專利名稱：豬流行性腹瀉病毒變異株檢測(cè)用引物及其檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及豬流行性腹瀉病毒變異株檢測(cè)用引物及其檢測(cè)試劑盒。屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
豬流行性腹灣(Porcine Epidemic Diarrhea, PED)是由豬流行性腹灣病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus, PEDV)引起的一種急性、高度接觸性的傳染病,常以急性腸炎和伴有脫水的水樣腹瀉為特征，各種年齡的豬均易感。本病于1971年首先發(fā)現(xiàn)于英國，此后，歐洲和亞洲各國也報(bào)道了該病的暴發(fā)。我國在1973年分離到PEDV(經(jīng)典毒株)。2010年冬季至2011年春季全國各地豬場(chǎng)的豬群中先后發(fā)生嚴(yán)重的傳染性腹瀉疾病，發(fā)病突然，傳播較快，流行范圍廣，流行時(shí)間長(zhǎng)，應(yīng)用各種抗生素防治無效，其發(fā)病率與死亡率很高，造成重大 的經(jīng)濟(jì)損失。經(jīng)研究表明，豬流行性腹瀉病毒變異株是此次疫情的兀兇(Jianfei Chen 等 Complete Genome Sequence of a Porcine Epidemic DiarrheaVirus Variant. J. Virol, 2012, 86: 3408)。豬流行性腹灣病毒變異株(Yanjun Zhou等Complete Genome Sequence of a Virulent Porcine Epidemic Diarrhea Virus Strain.J. Virol, 2012, 86: 13862)與原來毒株 PEDV (經(jīng)典毒株)(Jianfei Chen 等 CompleteGenome Sequence of a Chinese Virulent Porcine Epidemic Diarrhea Virus Strain.J. Virol, 2012，86: 3408)的基因組同源性在97%左右，變異最大的為S基因，同源性在94%以下，且存在氨基酸發(fā)生缺失和插入的序列特征(Wentao Li等New variants ofporcine epidemic diarrhea virus, China, 2011. Emerg.1nfect. Dis, 2011, 85:11538)。此前，我國尚無PEDV變異株(命名為PEDV-V)的特異檢測(cè)技術(shù)。常規(guī)RT-PCR技術(shù)不能區(qū)分PEDV (經(jīng)典毒株)和PEDV-V (PEDV變異株)，因此不能特異地檢測(cè)PEDV變異株?，F(xiàn)如今，對(duì)豬流行性腹瀉病毒變異株的檢測(cè)只能通過基因測(cè)序來確定該病毒的感染，操作繁雜、耗時(shí)長(zhǎng)、成本較高。因此，基于以上的研究和當(dāng)前的需求，申請(qǐng)人根據(jù)豬流行性腹瀉病毒變異株S基因發(fā)生核苷酸缺失和插入的特征，設(shè)計(jì)并合成了一對(duì)檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒變異株的引物，采用RT-PCR方法擴(kuò)增S基因，通過擴(kuò)增片段的分子量大小，判斷是否存在豬流行性腹瀉病毒變異株，從而特異、敏感、省時(shí)、省力、低成本地檢測(cè)出豬流行性腹瀉病毒變異株。目前其他RT-PCR方法不能解決該問題；基因測(cè)序技術(shù)需要時(shí)間較長(zhǎng)，且費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、成本高。因此，該技術(shù)可對(duì)豬流行性腹瀉病毒變異株的診斷和監(jiān)測(cè)起到重要作用。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題
本發(fā)明目的在于提供用于PEDV變異株RT-PCR檢測(cè)的引物序列及其檢測(cè)試劑盒。
技術(shù)方案
本發(fā)明通過分析PEDV變異株的S基因序列，在S基因發(fā)生核苷酸插入和缺失的序列處設(shè)計(jì)引物。所述的引物對(duì)由正向和反向引物組成，其核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO.1和 SEQ ID NO. 2 所示。具體地，本發(fā)明提供了一種PEDV變異株檢測(cè)用引物，該引物的正向引物(PEDV-VF)序列SEQ ID NO.1和反向引物(PEDV-VR)序列SEQ ID NO. 2的核苷酸序列為
SEQ ID NO.1 :5’ -TTGGTGAAAACCAGGGTGTC-3’
SEQ ID NO. 2 :5’ -CAACACTATGTTCACTCA-3’。該引物從感染豬流行性腹瀉病毒變異株的病料提取的總RNA中擴(kuò)增出327 bp DNA片段。本發(fā)明還提供了一種用于檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒變異株的試劑盒，該試劑盒含有上述引物 SEQ ID NO.1 和 SEQ ID NO. 2。具體的，該試劑盒包括
(1)陰性對(duì)照取滅菌的DEPC水，置-20°c冰箱保存；
(2)RT反應(yīng)液
無菌 DEPC 水4. 75 μ L
10ymol/L dNTPI μ L
20 μ moI/L PEDV-VR I μ L 5X反轉(zhuǎn)錄緩沖液4yL40 U/ μ L RNA酶抑制劑 I μ L
O.1 mmol/L DTT2 μ L
200U/yL 反轉(zhuǎn)錄酶O. 25 μ L
混勻后_20°C保存；
(3)PCR反應(yīng)液
無菌 DEPC 水32. 5 μ L
20 μ mol/LPCR弓丨物混合液 2 μ L 10XPCR緩沖液5yL
2. 5 mmol/L dNTP8μ L
5U/ μ L DNA 聚合酶 O. 5 μ L 混勻后_20°C保存。所述的試劑盒，還包括陽性對(duì)照為豬流行性腹瀉病毒變異株JS-HZ2012發(fā)生腹瀉的糞便樣品。有益效果
本發(fā)明是根據(jù)豬流行性腹瀉病毒變異株S基因序列設(shè)計(jì)的引物，本發(fā)明的引物是經(jīng)過大量PEDV的S基因序列比對(duì)和篩選得到的，而且應(yīng)用該引物及本發(fā)明中的檢測(cè)試劑盒能夠快速地判斷樣品中是否含有豬流行性腹瀉病毒變異株，為豬的腹瀉病提供檢測(cè)工具。

同時(shí)，進(jìn)過大量的臨床檢測(cè)和測(cè)序分析比對(duì)，都證實(shí)本發(fā)明的檢測(cè)引物和檢測(cè)試劑盒能夠準(zhǔn)確無誤的檢測(cè)目前我國流行的豬流行性腹瀉病毒變異株，且不能檢測(cè)出豬流行性腹瀉病毒經(jīng)典毒株，能夠達(dá)到區(qū)分變異株和經(jīng)典株的目的，而以往檢測(cè)方法無法區(qū)分變異株和經(jīng)典株。本發(fā)明的引物和檢測(cè)試劑盒能夠?yàn)榕R床上檢測(cè)豬腹瀉病提供有效的工具。


圖1是豬流行性腹瀉病毒變異株(PEDV-V)的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果，其中M DL2000DNA ladder ;1、豬流行性腹瀉病毒變異株；2、豬流行性腹瀉病毒經(jīng)典毒株(PEDV);3、豬傳染性胃腸炎病毒(TGVE) ;4、豬輪狀病毒(PRV) ;5、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV) ;6、陰性對(duì)照。圖2是本發(fā)明檢測(cè)方法的靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果。其中M DL2000 DNA ladder ;1_11表示反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中加入的連續(xù)10倍稀釋的RNA模板；12、陰性對(duì)照。
具體實(shí)施例方式下面實(shí)施例用于對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例11、引物的設(shè)計(jì)和合成
根據(jù)豬流行性腹瀉病毒變異株S基因的核苷酸序列，采用Primer 5. O設(shè)計(jì)引物，經(jīng)過大量篩選得到如下序列的引物序列
正向引物(PEDV-VF)的序列為SEQ ID NO. 1，反向引物(PEDV-VR)序列為SEQ ID NO. 2，具體序列的組成如下
SEQ ID NO.1 :5’ - TTGGTGAAAACCAGGGTGTC -3’
SEQ ID NO. 2 :5’ - CAACACTATGTTCACTCA-3’。

根據(jù)上述核苷酸序列信息合成正向引物PEDV-VF和反向引物PEDV-VR。將上述引物PEDV-VF和PEDV-VR分別配置成濃度為20 μ mo I/L的溶液，備用。2、一種檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒變異株的試劑盒，按下表組裝
表I試劑盒組成
權(quán)利要求
1.豬流行性腹瀉病毒變異株檢測(cè)用的引物，包括正向引物 PEDV-VF (SEQ ID NO.1) :5’ -TTGGTGAAAACCAGGGTGTC-3’ 和反向引物 PEDV-VR (SEQ ID NO. 2) 5，-CAACACTATGTTCACTCA-3，； 該引物從感染豬流行性腹瀉病毒變異株的病料提取的總RNA中擴(kuò)增出327 bp DNA片段。
2.一種用于檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒變異株的試劑盒，該試劑盒含有權(quán)利要求1所述的引物。
3.、如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，包括 (1)陰性對(duì)照取滅菌的DEPC水，置-20°C冰箱保存； (2)RT反應(yīng)液 無菌 DEPC 水4. 75 μ L 10ymol/L dNTPI μ L 20 μ moI/L PEDV-VR I μ L 5X反轉(zhuǎn)錄緩沖液4yL 40 U/ μ L RNA酶抑制劑 I μ L O.1 mmol/L DTT2 μ L 200U/yL 反轉(zhuǎn)錄酶O. 25 μ L 混勻后_20°C保存； (3)PCR反應(yīng)液 無菌 DEPC 水32. 5 μ L 20 μ mol/LPCR弓丨物混合液 2 μ L 10XPCR緩沖液5yL 2. 5 mmol/L dNTP8μ L 5U/ μ L DNA 聚合酶 O. 5 μ L 混勻后_20°C保存。
4.如權(quán)利要求2或3所述的試劑盒，還包括陽性對(duì)照為豬流行性腹瀉病毒變異株JS-HZ2012發(fā)生腹瀉的糞便樣品。
全文摘要
本發(fā)明提供了豬流行性腹瀉病毒變異株檢測(cè)用引物及其檢測(cè)試劑盒，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。所述正向引物PEDV-VF(SEQ ID NO.1)5’-TTGGTGAAAACCAGGGTGTC-3’和反向引物PEDV-VR(SEQ ID NO.2)5’-CAACACTATGTTCACTCA-3’。本發(fā)明還進(jìn)一步提供了檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒變異株的檢測(cè)試劑盒。其檢測(cè)方法以總RNA為模板，利用上述引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)擴(kuò)增片段的位置判定結(jié)果。本發(fā)明的引物特異性好，檢測(cè)方法快速簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確性高，為豬流行性腹瀉病毒變異株的檢測(cè)提供了保證。
文檔編號(hào)C12N15/11GK103060474SQ201310012559
公開日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2013年1月7日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月7日
發(fā)明者李彬, 何孔旺, 杜露平, 郭容利, 倪艷秀, 溫立斌, 俞正玉, 張雪寒, 茅愛華, 呂立新, 胡屹屹, 周俊明, 王小敏, 祝昊丹, 于洋 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院