一種禽流感滅活疫苗的滅活檢驗方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于獸用醫(yī)藥生物領(lǐng)域，具體涉及一種禽流感滅活疫苗的滅活檢驗方法。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來，國家對家禽禽流感強制免疫和養(yǎng)殖業(yè)相關(guān)人員對禽流感防控的高度重視，我國禽流感疫情總體上呈逐年下降的趨勢。但目前，無論是高致病性禽流感還是低致病性禽流感，仍然是嚴(yán)重威脅養(yǎng)禽業(yè)的大敵。自2004年以來，中國內(nèi)地相繼暴發(fā)高致病性禽流感，不僅沉重打擊了國內(nèi)的養(yǎng)禽業(yè)，而且對我國的經(jīng)濟(jì)和貿(mào)易發(fā)展也造成了嚴(yán)重的影響。
[0003]自1933年利用雞胚培養(yǎng)流感病毒獲得成功以來，雞胚就成為人們大量獲得流感病毒的主要來源。但是用雞胚分離流感病毒或傳代易引起病毒變異，而且雞胚殘留物還可能引起過敏性反應(yīng)。雞胚作為疫苗生產(chǎn)基質(zhì)，還存在大規(guī)模生產(chǎn)時供給困難和潛在的外源病毒污染問題。
[0004]近年來，隨著禽流感的頻繁暴發(fā)以及跨種屬傳播，人們認(rèn)識到需要研究一種可在流感大規(guī)模流行時能夠替代雞胚，快速、大量生產(chǎn)流感病毒的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。應(yīng)用MDCK細(xì)胞系培養(yǎng)流感病毒不僅解決了雞胚蛋白遺留物和外源病毒污染的問題，而且培養(yǎng)的病毒免疫原性更為穩(wěn)定。
[0005]獸醫(yī)生物制品生產(chǎn)中的滅活，是指破壞微生物的生物學(xué)活性、繁殖能力和致病性，但盡可能不影響其免疫原性，被滅活的微生物主要用于生產(chǎn)滅活疫苗；或指破壞診斷血清或待檢血清中的補體活性，以避免補體對診斷試驗的干擾作用。
[0006]滅活劑具有特異性，某些滅活劑只對一部分微生物有明顯的滅活作用，不同的滅活劑對同一種微生物的滅活效果也不同，如酚類能抑制和殺滅大部分細(xì)菌的繁殖體，5%的石炭酸溶液于數(shù)小時內(nèi)能殺死細(xì)菌的芽孢;真菌和病毒對酚類不太敏感。
[0007]因此在禽流感病毒滅活疫苗生產(chǎn)過程中，就需要對抗原的滅活進(jìn)行滅活檢驗，以確定抗原是否滅活完全，從而避免滅活不完全的疫苗造成生物安全隱患。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于提供一種禽流感滅活疫苗的滅活檢驗方法，該方法可穩(wěn)定，準(zhǔn)確地檢驗禽流感抗原的滅活情況，應(yīng)用于禽流感病毒滅活疫苗的生產(chǎn)檢驗。
[0009]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
一種禽流感滅活疫苗的滅活檢驗方法，包括以下步驟:
1)取至少3瓶細(xì)胞瓶培養(yǎng)MDCK細(xì)胞24-30h，MDCK細(xì)胞生長密度達(dá)80%以上時，棄去生長液，用0.0lmol/L的pH7.2的磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞瓶3_4次；
2)向各細(xì)胞瓶中分別加入Iml含胰酶的DMEM培養(yǎng)液，室溫放置15_20min，所述DMEM培養(yǎng)液中胰酶的質(zhì)量濃度為25-50yg /ml；
3)將滅活后的禽流感抗原液做10倍稀釋后，各取1-1.5mL分別接種于各個細(xì)胞瓶中，將細(xì)胞瓶置于35°C的CO2培養(yǎng)箱中孵育30-35min，使滅活后的禽流感抗原液在MDCK細(xì)胞上吸附，期間振搖1-2次，所述CO2培養(yǎng)箱中CO2的濃度為5%;
4)吸附后，在各細(xì)胞瓶中分別加入8-10mlDMEM培養(yǎng)液，將細(xì)胞瓶繼續(xù)置于上述0)2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)5天后，收獲細(xì)胞培養(yǎng)液，并反復(fù)凍融3次，此為盲傳第I代；
5)取至少3瓶已生長24-30h，并且生長密度達(dá)80%以上的MDCK細(xì)胞，棄去生長液，用0.0lmol/L的pH7.2的磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞瓶3_4次；
6)向各細(xì)胞瓶中分別加入Iml含胰酶的DMEM培養(yǎng)液，室溫放置15_20min，所述DMEM培養(yǎng)液中胰酶的質(zhì)量濃度為25-50yg /ml；
7)取上述步驟4)凍融后的細(xì)胞培養(yǎng)液1-1.5mL，接種于各細(xì)胞瓶中，將細(xì)胞瓶置于350C的CO2培養(yǎng)箱中孵育30-35min，期間振搖1_2次，所述CO2培養(yǎng)箱中CO2的濃度為5%;
8)在各細(xì)胞瓶中分別加入8-10mlDMEM培養(yǎng)液，將細(xì)胞瓶繼續(xù)置于上述CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)5天后，收獲細(xì)胞培養(yǎng)液，并反復(fù)凍融3次，此為盲傳第2代；
9)重復(fù)上述步驟5)-步驟8)，此為盲傳第3代；
10)滅活檢驗方法:
結(jié)果判定:上述步驟中盲傳3代的各瓶細(xì)胞(接種禽流感抗原液或細(xì)胞培養(yǎng)液的細(xì)胞)均無細(xì)胞病變出現(xiàn)，則判定為禽流感抗原液滅活完全;各代細(xì)胞瓶任何I瓶出現(xiàn)細(xì)胞病變，則判定為禽流感抗原液滅活不完全。
[0010]所述細(xì)胞瓶為T25細(xì)胞瓶。
[0011 ]各細(xì)胞瓶中，所述胰酶在各細(xì)胞瓶培養(yǎng)液中的終濃度為2.5-5.0yg /ml。
[0012]所述DMEM培養(yǎng)液為DMEM培養(yǎng)基用超純水配制而成，并調(diào)節(jié)pH至7.4。所述DMEM培養(yǎng)基為CIBCO公司生產(chǎn)。
[0013]本發(fā)明采用以上技術(shù)方案，相比于現(xiàn)有技術(shù)中，禽流感滅活疫苗的滅活檢驗方法多采用接種雞尿囊腔接種，培養(yǎng)一定時間后觀察雞胚死亡情況并測血凝情況，該方法因涉及了雞胚，雞胚質(zhì)量不佳會引起非特異性死亡，雞胚存在外源微生物也會引起死亡或血凝現(xiàn)象的出現(xiàn)，都會使檢驗結(jié)果不穩(wěn)定或不準(zhǔn)確。而本發(fā)明采用MDCK傳代細(xì)胞系進(jìn)行禽流感滅活抗原的滅活檢驗，因傳代細(xì)胞的穩(wěn)定和均一，檢驗結(jié)果更穩(wěn)定;另因采用無外源微生物污染的MDCK細(xì)胞，從而保證了檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。
【具體實施方式】
[0014]—種禽流感滅活疫苗的滅活檢驗方法，包括以下步驟:
1)取至少3瓶細(xì)胞瓶培養(yǎng)MDCK細(xì)胞24-30h，MDCK細(xì)胞生長密度達(dá)80%以上時，棄去生長液，用0.0lmol/L的pH7.2的磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞瓶3_4次；
2)向各細(xì)胞瓶中分別加入Iml含胰酶的DMEM培養(yǎng)液，室溫放置15_20min，所述DMEM培養(yǎng)液中胰酶的質(zhì)量濃度為25-50yg /ml；
3)將滅活后的禽流感抗原液做10倍稀釋后，各取1-1.5mL分別接種于各個細(xì)胞瓶中，將細(xì)胞瓶置于35°C的CO2培養(yǎng)箱中孵育30-35min，使滅活后的禽流感抗原液在MDCK細(xì)胞上吸附，期間振搖1-2次，所述CO2培養(yǎng)箱中CO2的濃度為5%;
4)吸附后，在各細(xì)胞瓶中分別加入8-10mlDMEM培養(yǎng)液，將細(xì)胞瓶繼續(xù)置于上述0)2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)5天后，收獲細(xì)胞培養(yǎng)液，并反復(fù)凍融3次，此為盲傳第I代；
5)取至少3瓶已生長24-30h，并且生長密度達(dá)80%以上的MDCK細(xì)胞，棄去生長液，用0.0lmol/L的pH7.2的磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞瓶3_4次；
6)向各細(xì)胞瓶中分別加入Iml含胰酶的DMEM培養(yǎng)液，室溫放置15_20min，所述DMEM培養(yǎng)液中胰酶的質(zhì)量濃度為25-50yg /ml；
7)取上述步驟4)凍融后的細(xì)胞培養(yǎng)液1-1.5mL，接種于各細(xì)胞瓶中，將細(xì)胞瓶置于350C的CO2培養(yǎng)箱中孵育30-35min，期間振搖1_2次，所述CO2培養(yǎng)箱中CO2的濃度為5%;
8)在各細(xì)胞瓶中分別加入8-10mlDMEM培養(yǎng)液，將細(xì)胞瓶繼續(xù)置于上述CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)5天后，收獲細(xì)胞培養(yǎng)液，并反復(fù)凍融3次，此為盲傳第2代；
9)重復(fù)上述步驟5)-步驟8)，此為盲傳第3代；
10)滅活檢驗方法:
結(jié)果判定:上述步驟中盲傳3代的各瓶細(xì)胞(接種禽流感抗原液或細(xì)胞培養(yǎng)液的細(xì)胞)均無細(xì)胞病變出現(xiàn)，則判定為禽流感抗原液滅活完全;各代細(xì)胞瓶任何I瓶出現(xiàn)細(xì)胞病變，則判定為禽流感抗原液滅活不完全。
[0015]所述DMEM培養(yǎng)液為DMEM培養(yǎng)基用超純水配制而成，并調(diào)節(jié)pH至7.4。
[0016]各細(xì)胞瓶中，所述胰酶在各細(xì)胞瓶培養(yǎng)液中的終濃度為2.5-5.0yg /ml。
[0017]實施例1
一種禽流感滅活疫苗的滅活檢驗方法，包括以下步驟:
1)取3瓶T25細(xì)胞瓶培養(yǎng)MDCK細(xì)胞24h，MDCK細(xì)胞生長密度達(dá)80%以上時，棄去生長液，用0.0lmol/L的pH7.2的磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞瓶3次；
2)向各細(xì)胞瓶中分別加入Iml含胰酶的DMEM培養(yǎng)液(pH7.4)，室溫放置15miη，所述DMEM培養(yǎng)液中胰酶的質(zhì)量濃度為25yg /ml；
3)將滅活后的禽流感抗原液做10倍稀釋后，各取ImL分別接種于各個細(xì)胞瓶中，將細(xì)胞瓶置于35°C的CO2培養(yǎng)箱中孵育30min，使滅活后的禽流感抗原液在MDCK細(xì)胞上吸附，期間振搖2次，所述CO2培養(yǎng)箱中CO2的濃度為5%;
4)吸附后，在各細(xì)胞瓶中分別加入1mlDMEM培養(yǎng)液(pH7.4)，將細(xì)胞瓶繼續(xù)置于上述CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)5天后，收獲細(xì)胞培養(yǎng)液，并反復(fù)凍融3次，此為盲傳第I代；
5)取3瓶已生長24h，并且生長密度達(dá)80%以上的MDCK細(xì)胞，棄去生長液，用0.0lmol/L的pH7.2的磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞瓶3次；
6)向各細(xì)胞瓶中分別加入Iml含胰酶的DMEM培養(yǎng)液(pH7.4)，室溫放置15min，所述DMEM培養(yǎng)液中胰酶的質(zhì)