專利名稱：利用代謝輪廓分析提高雷帕霉素產(chǎn)量的優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于代謝輪廓分析指導(dǎo)發(fā)酵優(yōu)化技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及代謝輪廓方法動態(tài)分析胞內(nèi)影響雷帕霉素合成的關(guān)鍵代謝物，理性指導(dǎo)高產(chǎn)雷帕霉素發(fā)酵培養(yǎng)基的添加優(yōu)化。
背景技術(shù)：
雷帕霉素是Streptomyces hygroscopicus合成的、ー種重要的天然內(nèi)酯類化合物，它具有多種生物活性，如抗真菌、免疫抑制活性、抗腫瘤活性、神經(jīng)保護(hù)(Steiner etal.1997)和抗衰老。特別是雷帕霉素具有的強(qiáng)效免疫抑制活性，臨床上已被批準(zhǔn)用于治療器官移植抗排斥反應(yīng)和自身免疫疾病的治療。此外雷帕霉素的半合成衍生物temsiroI imus和everolimus也被批準(zhǔn)臨床上用于治療晚期腎癌。由于雷帕霉素具有的重要藥用價(jià)值和生物活性，其生物合成途徑和調(diào)控機(jī)制也逐漸的被深入研究。野生型吸水鏈霉菌中雷帕霉素的產(chǎn)量比較低，因此，對于雷帕霉素的エ業(yè)化生產(chǎn)和臨床應(yīng)用，吸水鏈霉菌中雷帕霉素效價(jià)的進(jìn)ー步提高和雷帕霉素各種衍生物的合成勢在必行。發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化是提高抗生素發(fā)酵水平的一種有效方法，其中Lee et al.通過單因素試驗(yàn)對Streptomyces hygroscopicus C9發(fā)酵培養(yǎng)氮源進(jìn)行優(yōu)化后雷帕霉素產(chǎn)量由93mg/L提高至125mg/L，比優(yōu)化前提高了 30%多；Cheng et al.通過對發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化使雷帕霉素產(chǎn)量由18mg/L提高到97mg/L ;Sallam et al.通過單因素實(shí)驗(yàn)方法對雷帕霉素生產(chǎn)菌株Streptomyces hygroscopicus ATCC29253的最佳生產(chǎn)條件進(jìn)行了優(yōu)化,雷帕霉素產(chǎn)量從10.66mg/L提高到41.46mg/L。這些利用單因素或者響應(yīng)面方法進(jìn)行的發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化側(cè)重于培養(yǎng)基成分和其配比的改變。而發(fā)酵培養(yǎng)基成分的變化對菌體胞內(nèi)代謝具有復(fù)雜的影響，并且培養(yǎng)基優(yōu)化引起的菌體胞內(nèi)代謝行為的改變還沒有被深入研究。在微生物中，初級代謝物水平變化直接影響抗生素前體的供應(yīng)以及抗生素的合成。作為次級代謝物，雷帕霉素具有復(fù)雜的生物合成途徑，其直接生物合成前體包括(4R，5R) -4, 5-dihydroxycyclohex-l-enecarboxylic acid (DHCHC)、哌唳酸、7 個(gè)丙ニ酸輔酶 A 和7個(gè)甲基丙ニ酰輔酶A，并且這些直接前體的生物合成涉及多種初級代謝途徑，如糖代謝、三羧酸循環(huán)、脂肪酸代謝、莽草酸代謝、氨基酸代謝等。涉及這些代謝途徑的胞內(nèi)代謝物動態(tài)變化對于深入理解影響雷帕霉素合成的胞內(nèi)關(guān)鍵因素至關(guān)重要。代謝組學(xué)作為ー個(gè)強(qiáng)大的工具通過綜合分析生物樣品中代謝信息，能夠測定和評價(jià)生物系統(tǒng)受外界或內(nèi)部擾動后的胞內(nèi)動態(tài)多參數(shù)代謝響應(yīng)。Korneli 等(Korneli C, Bolten CJ, Godard T, Franco-LaraE, Wittmann C(2012)Debottlenecking recombinant protein production in Bacillusmegaterium under large-scale conditions—targeted precursor feeding designedfrom metabolomics.Biotechnol Bioengl09:1538 - 1550)利用代謝組學(xué)手段研究大規(guī)模條件下巨大芽孢桿菌生產(chǎn)綠色熒光蛋白的瓶頸，通過流加氨基酸前體使綠色熒光蛋白產(chǎn)量提高了 100%。Lu 等(Lu S，Wang J, Niu Y, Yang J, Zhou J, Yuan Y (2012)Metabolicprofiling reveals growth related FAME productivity and quality of Chlorellasorokiniana with different inoculum sizes.Biotechnol Bioengl09:1651 - 1662)利用代謝輪廓分析方法研究不同接種量對小球藻生產(chǎn)脂肪酸甲酯產(chǎn)量和質(zhì)量的影響，發(fā)現(xiàn)光強(qiáng)度是其中限制高接種量條件下脂肪酸甲酯產(chǎn)量的關(guān)鍵因素。然而，到目前為止，采用代謝輪廓分析，動態(tài)檢測胞內(nèi)代謝物變化，考察發(fā)酵培養(yǎng)基成分的改變對Streptomyceshygroscopicus初級代謝物水平和雷帕霉素的合成的影響,分析限制雷帕霉素合成的胞內(nèi)關(guān)鍵代謝物，進(jìn)而理性指導(dǎo)雷帕霉素發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化的研究還沒有被報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明之目的是利用動態(tài)檢測和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)為基礎(chǔ)的代謝輪廓分析方法，通過動態(tài)檢測吸水鏈霉菌胞內(nèi)代謝物變化，考察發(fā)酵培養(yǎng)基成分改變(發(fā)酵培養(yǎng)基Ml為初始培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基M2為Ml經(jīng)過響應(yīng)面優(yōu)化得到)引起的胞內(nèi)代謝物代謝水平差異，分析菌體胞內(nèi)代謝與雷帕霉素合成的相關(guān)性，鑒定影響雷帕霉素生物合成的胞內(nèi)關(guān)鍵化合物，結(jié)合相關(guān)途徑及雷帕霉素生物合成途徑對影響雷帕霉素合成的胞內(nèi)關(guān)鍵化合物動態(tài)變化進(jìn)行分析，針對限制雷帕霉素合成的關(guān)鍵因素對M2培養(yǎng)基提出了進(jìn)ー步的動態(tài)添加措施，從而獲得最優(yōu)化培養(yǎng)基M3，以進(jìn)ー步提高雷帕霉素產(chǎn)量。提出了利用代謝輪廓分析提高雷帕霉素產(chǎn)量的優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的方法。本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:設(shè)定發(fā)酵培養(yǎng)基Ml為初始培養(yǎng)基，簡稱Ml ;發(fā)酵培養(yǎng)基M2為Ml經(jīng)過響應(yīng)面優(yōu)化得到，簡稱M2:步驟如下:I)Ml、M2培養(yǎng)條件下吸水鏈霉菌發(fā)酵特性變化:對發(fā)酵培養(yǎng)基Ml、M2兩種培養(yǎng)條件下雷帕霉素產(chǎn)量、菌體生物量、發(fā)酵液PH值和發(fā)酵液總糖含量進(jìn)行動態(tài)檢測；根據(jù)吸水鏈霉菌在Ml和M2培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下的雷帕霉素生物合成曲線確定代謝輪廓研究的取樣點(diǎn)，在兩種條件下雷帕霉素產(chǎn)量具有顯著差異的時(shí)間段進(jìn)行取樣。2)對Ml和M2培養(yǎng)條件下菌體胞內(nèi)輔酶A類化合物進(jìn)行提取，采用高效液相色譜-電噴射離子源-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-EIS-MS/MS)檢測，與標(biāo)準(zhǔn)輔酶A類化合物離子片段進(jìn)行比對分析，對Ml和M2培養(yǎng)條件下菌體胞內(nèi)輔酶A類化合物進(jìn)行定量。3)利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)檢測Ml和M2培養(yǎng)條件下菌體胞內(nèi)代謝物，利用Masslynx software對質(zhì)譜峰進(jìn)行識別及定量化,通過把姆種化合物的質(zhì)譜片段與NIST質(zhì)譜庫進(jìn)行對比，對每種代謝物進(jìn)行鑒定。4)利用SIMCA-P Demo軟件對GC-MS所檢測胞內(nèi)化合物以及雷帕霉素產(chǎn)量數(shù)據(jù)進(jìn)行偏最小二乗法分析，研究Ml和M2培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下菌體初級代謝與雷帕霉素合成的相關(guān)性，鑒定出對兩種條件下菌體代謝差異和雷帕霉素產(chǎn)量具有顯著貢獻(xiàn)(VIP>1)的化合物，并確定這些化合物涉及的代謝途徑。5)對步驟2)胞內(nèi)輔酶A化合物和步驟4)確定的化合物動態(tài)變化進(jìn)行對比分析，研究M2培養(yǎng)條件下雷帕霉素產(chǎn)量高于Ml的胞內(nèi)關(guān)鍵因素，進(jìn)而針對這些胞內(nèi)關(guān)鍵因素對雷帕霉素發(fā)酵培養(yǎng)基提出改進(jìn)措施，得到最優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基M3，理性指導(dǎo)雷帕霉素發(fā)酵培
養(yǎng)基優(yōu)化。

依據(jù)上述技術(shù)方案，在吸水鏈霉菌Streptomyces hygroscopicus U1-6E7,保藏中國普通微生物菌種保藏管理中心菌株編號:CGMCC6988中，初始發(fā)酵培養(yǎng)基Ml (40g/L葡萄糖、20g/L甘露醇、45g/L黃豆餅粉、0.3g/L硫酸銨、0.3g/L K2HPO4),響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基M2 (30g/L葡萄糖、30g/L甘露醇、40g/L黃豆餅粉、0.5g/L硫酸銨、0.lg/L K2HPO4)條件下進(jìn)行了雷帕霉素發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化研究。具體過程如下:I)根據(jù)Ml和M2條件下雷帕霉素生物合成曲線，確定組學(xué)研究的取樣點(diǎn)為48h、72h、96h 和 120h。；2) LC-EIS-MS/MS檢測Ml和M2條件下菌體胞內(nèi)輔酶類A類化合物，根據(jù)輔酶類A類化合物標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖，確定菌體胞內(nèi)輔酶類A類化合物濃度。3) GC-MS檢測Ml和M2條件下菌體胞內(nèi)代謝物，共定量檢測出91種化合物，其中79種被鑒定，包括34種有機(jī)酸、20種氨基酸、13種糖類、4種胺類、5種其他，12種未被鑒定。4)PLS分析表明菌體代謝與雷帕霉素合成具有相關(guān)性，鑒定了 16種影響雷帕霉素合成的胞內(nèi)關(guān)鍵化合物，這些化合物主要涉及三羧酸循環(huán)(TCA)、脂肪酸代謝、莽草酸代謝和氨基酸代謝。5)結(jié)合雷帕霉素生物合成途徑以及TCA循環(huán)、脂肪酸代謝、莽草酸代謝和氨基酸代謝，對影響雷帕霉素合成的胞內(nèi)關(guān)鍵化合物的動態(tài)變化進(jìn)行分析，理性指導(dǎo)培養(yǎng)基優(yōu)化。在M2發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，發(fā)酵Oh添加1.0g/L油酸甲酷，12h添加1.0g/L賴氨酸，24h添加0.5g/L莽草酸,36h添加0.5g/L琥拍酸鈉、0.lg/L苯丙氨酸、0.lg/L色氨酸和0.lg/L酪氨酸，最終獲得最優(yōu)化培養(yǎng)基M3，雷帕霉素產(chǎn)量達(dá)到了 307mg/L，比M2提高了 56.6%。本發(fā)明利用動態(tài) 檢測和代謝輪廓分析方法，用于指導(dǎo)高產(chǎn)雷帕霉素發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化，通過考察兩種發(fā)酵培養(yǎng)基條件下引起的胞內(nèi)小分子代謝物代謝水平差異，分析兩種條件下胞內(nèi)代謝與雷帕霉素合成的相關(guān)性，結(jié)合相關(guān)代謝途徑對兩種培養(yǎng)條件下胞內(nèi)小分子代謝物動態(tài)變化進(jìn)行分析，掲示限制雷帕霉素合成的小分子代謝物，并分析其不足，理性提出進(jìn)ー步的動態(tài)添加措施，為提高雷帕霉素產(chǎn)量提供了一個(gè)新的思路。


圖1:M2、Ml培養(yǎng)條件下雷帕霉素產(chǎn)量、菌體生物量、PH值動和發(fā)酵液總糖態(tài)變化圖。圖2:基于M2、M1培養(yǎng)條件下的菌體代謝輪廓和雷帕霉素產(chǎn)量的PLS模型，模型參數(shù)R2⑴為0.603、R2⑴為0.987、Q2為0.978。a:PLS得分圖t[l]/u[l]掲示了兩種培養(yǎng)條件下菌體代謝的差異性以及代謝物輪廓(tl)和雷帕霉素產(chǎn)量(ul)之間的相關(guān)性。b:由代謝數(shù)據(jù)得出的PLS模型VIP圖。圖3:不同濃度的外源添加物添加效果。圖4:培養(yǎng)基添加措施對雷帕霉素產(chǎn)量及發(fā)酵副產(chǎn)物的影響。
具體實(shí)施例方式下面根據(jù)本發(fā)明的方法，結(jié)合具體的實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)ー步說明:步驟1:我們采用的的吸水鏈霉菌為Streptomyces hygroscopicus U1-6E7。保藏中國普通微生物菌種保藏管理中心菌株編號:CGMCC6988。選用的發(fā)酵培養(yǎng)基Ml的成分及含量為:40g/L葡萄糖、20g/L甘露醇、45g/L黃豆餅粉、0.3g/L硫酸銨、0.3g/LK2HP04 ;利用響應(yīng)面方法對初始發(fā)酵培養(yǎng)基Ml進(jìn)行優(yōu)化，獲得了優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基M2。發(fā)酵培養(yǎng)基M2的成分及含量為:30g/L葡萄糖、30g/L甘露醇、40g/L黃豆餅粉、0.5g/L硫酸銨、0.lg/L K2HP04。對M2、Ml兩種培養(yǎng)條件下雷帕霉素合成量、菌體生物量、發(fā)酵液PH值及發(fā)酵液總糖含量進(jìn)行動態(tài)檢測，其結(jié)果如圖1.所示。S.hygroscopicus U1-6E7在發(fā)酵培養(yǎng)基M2中具有明顯的發(fā)酵優(yōu)勢，雷帕霉素產(chǎn)量提高了 39%，達(dá)到196mg/L。其中M2條件下的雷帕霉素的合成速率明顯大于M1，根據(jù)Ml、M2培養(yǎng)條件下雷帕霉素合成曲線，在兩種條件下雷帕霉素合成開始產(chǎn)生明顯差異(>15mg/L)和雷帕霉素大量合成期進(jìn)行代謝輪廓分析研究取樣，取樣點(diǎn)設(shè)為48h、72h、96h 和 120h。步驟2:菌體內(nèi)輔酶A類化合物的提取，即首先用含有硅油(AR200:DC200，4:1，8=1.010)對發(fā)酵液中菌體進(jìn)行萃取，萃取的菌體用15% (w/v)三氯こ酸懸浮懸浮，然后20000轉(zhuǎn)離心15mint)60%的菌體萃取到三氯こ酸溶液中，利用OASIS HLB SPE試劑盒對三氯こ酸菌體萃取液進(jìn)行真空過濾，之后利用0.15%三氯こ酸溶液和正己烷洗滌試劑盒，最后用甲醇?xì)溲趸@(99:1，v/v)溶解提取菌體內(nèi)輔酶A類化合物，獲得細(xì)胞內(nèi)輔酶A類化合物溶液。取80 ii L輔酶A類化合物溶液進(jìn)行高效液相色譜-電噴射離子源-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-EIS-MS/MS,ffaters/Micromass, Manchester, UK)。通過輔酶A標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜_電噴射離子源-質(zhì)譜/質(zhì)譜(LC-EIS-MS/MS)圖比對，檢測色譜碎片中輔酶A化合物母離子向子離子的轉(zhuǎn)化(m/zparent>m/z daughter),結(jié)果是:こ酰輔酶 A, 810>303;丙酰輔酶 A, 824>317;異丁酰輔酶A，841>334;丙ニ酰輔酶A，854>347;甲基丙ニ酰輔酶A和琥珀酰輔酶A，868>361。與標(biāo)準(zhǔn)品輔酶A化合物離子碎片，所檢測到的胞內(nèi)輔酶A化合物的濃度如表I所示。表權(quán)利要求
1.用代謝輪廓分析提高雷帕霉素產(chǎn)量的優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的方法，設(shè)定發(fā)酵培養(yǎng)基Ml為初始培養(yǎng)基，簡稱Ml ;發(fā)酵培養(yǎng)基M2為Ml經(jīng)過響應(yīng)面優(yōu)化得到，簡稱M2:其特征是步驟如下: 1)Ml、M2培養(yǎng)條件下吸水鏈霉菌發(fā)酵特性變化:對發(fā)酵培養(yǎng)基Ml、M2兩種培養(yǎng)條件下雷帕霉素產(chǎn)量、菌體生物量、發(fā)酵液PH值和發(fā)酵液總糖含量進(jìn)行動態(tài)檢測；根據(jù)吸水鏈霉菌在Ml和M2培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下的雷帕霉素生物合成曲線確定代謝組學(xué)研究的取樣點(diǎn)，在兩種條件下雷帕霉素產(chǎn)量具有顯著差異的時(shí)間段進(jìn)行取樣。
2)對Ml和M2培養(yǎng)條件下菌體胞內(nèi)輔酶A類化合物進(jìn)行提取，采用高效液相色譜-電噴射離子源-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測，與標(biāo)準(zhǔn)輔酶A類化合物離子片段進(jìn)行比對分析，對Ml和M2培養(yǎng)條件下菌體胞內(nèi)輔酶A類化合物進(jìn)行定量。
3)利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測Ml和M2培養(yǎng)條件下菌體胞內(nèi)代謝物，利用Masslynxsoftware對質(zhì)譜峰進(jìn)行識別及定量化,通過把姆種化合物的質(zhì)譜片段與NIST質(zhì)譜庫進(jìn)行對比，對每種代謝物進(jìn)行鑒定。
4)利用SIMCA-PDemo軟件對氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀所檢測胞內(nèi)化合物以及雷帕霉素產(chǎn)量數(shù)據(jù)進(jìn)行偏最小二乗法分析，研究Ml和M2培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下菌體初級代謝與雷帕霉素合成的相關(guān)性， 鑒定出對兩種條件下菌體代謝差異和雷帕霉素產(chǎn)量具有顯著貢獻(xiàn)的化合物，并確定這些化合物涉及的代謝途徑。
5)對步驟2)胞內(nèi)輔酶A化合物和步驟4)確定的化合物動態(tài)變化進(jìn)行對比分析，研究M2培養(yǎng)條件下雷帕霉素產(chǎn)量高于Ml的胞內(nèi)關(guān)鍵因素，進(jìn)而針對這些胞內(nèi)關(guān)鍵因素對雷帕霉素發(fā)酵培養(yǎng)基提出改進(jìn)措施，得到最優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基M3，理性指導(dǎo)雷帕霉素發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化。
全文摘要
本發(fā)明提供了利用代謝輪廓分析提高雷帕霉素產(chǎn)量的優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的方法，利用動態(tài)檢測和代謝輪廓分析的方法研究在初始發(fā)酵培養(yǎng)基和優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下菌體胞內(nèi)代謝物動態(tài)變化及其差異。偏最小二乘法分析結(jié)果表明菌體初級代謝物輪廓和雷帕霉素產(chǎn)量具有相關(guān)性，結(jié)合相關(guān)途徑對這些關(guān)鍵化合物動態(tài)變化進(jìn)行分析，對培養(yǎng)基提出了進(jìn)一步的動態(tài)添加措施。經(jīng)過對S.hygroscopicus U1-6E7發(fā)酵培養(yǎng)基的研究，雷帕霉素產(chǎn)量從196mg/L提高至307mg/L，提高了56.6%。這些結(jié)果表明動態(tài)檢測結(jié)合代謝物輪廓分析方法理性指導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化能夠成功地用于提高抗生素發(fā)酵水平，為發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化提供了新的思路。
文檔編號C12R1/55GK103088104SQ201310011709
公開日2013年5月8日 申請日期2013年1月12日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月12日
發(fā)明者聞建平, 趙素敏, 齊海山 申請人:天津大學(xué)