提取雷帕霉素的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種提取雷帕霉素的方法，具有以下步驟：①將含有雷帕霉素的發(fā)酵液過濾，濾餅用有機(jī)溶劑抽提后，再次過濾，濾液經(jīng)濃縮后，得到第一濃縮液；②將第一濃縮液經(jīng)大孔吸附樹脂柱吸附后，洗脫大孔吸附樹脂柱，并將收集的洗脫液濃縮，得到第二濃縮液；③將第二濃縮液萃取后再濃縮，得到第三濃縮液；④將第三濃縮液經(jīng)柱層析后再次洗脫，并將收集的洗脫液再次濃縮，得到第四濃縮液；⑤將第四濃縮液結(jié)晶后，再重結(jié)晶，得到雷帕霉素。本發(fā)明采用的大孔吸附樹脂為AB-8大孔吸附樹脂，洗脫采用的溶劑為丙酮，這樣最終可以得到含量、純度、收率均較高的雷帕霉素。
【專利說明】提取雷帕霉素的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分離純化【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種提取雷帕霉素的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 雷帕霉素，又名西羅莫司，屬大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，是一種療效好、低毒、無腎毒性的 新型免疫抑制劑，它是從吸水鏈霉菌發(fā)酵液中提取得到的。
[0003] 中國(guó)專利文獻(xiàn)CN102070652A公開了一種從發(fā)酵液中分離提取西羅莫司的方法， 包括將西羅莫司發(fā)酵液過濾或離心分離后得到菌絲體，然后經(jīng)萃取、脫色、減壓濃縮得到西 羅莫司粗提物，接著進(jìn)行高速逆流色譜分離，最后減壓濃縮、干燥得到西羅莫司純品。該方 法需要采用價(jià)格昂貴的高速逆流色譜儀，導(dǎo)致生產(chǎn)成本較高，而且純度較低，不到90%，從而 不適于工業(yè)化大生產(chǎn)。
[0004] 中國(guó)專利文獻(xiàn)CN102372726A公開了一種西羅莫司粗晶的制備方法，包括將西羅 莫司菌絲體的浸提液減壓濃縮后加入固體吸附劑吸附，然后經(jīng)萃取、洗滌、減壓濃縮、洗滌、 結(jié)晶、洗晶、干燥得到西羅莫司純品。產(chǎn)物純度為95%?98%，含量為77. 4%?84. 1%，收率 為63. 3%?72. 3%。該方法采用硅藻土、硅膠等固體吸附劑進(jìn)行吸附雜質(zhì)，效果不佳，最終得 到的西羅莫司含量和純度均較低，收率也不高，同樣不適于工業(yè)化大生產(chǎn)。
[0005] 中國(guó)專利文獻(xiàn)CN102443012A公開了一種從發(fā)酵液中提純雷帕霉素的方法，包括 將發(fā)酵液過濾后得到的菌絲體抽提后真空濃縮，同時(shí)將發(fā)酵液過濾后得到的上清液萃取分 離后真空濃縮，將兩個(gè)濃縮液合并后經(jīng)大孔樹脂吸附洗脫并真空濃縮，接著依次進(jìn)行萃取、 脫水、真空濃縮、柱層析、洗滌、洗脫、真空濃縮、結(jié)晶、真空濃縮、重結(jié)晶得到雷帕霉素純品， 純品純度為99. 5%?99. 6%，單雜小于0. 1%，收率最高可達(dá)60%。其中大孔樹脂吸附洗脫采 用的大孔樹脂為乂?-5、0丨&丨〇11即20、5?825，大孔樹脂與濃縮液的體積比為1:5?1:20， 洗脫劑為丙酮和水的混合液，洗脫溫度為15?35°C，洗脫pH為5. 0?8. 0。該方法采用大 孔吸附樹脂吸附可以有效提高雷帕霉素純度，但是收率仍然較低。
[0006] 關(guān)于在提取雷帕霉素的過程采用大孔吸附樹脂，鄧蕓等在《沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)》 (2011年12月，第28卷第12期，第991-994頁(yè))公開了大孔吸附樹脂在雷帕霉素分離純化 中的應(yīng)用，該文獻(xiàn)考察了X-5、D3520、AB-8、MN-200以及MN-202這五種大孔吸附樹脂對(duì)雷 帕霉素的吸附量，并且考察了甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷以及氯仿這六種洗脫劑 對(duì)雷帕霉素的解析率，其中X-5大孔吸附樹脂吸附能力最強(qiáng)，乙醇和二氯甲烷的洗脫能力 最強(qiáng)。
[0007] 另外，由上述文獻(xiàn)可知，在提取雷帕霉素的過程中需要進(jìn)行多次濃縮，而目前常用 的濃縮為旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮或者升膜降膜濃縮，對(duì)于經(jīng)大孔樹脂吸附后洗脫收集的洗脫液，上 述兩種濃縮效果均不佳。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于解決上述問題，提供一種分離純化效果較好的提取雷帕霉素的 方法。
[0009] 實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案是：一種提取雷帕霉素的方法，具有以下步驟：①將 含有雷帕霉素的發(fā)酵液過濾，濾餅用有機(jī)溶劑抽提后，再次過濾，濾液經(jīng)濃縮后，得到第一 濃縮液；②將步驟①得到的第一濃縮液經(jīng)大孔吸附樹脂柱吸附后，洗脫大孔吸附樹脂柱，并 將收集的洗脫液濃縮，得到第二濃縮液；③將步驟②得到的第二濃縮液萃取后再濃縮，得到 第三濃縮液；④將步驟③得到的第三濃縮液經(jīng)柱層析后再次洗脫，并將收集的洗脫液再次 濃縮，得到第四濃縮液；⑤將步驟④得到的第四濃縮液結(jié)晶后，再重結(jié)晶，得到雷帕霉素。
[0010] 上述步驟②中采用的大孔吸附樹脂為AB-8大孔吸附樹脂，洗脫采用的溶劑為丙 酮。
[0011] 上述步驟②中所述的濃縮為離心薄膜濃縮。
[0012] 上述步驟②中的洗脫過程如下：先用體積分?jǐn)?shù)為10%?30%的丙酮清洗大孔吸附 樹脂2?8個(gè)柱體積，然后再用體積分?jǐn)?shù)為20%?50%的丙酮清洗大孔吸附樹脂2?8個(gè) 柱體積，接著用體積分?jǐn)?shù)為30%?60%的丙酮清洗大孔樹脂2?8個(gè)柱體積，直至TLC檢測(cè) 發(fā)現(xiàn)流出液中含有雷帕霉素，最后用體積分?jǐn)?shù)為60%?90%的丙酮清洗大孔吸附樹脂直至 TLC檢測(cè)發(fā)現(xiàn)流出液中不含雷帕霉素。
[0013] 上述步驟②中的洗脫過程優(yōu)選如下：先用體積分?jǐn)?shù)為20%的丙酮清洗大孔吸附樹 脂5個(gè)柱體積，然后再用體積分?jǐn)?shù)為35%的丙酮清洗大孔吸附樹脂5個(gè)柱體積，接著用體積 分?jǐn)?shù)為50%的丙酮清洗大孔樹脂5個(gè)柱體積，直至TLC檢測(cè)發(fā)現(xiàn)流出液中含有雷帕霉素，最 后用體積分?jǐn)?shù)為80%的丙酮清洗大孔吸附樹脂直至TLC檢測(cè)發(fā)現(xiàn)流出液中不含雷帕霉素。
[0014] 本發(fā)明具有的積極效果：（1)本發(fā)明通過大量實(shí)驗(yàn)最終發(fā)現(xiàn)，采用AB-8作為大孔 吸附樹脂以及丙酮作為洗脫溶劑，最終可以使的得到的雷帕霉素中幾乎沒有水溶性雜質(zhì)， 而且脂溶性雜質(zhì)殘留明顯減少，從而可以得到含量、純度、收率均較高的雷帕霉素。（2)本發(fā) 明針對(duì)樹脂洗脫液對(duì)溫度較為敏感的特點(diǎn)，采用離心薄膜真空蒸發(fā)器進(jìn)行離心薄膜濃縮， 這樣可以大大降低蒸發(fā)溫度(一般在60°C以下，最低可達(dá)30°C以下)，從而保證了濃縮效果， 而且整個(gè)濃縮過程僅需1?2秒，既提高了效率，也降低了成本。

【具體實(shí)施方式】
[0015] (實(shí)施例1) 本實(shí)施例的提取雷帕霉素的方法具有以下步驟： ①將含有雷帕霉素的發(fā)酵液（300L，效價(jià)為I.Og/L)過濾，濾餅用丙酮抽提3次后，再次 過濾，濾液經(jīng)真空濃縮后，得到第一濃縮液。
[0016] ②將步驟①得到的第一濃縮液先以10倍體積以及5BV/h的流速流過經(jīng)預(yù)處理后 的AB-8大孔吸附樹脂柱，使雷帕霉素吸附在大孔樹脂上。所述的預(yù)處理是將AB-8大孔吸 附樹脂先用體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇浸泡過夜，以除去樹脂內(nèi)殘存的致孔劑及低聚物；然后 用蒸餾水洗滌樹脂5次，直至無乙醇味；最后將樹脂濾去水分，裝柱。
[0017] 然后對(duì)大孔吸附樹脂柱進(jìn)行梯度洗脫，具體如下：先用體積分?jǐn)?shù)為20%的丙酮清 洗大孔吸附樹脂5個(gè)柱體積，然后再用體積分?jǐn)?shù)為35%的丙酮清洗大孔吸附樹脂5個(gè)柱體 積，接著用體積分?jǐn)?shù)為50%的丙酮清洗大孔樹脂5個(gè)柱體積，直至TLC檢測(cè)發(fā)現(xiàn)流出液中含 有雷帕霉素，最后用體積分?jǐn)?shù)為80%的丙酮清洗大孔吸附樹脂直至TLC檢測(cè)發(fā)現(xiàn)流出液中 不含雷帕霉素。整個(gè)洗脫時(shí)間為7h。
[0018] 最后，將收集的洗脫液采用離心薄膜真空蒸發(fā)器進(jìn)行離心薄膜濃縮，得到第二濃 縮液。
[0019] 離心薄膜濃縮具體方法如下： a、 將洗脫液由進(jìn)料螺桿泵輸送至臥式離心薄膜蒸發(fā)器，并由變頻調(diào)速器控制螺桿泵轉(zhuǎn) 速以調(diào)節(jié)流量； b、 將洗脫液在蒸發(fā)器內(nèi)進(jìn)行真空濃縮，并通過控制加熱蒸汽溫度和進(jìn)料量，達(dá)到預(yù)定 的工藝濃縮要求； c、 將濃縮后的洗脫液借離心力的作用經(jīng)由出料管通過出料螺桿泵在錐形轉(zhuǎn)鼓內(nèi)周面 內(nèi)可完成整個(gè)蒸發(fā)過程，并使揮發(fā)出的輕組份經(jīng)二次蒸汽出口進(jìn)入冷凝器回收，重組分由 濃縮液出口收集管輸送進(jìn)成品儲(chǔ)罐。
[0020] ③將步驟②得到的第二濃縮液用乙酸乙酯萃取3次后再次真空濃縮，得到第三濃 縮液。
[0021] ④將步驟③得到的第三濃縮液經(jīng)硅膠柱層析分離后，用丙酮進(jìn)行洗脫，并將收集 的洗脫液再次真空濃縮，得到第四濃縮液。
[0022] ⑤將步驟④得到的第四濃縮液先用4倍體積的乙醚在KTC的溫度下結(jié)晶12h，然 后再用乙醚在5°C的溫度下重結(jié)晶12h，干燥得到261g的雷帕霉素。
[0023] 經(jīng)檢測(cè)，雷帕霉素的含量為98. 5%(HPLC，內(nèi)外標(biāo)法)，純度為99.8% (HPLC，面積歸 一法)，收率為85. 5%。
[0024](對(duì)比例1?對(duì)比例8) 各對(duì)比例與實(shí)施例1基本相同，不同之處在于大孔吸附樹脂種類和洗脫溶劑，具體見 表1。
[0025]表1

【權(quán)利要求】
1. 一種提取雷帕霉素的方法，具有以下步驟： ① 將含有雷帕霉素的發(fā)酵液過濾，濾餅用有機(jī)溶劑抽提后，再次過濾，濾液經(jīng)濃縮后， 得到第一濃縮液； ② 將步驟①得到的第一濃縮液經(jīng)大孔吸附樹脂柱吸附后，洗脫大孔吸附樹脂柱，并將 收集的洗脫液濃縮，得到第二濃縮液； ③ 將步驟②得到的第二濃縮液萃取后再濃縮，得到第三濃縮液； ④ 將步驟③得到的第三濃縮液經(jīng)柱層析后再次洗脫，并將收集的洗脫液再次濃縮，得 到第四濃縮液； ⑤ 將步驟④得到的第四濃縮液結(jié)晶后，再重結(jié)晶，得到雷帕霉素； 其特征在于：步驟②中采用的大孔吸附樹脂為AB-8大孔吸附樹脂，洗脫采用的溶劑為 丙酮。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取雷帕霉素的方法，其特征在于：步驟②中的洗脫過程如 下：先用體積分?jǐn)?shù)為10%?30%的丙酮清洗大孔吸附樹脂2?8個(gè)柱體積，然后再用體積分 數(shù)為20%?50%的丙酮清洗大孔吸附樹脂2?8個(gè)柱體積，接著用體積分?jǐn)?shù)為30%?60% 的丙酮清洗大孔樹脂2?8個(gè)柱體積，直至TLC檢測(cè)發(fā)現(xiàn)流出液中含有雷帕霉素，最后用體 積分?jǐn)?shù)為60%?90%的丙酮清洗大孔吸附樹脂直至TLC檢測(cè)發(fā)現(xiàn)流出液中不含雷帕霉素。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的提取雷帕霉素的方法，其特征在于：步驟②中的洗脫過程如 下：先用體積分?jǐn)?shù)為20%的丙酮清洗大孔吸附樹脂5個(gè)柱體積，然后再用體積分?jǐn)?shù)為35%的 丙酮清洗大孔吸附樹脂5個(gè)柱體積，接著用體積分?jǐn)?shù)為50%的丙酮清洗大孔樹脂5個(gè)柱體 積，直至TLC檢測(cè)發(fā)現(xiàn)流出液中含有雷帕霉素，最后用體積分?jǐn)?shù)為80%的丙酮清洗大孔吸附 樹脂直至TLC檢測(cè)發(fā)現(xiàn)流出液中不含雷帕霉素。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3之一所述的提取雷帕霉素的方法，其特征在于：上述步驟②中 所述的濃縮為離心薄膜濃縮。
【文檔編號(hào)】C07D498/18GK104262358SQ201410511513
【公開日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年9月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月29日
【發(fā)明者】虞小平, 殷侃 申請(qǐng)人:常州蘭陵制藥有限公司