廣譜型抗禽流感重組乳酸菌及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及融合基因 NP-M1，一種廣譜型抗禽流感重組乳 酸菌及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 禽流感是由禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)引起的一種非常重要的傳 染病。它不僅能對(duì)養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，而且也嚴(yán)重威脅著人類的健康。目前為止， 疫苗是控制抗禽流感最為有效的手段。
[0003] 禽流感主要通過黏膜途徑感染機(jī)體，所以黏膜免疫系統(tǒng)在控制禽流感感染方面起 著關(guān)鍵性作用。另外，由于系統(tǒng)性疫苗在黏膜處不能誘導(dǎo)良好的保護(hù)性免疫反應(yīng)，與胃腸道 外接種疫苗相比，黏膜疫苗能夠產(chǎn)生有效的黏膜免疫和系統(tǒng)免疫反應(yīng)，為避免反復(fù)暴露于 特定的病原體而提供保護(hù)，防止機(jī)體造成組織損傷或過度的炎癥反應(yīng)。但最近主要集中于 發(fā)揮體液免疫疫苗的研究，而病毒發(fā)生變異時(shí)，體液免疫不能產(chǎn)生交叉保護(hù)反應(yīng)。所以靶向 保守的內(nèi)部抗原蛋白是構(gòu)建疫苗的候選抗原。原因如下，與病毒的表面蛋白相比，其保守的 內(nèi)部抗原蛋白更加不會(huì)產(chǎn)生變異，例如表面蛋白血凝素和神經(jīng)氨酸酶很容易發(fā)生變異，造 成疫苗株必須不斷更新以匹配流行株;其次，在不同的流感病毒亞型之間內(nèi)部蛋白高度保 守。禽流感病毒的核蛋白（nucleo_protein，NP)和基質(zhì)蛋白（matrix protein，Ml)是最具 典型和吸引力的內(nèi)部保守蛋白。Berthoud等的研究表明MVA表達(dá)AIV的保守內(nèi)部抗原(NP和 Ml)能產(chǎn)生交叉T細(xì)胞反應(yīng)對(duì)抗異源流感的感染。另外，臨床研究已經(jīng)證明，利用腺病毒載體 表達(dá)的AIVs NP能夠誘導(dǎo)NP特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng)，且能抵抗異源AIVs感染。
[0004] 乳酸菌(Lactobacillus)是可發(fā)酵碳水化合物生成大量乳酸的一類細(xì)菌的總稱。 由于在人或動(dòng)物體內(nèi)長(zhǎng)期定植，并且對(duì)機(jī)體產(chǎn)生益生作用，在國際上將他們認(rèn)為是食品級(jí) 安全微生物。因具有容易培養(yǎng)、操作方便、安全無毒等諸多優(yōu)勢(shì)，在基因工程疫苗領(lǐng)域乳酸 菌是一種表達(dá)異源蛋白或作為活載體遞呈抗原的重要工具。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種融合基因 NP-M1和一種重組乳酸菌。
[0006] 一種融合基因 NP-M1，其堿基序列如序列表SEQ ID N0.1所示。
[0007] 一種融合基因 NP-M1質(zhì)粒，是在表達(dá)載體pW425et上插入了融合基因 NP-M1，命名為 pff425et- NP-Mlo
[0008] 一種重組乳酸菌，是轉(zhuǎn)化了 一種融合基因 NP-M1質(zhì)粒pW425et-NP-Ml的乳酸桿菌。
[0009] 所述的乳酸桿菌為植物乳酸桿菌。
[0010] 所述的乳酸菌為L(zhǎng)b.plantarum NC8。
[0011] 廣譜型抗禽流感的重組乳酸菌的制備方法，它主要包括： (1) 人工合成其堿基序列如序列表SEQ ID N0.1所示的融合基因 NP-M1; (2) 將融合基因 NP-M1插入大腸桿菌-乳酸菌穿梭表達(dá)載體pW425et中，構(gòu)建大腸桿菌- 乳酸菌穿梭表達(dá)重組質(zhì)粒pW425et-NP-Ml; (3)將重組質(zhì)粒pW425et- NP-M1轉(zhuǎn)化至乳酸桿菌中。
[0012] 本發(fā)明另一目的是一種重組乳酸菌在制備抗禽流感藥物的應(yīng)用。
[0013] -種重組乳酸菌在制備抗禽流感藥物的應(yīng)用。
[0014] 所述的禽流感為H9N2亞型和\或!1謂1亞型。
[0015] 本發(fā)明提供了一種廣譜型抗禽流感重組乳酸菌，它是利用禽流感病毒核蛋白NP和 基質(zhì)蛋白Ml的高度保守性以及乳酸菌作為抗原遞呈載體的安全性，利用重組DNA技術(shù)構(gòu)建 了表達(dá)NP基因和Ml基因的大腸桿菌-乳酸菌穿梭重組質(zhì)粒pW425et-NP-Ml，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 至乳酸桿菌中，獲得了抗多種亞型禽流感病毒的重組乳酸桿菌，經(jīng)過大量增菌培養(yǎng)后，該重 組乳酸菌通過口服的方式進(jìn)入消化道定植后，表達(dá)的NP-M1融合蛋白在小鼠腸道被抗原遞 呈細(xì)胞識(shí)別，有效地誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性IFN-γ和slgA，有效預(yù)防不同亞型流感病毒的感 染。首次免疫連續(xù)灌胃小鼠3次，間隔2周后，加強(qiáng)免疫，連續(xù)灌服小鼠3次，間隔2周后，分別 感染不同亞型流感病毒1次，觀察保護(hù)效果。結(jié)果顯示，與禽流感滅活疫苗相比，重組乳酸桿 菌可顯著提高小鼠脾臟和淋巴結(jié)中分泌IFN- γ的T細(xì)胞數(shù)量、腸內(nèi)容物中sIgA含量。本發(fā)明 制備了廣譜型抗禽流感的重組乳酸桿菌，制備方法和生產(chǎn)工藝相對(duì)簡(jiǎn)單，使用方式為飲水 口服，便于規(guī)?；a(chǎn)和應(yīng)用，具有廣闊的應(yīng)用前景和良好的經(jīng)濟(jì)社會(huì)效益。
【附圖說明】
[0016] 圖1 PMD18-T-NP-M1酶切鑒定電泳結(jié)果； 圖2 pW425et-NP-Ml酶切鑒定電泳結(jié)果； 圖3重組乳酸桿菌表達(dá)NP-M1融合蛋白檢測(cè)結(jié)果:Western-blot結(jié)果； 圖4 ELISP0T檢測(cè)MLN中T細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ ; 圖5 ELISP0T檢測(cè)脾臟中T細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ; 圖6小鼠腸內(nèi)容物中特異性sIgA含量變化； 圖7小鼠感染H9N2亞型禽流感病毒的存活率； 圖8小鼠肺內(nèi)H9N2亞型禽流感病毒滴度； 圖9小鼠感染H1N1亞型流感病毒的存活率； 圖10小鼠肺內(nèi)H1N1亞型禽流感病毒滴度。
【具體實(shí)施方式】
[0017]實(shí)施例!融合基因 NP-M1的獲得 以Genbank公布的NP和Ml基因序列（GI:DQ681212.1和JF906209.1)為模板，根據(jù)密碼 子的簡(jiǎn)并性和乳酸菌表達(dá)蛋白對(duì)密碼子的偏愛性，優(yōu)化密碼子后送往上海捷瑞生物工程有 限公司合成，且上下游加入Ndel和Hind ΙΠ 酶切位點(diǎn)。人工合成后的融合基因 NP-M1連接在 PMD18-T載體上，即pMD18-T-NP-Ml，采用常規(guī)酶切技術(shù)，應(yīng)用限制性內(nèi)切酶Ndel和Hind ΙΠ 雙酶切PMD18-T-NP-M1，獲得了大小為2253 bp目的融合基因 NP-M1，酶切體系如下所述。其 喊基序列如序列表SEQ ID NO. 1所不。
[0018]
反應(yīng)條件:37°C水浴1 h。結(jié)束后，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示，成功獲得了融合 基因 NP-M1，如圖1所示。
[0019] 實(shí)施例2重組質(zhì)粒pW425et-NP_Ml的構(gòu)建 采用Ndel和Hind ΙΠ 限制性內(nèi)切酶分別對(duì)pMD18-T-NP-Ml和pW425et進(jìn)行雙酶切，以獲 得融合基因 NP-M1和pW425et表達(dá)載體片段;雙酶切體系和反應(yīng)條件同實(shí)施例1中所述。試劑 盒回收目的基因后，采用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接。
[0020] 連接體系如下：
反應(yīng)條件：16°C連接2h，4°C過夜;次日常規(guī)CaCl2法轉(zhuǎn)化E. col i DH5a感受態(tài)，并篩選重 組陽性菌。
[0021] 質(zhì)粒小量提取方法按照質(zhì)粒小提試劑盒說明書操作提取，對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定， 結(jié)果表明成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pW425et-NP-Ml，如圖2所示。
[0022] 實(shí)施例3廣譜型抗禽流感的重組乳酸菌的制備及表達(dá)產(chǎn)物檢測(cè) (1)乳酸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化 活化Lb.plantarum NC8菌種，將其單個(gè)菌落接種到含1 %甘氨酸的MRS液體培養(yǎng)基(不 含葡萄糖）中，30 °C條件下厭氧培養(yǎng)至OD600值為約0.6時(shí)，以2%的接種量接種到MRS液體培 養(yǎng)基中（含有1%甘氨酸），當(dāng)厭氧培養(yǎng)到0D6QQ值約為0.3時(shí)，4 °C條件下4500 r/min離心5 min收集菌體(除了離心步驟以外，制備感受態(tài)過程中Lb.plantarum NC8-直放在冰水混合 物中）。使用預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化緩沖液懸浮洗滌2次后，將Lb.plantarum NC8懸浮于適量電擊緩 沖液中，冰浴10 min，分裝。Lb.plantarum NC8的感受態(tài)即可用于電轉(zhuǎn)化。
[0023] 分別取1-2 yg的重組質(zhì)粒pW425et-NP-Ml(體積約10 yL)與已經(jīng)制備的150 μΙ^/Κ 冷的Lb.plantarum NC8受體菌細(xì)胞懸液混合，轉(zhuǎn)入已經(jīng)預(yù)冷的間距0.2 cm是電擊杯中，冰 浴10 min后用電轉(zhuǎn)儀電擊，條件為2000 V，400 Ω，25 uF。電擊結(jié)束后，將電擊杯靜止冰浴5 min。將電轉(zhuǎn)化后的混合液轉(zhuǎn)移到離心管中，隨后加入600 yL MRS液體培養(yǎng)基，在30 °C條件 下厭氧培養(yǎng)2 h。取120 yL電轉(zhuǎn)化后的菌液，涂在MRS瓊脂平板(含10 yg/mL紅霉素)上，在30 °〇條件下厭氧培養(yǎng)18 h以上，直到能觀察到單菌落為止，篩選陽性克隆子。
[0024] (2)重組乳