大鼠口服rAd5/NR2B (1X10"PFU)免疫，2周后以相同劑量加強 免疫一次。分別于免疫后2、 4、 6、 8、 10、 15周截尾法取血0. 5 1. 0ml 離心取血清檢測免疫血清NR2B抗體的滴度。結(jié)果口服rAd5/NR2B免疫 后兩周，血清NR2B抗體的滴度為5.5士1.9ug/ml， 4周后升高至13.4 ±3.2ug/ml (圖5)，并能夠持續(xù)到10周以后，提示機體對該疫苗產(chǎn) 生了較強的免疫應答。加強免疫后2周，結(jié)扎大鼠左側(cè)坐骨神經(jīng)的脛神經(jīng)和腓總神經(jīng)分支，保留腓腸神經(jīng)，建立SNI模型。術(shù)后隔日檢測大鼠術(shù)側(cè)后爪機械
痛閾和熱痛縮爪時間的改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)自SNI模型建立后7天開始至42 天，rAd5/NR2B免疫組機械觸誘發(fā)痛明顯高于空白組及rAd5/EGFP組
(圖6)，且熱痛縮爪時間明顯縮短(圖7)，提示該疫苗對神經(jīng)病理 性痛機械觸誘發(fā)痛和熱痛覺過敏具有抑制作用。進一步通過大鼠SNI 條件性位置回避實驗發(fā)現(xiàn)，疫苗rAd5/NR2B免疫對神經(jīng)病理性痛時的 痛情緒反應有抑制作用(圖8)。
以上結(jié)果證明重組腺病毒疫苗rAd5/NR2B口服免疫可誘導產(chǎn)生 高滴度的NR2B抗體，其滴度高且持續(xù)時間長；rAd5/NR2B疫苗口服 免疫不但對神經(jīng)病理性痛痛感覺產(chǎn)生超前鎮(zhèn)痛作用，而且對神經(jīng)病理 性痛伴隨的痛情緒反應也有抑制作用。
本發(fā)明采用重組腺病毒制備技術(shù)，將NR2B基因插入腺病毒重組載 體，成功構(gòu)建NR2B重組腺病毒疫苗，并從痛感覺和痛情緒兩方面觀察 了該疫苗具有鎮(zhèn)痛作用，為神經(jīng)病理性痛的治療開辟了一嶄新途徑。
使用本疫苗行免疫鎮(zhèn)痛，對神經(jīng)病理性痛不但具有預防作用，而 且具有選擇性，即未發(fā)生神經(jīng)病理性痛時，產(chǎn)生的抗體在血腦屏障的 阻礙下不會進入脊髓和ACC。但發(fā)生了神經(jīng)病理性痛后，血腦屏障通 透性增加，NR2B特異性抗體便進入神經(jīng)中樞發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。
權(quán)利要求
1、一種NR2B重組腺病毒疫苗，該疫苗是通過將NR2B基因插入腺病毒載體構(gòu)建的，其保藏號為CCTCC NOV200713。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的NR2B重組腺病毒疫苗，其特征是將 NR2B基因插入腺病毒載體，具體方法是1) 分別取NR2B基因質(zhì)粒和腺病毒穿梭pDC515，以EcoR I禾nBamH I雙酶切后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，再利用低熔點瓊脂糖挖塊法純化回收目的基因片段服2B和載體片段pDC515，在T4DNA連接酶作用 下獲得質(zhì)粒pDC515-NR2B;2) 以攜帶NR2B基因的腺病毒穿梭質(zhì)粒p515-NR2B和腺病毒骨架 質(zhì)粒pBHGfrt(del)El， 3FLP共轉(zhuǎn)染腺病毒包裝細胞293，獲得NR2B重組 腺病毒；3) 通過上述293細胞大量擴增重組腺病毒，并采用氯化銫溴化 乙錠平衡密度梯度離心純化法，得到大量高滴度高純度的NR2B重組腺病毒疫苗。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種NR2B重組腺病毒疫苗，該疫苗是通過將NR2B基因插入腺病毒載體構(gòu)建的，其保藏號為CCTCC NOV200713。本發(fā)明采用重組腺病毒制備技術(shù)，將NR2B基因插入腺病毒重組載體，成功構(gòu)建NR2B重組腺病毒疫苗，并從痛感覺和痛情緒兩方面觀察了該疫苗具有鎮(zhèn)痛作用，為神經(jīng)病理性痛的治療開辟了一嶄新途徑。
文檔編號A61P25/00GK101306198SQ20071016896
公開日2008年11月19日 申請日期2007年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月20日
發(fā)明者輝 楊, 楊少兵, 王公明, 田學愎, 田玉科, 峰 高 申請人:華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院