專利名稱：一種檢測(cè)拉米夫定耐藥hbv dna的方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)HBV DNA的方法及其試劑盒，特別是涉及應(yīng)用熒光標(biāo)記探針及特異性引物進(jìn)行乙肝病毒拉米夫定(Lamivudine)耐藥性的檢測(cè)。
背景技術(shù)：
乙型肝炎病毒(HBV)流行世界各地，估計(jì)全球有20億人感染，其中慢性感染者3.5億，我國約占半數(shù)，全球每年約有100萬人死于HBV感染。此種感染最終可發(fā)展為肝硬化、肝癌，是當(dāng)前WHO公布的人類疾病死亡原因中居第9位的疾病。
目前對(duì)HBV感染的治療主要有干擾素和拉米夫定。干擾素療程長、總的應(yīng)答率較低，非選擇病人中僅有20％～30％乙肝病毒e抗原(HBeAg)消失，經(jīng)過篩選的病人療效也僅有40％～60％的療效，且價(jià)格昂貴以及需長期肌肉注射給藥，副作用明顯，臨床應(yīng)用范圍較為狹窄。拉米夫定是治療乙型肝炎的有效核苷類藥物，已在全球廣泛使用，在中國已成為銷量最大的處方藥。
拉米夫定是嘌呤核苷類藥物，它是HBV復(fù)制強(qiáng)有力的抑制劑。能夠與HBV脫氧核糖核酸(DNA)多聚酶C區(qū)YMDD(酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合，從而起到抑制病毒復(fù)制的作用。正因?yàn)槔追蚨ㄖ荒芤种撇《镜膹?fù)制而不能殺滅病毒，因此，一般推薦的治療方法是長期持續(xù)給藥。但長期使用拉米夫定會(huì)引起HBV的DNA多聚酶基因的YMDD結(jié)構(gòu)域發(fā)生突變，DNA多聚酶功能改變，拉米夫定失去HBV復(fù)制抑制功能，從而逐漸產(chǎn)生臨床常見的HBV拉米夫定耐藥。拉米夫定耐藥主要是由HBV P基因C區(qū)YMDD變異所引起，YMDD變異分為兩種，一種是HBV P基因第550位氨基酸由Met突變?yōu)閂al，此乃YVDD變異；另一種是HBV P基因第550位氨基酸由Met突變?yōu)镮le，此乃YIDD變異。另外YVDD突變時(shí)常伴有528位的突變(核苷酸A669→C，使氨基酸由Leu528→Met)。YVDD和YIDD兩種變異分別由HBV第739位堿基A→G和741位G→T突變所引起。大量的臨床流行病學(xué)研究證實(shí)，使用拉米夫定六個(gè)月后，病毒變異株開始明顯增多。使用一年以上的人群中，其耐藥突變的發(fā)生率約17-45％，使用三年以上的人群耐藥突變發(fā)生率達(dá)到60％。拉米夫定對(duì)耐藥突變株復(fù)制的抑制作用減弱萬倍以上，臨床表現(xiàn)為降低的HBV DNA反跳，伴轉(zhuǎn)氨酶(ALT)水平升高。根據(jù)目前的研究，HBV P基因C區(qū)一些基因發(fā)生變異后，可能使乙肝的病情加重，容易發(fā)性重型肝炎。故臨床大量、廣泛地使用拉米夫定及其類似藥，需要?jiǎng)討B(tài)地監(jiān)測(cè)病毒基因的變異情況，以便及時(shí)調(diào)整和更改治療方案。
HBV耐藥突變基因有其獨(dú)特的特點(diǎn)1、耐藥突變位點(diǎn)處于高突變區(qū)，其附近有很多非耐藥的突變；2、患者體內(nèi)的HBV病毒發(fā)生耐藥突變是個(gè)緩慢而動(dòng)態(tài)的過程，大部分患者體內(nèi)同時(shí)含有耐藥毒株和敏感毒株，只是各自的比例各不相同，拉米夫定對(duì)患者的治療效果是由耐藥毒株與敏感毒株之間的比例關(guān)系而不是它們的絕對(duì)數(shù)量決定的，臨床上，常將耐藥毒株占總HBV病毒含量10％作為耐藥的界限，高于10％，認(rèn)為病毒產(chǎn)生拉米夫定耐藥，且拉米夫定治療不能控制HBV病毒的復(fù)制；否則認(rèn)為病毒依然敏感，接受拉米夫定治療能很好控制HBV病毒的總量。正是基于HBV耐藥基因突變的這兩個(gè)特點(diǎn)，雖然，目前用于突變檢測(cè)的技術(shù)包括有基因芯片、TaqMan(熒光基團(tuán)雙標(biāo)記水解寡核苷酸探針)、Molecular Beacon(即分子信標(biāo)，是一個(gè)發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)的特異寡核苷酸探針，其環(huán)狀區(qū)核苷酸序列與靶核酸互補(bǔ)，靠近兩端的部分序列互補(bǔ)構(gòu)成分子信標(biāo)的莖部，兩末端分別標(biāo)記熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán))、LCR(連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))、酶切RFLP、熔點(diǎn)曲線以及SSCP、基因測(cè)序等傳統(tǒng)方法，但除我們特別設(shè)計(jì)的TaqMan探針和特異性引物檢測(cè)體系外，僅有測(cè)序、熔點(diǎn)曲線、基因芯片和PCR-Elisa在部分科研領(lǐng)域和臨床得以應(yīng)用，而且它們都有各自的缺陷，廣泛的應(yīng)用受到限制。
測(cè)序法一度被視為突變檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。但一方面，測(cè)序反應(yīng)靈敏度低導(dǎo)致假陰性率較高。另一方面，由于HBV耐藥菌與敏感菌常共存于患者血清中，對(duì)于HBV耐藥突變基因的檢測(cè)，該方法有致命的缺陷。椐了解，當(dāng)耐藥株低于50％時(shí)，隨耐藥毒株比例的下降，基因測(cè)序的假陰性率迅猛增高，而實(shí)際臨床中，當(dāng)耐藥毒株占總病毒10％以上時(shí)，拉米夫定已對(duì)該患者失去了療效。
基因芯片是近年新起的一項(xiàng)技術(shù)，在高通量等方面有著其他技術(shù)無與倫比的優(yōu)勢(shì)，但重復(fù)性差、易污染、操作復(fù)雜的缺點(diǎn)及其昂貴的價(jià)格也使這項(xiàng)技術(shù)的推廣受到嚴(yán)重制約，特別是對(duì)于突變位點(diǎn)不多的HBV耐藥基因的檢測(cè)。
熔點(diǎn)曲線法是利用特異性探針與靶序列結(jié)合，分析Tm值改變的原理進(jìn)行突變。它具有很多TaqMan的優(yōu)勢(shì)，包括操作簡便、成本低廉、靈敏度高等特點(diǎn)，但熔點(diǎn)曲線法有個(gè)顯著的特點(diǎn)，就是特異性差，也就是說熔點(diǎn)曲線法無法正確區(qū)分待檢基因突變和臨近位點(diǎn)突變，該技術(shù)只能應(yīng)用在附近區(qū)域非常保守的突變檢測(cè)。HBV P基因?yàn)橥蛔兏甙l(fā)區(qū)域，除導(dǎo)致耐藥的550位密碼子發(fā)生YIDD和YVDD突變外，附近還有很多不導(dǎo)致耐藥的基因突變。熔點(diǎn)曲線法應(yīng)用在該項(xiàng)目上勢(shì)必造成較高的假陽性率。另外，針對(duì)HBV耐藥毒株與敏感毒株共存問題，熔點(diǎn)曲線也無法對(duì)敏感株和耐藥株的比例關(guān)系進(jìn)行準(zhǔn)確鑒別，在臨床上不能正確指導(dǎo)用藥。
PCR-ELISA法，雖價(jià)格便宜，但煩瑣的操作步驟及容易污染的特點(diǎn)已漸漸不為人們接受，另外，對(duì)于耐藥共生的情況，PCR-ELISA也不能作出正確判斷。
TaqMan PCR技術(shù)作為一種快速診斷技術(shù)，具有特異性高、靈敏度高、操作簡便且價(jià)格較便宜等優(yōu)點(diǎn)，已在科研和臨床上得到廣泛的應(yīng)用。使用常規(guī)TaqMan技術(shù)進(jìn)行HBV耐藥基因檢測(cè)設(shè)計(jì)，由于550位點(diǎn)兩種突變的位置相隔很近(中間只各1個(gè)堿基)，不利于設(shè)計(jì)引物，同時(shí)，需合成較多簡并引物以提高檢出率，成本較高，反應(yīng)體系也很難穩(wěn)定，并且與其他技術(shù)一樣無法對(duì)病毒的共生關(guān)系進(jìn)行準(zhǔn)確判斷。所以，盡管TaqMan PCR技術(shù)已成功應(yīng)用在如HBV定量等多項(xiàng)研究中，但使用本發(fā)明類似的技術(shù)方案在乙肝病毒耐藥檢測(cè)研究中的應(yīng)用國內(nèi)外尚未見報(bào)道，更未有引入ΔCt值概念對(duì)耐藥毒株與敏感型病毒株間的共存關(guān)系進(jìn)行半定量分析的報(bào)道。
目前現(xiàn)有的技術(shù)對(duì)準(zhǔn)確掌握患者血清中YMDD、YIDD和YVDD的動(dòng)態(tài)變化，進(jìn)一步指導(dǎo)臨床用藥沒有理想的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)拉米夫定耐藥HBV DNA的方法及試劑盒，以克服現(xiàn)有技術(shù)對(duì)耐藥毒株和敏感毒株的檢出率低，成本較高和反應(yīng)體系不穩(wěn)定的缺陷。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是提供一種檢測(cè)拉米夫定耐藥HBV DNA的方法，即在PCR過程中使用以下多聚核苷酸引物1(上游引物)5’TGTATTCCCATCCCATCATCCT 3’、引物2(HBV檢測(cè)引物1)5’ATGTTGTACAGATTTGGTCCC 3’、引物3(HBV檢測(cè)引物2)5’TTGGCTTCCAGTACCACATCATC 3’、引物4(YIDD檢測(cè)引物1)5’CCCCAGTACCACATCATCA 3’、引物5(YIDD檢測(cè)引物2)5’CCCAGAACCACATCATCA 3’、引物6(YVDD檢測(cè)引物1)5’CCCAGTACCACATCATTCAC 3’、引物7(YVDD檢測(cè)引物2)5’CCCAGAACCACATCATTCAC 3’、探針15’TCCTATGGGAGTGGGCCTCAG 3’、探針25’CCATTTGTTCGGTGGTTCGTAG 3’、探針3(I)5’ACCACATCATCAATATAACTGAAAGCC 3’、或探針4(V)5’ACCACATCATCCACATAACTGAAAGC 3’、或者與上述序列同源性大于75％的序列、或者上述所有序列的堿基互補(bǔ)序列，使用其中的任意一種或一種以上的組合。
提供上述的檢測(cè)拉米夫定耐藥HBV DNA的方法的一種優(yōu)選方案，即標(biāo)記上述探針的熒光發(fā)光基團(tuán)為FAM、TET、JOE、Cy3、Cy5、Cy5.5、Fluorescein、Rhodamine、RhodamineRed、Rhodamine Green、Rhodamine 6G、Oregon Green 488、Oregon Green 500、OregonGreen 514、Texas Red、TAMRA、Inosine、HEX、FITC、Acridine orange、或ROX中的任意一種或一種以上的組合；熒光淬滅基團(tuán)為DABCYL、DABSYL、TAMRA、BHQ-1、BHQ-2或BHQ-3中的任意一種或一種以上的組合。
提供上述的檢測(cè)拉米夫定耐藥HBV DNA的方法的另一種優(yōu)選方案，即在上述各探針序列經(jīng)添加互補(bǔ)臂形成的分子信標(biāo)探針。
本發(fā)明還提供上述引物和探針在PCR反應(yīng)過程中的使用方法，即分三管在同一時(shí)間運(yùn)行同一PCR擴(kuò)增程序，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)，三管均使用探針1、探針2中任一探針和引物1，并分別添加其他相應(yīng)引物，序列分別為第一管(C反應(yīng)管)引物2或引物3；第二管(I反應(yīng)管)引物4和引物5；第三管(V反應(yīng)管)引物6和引物7。
或者，用另一種使用方法為，分三管在同一時(shí)間運(yùn)行同一PCR擴(kuò)增程序，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)，三管均使用引物1和引物2并分別添加相應(yīng)探針，序列分別為第一管(C反應(yīng)管)探針1或探針2；第二管(I反應(yīng)管)探針3；第三管(V反應(yīng)管)探針4。
本發(fā)明還提供上述技術(shù)方案中任意一種的檢測(cè)拉米夫定耐藥HBV DNA的方法的結(jié)果數(shù)據(jù)處理方案，即根據(jù)I反應(yīng)管檢測(cè)Ct值(Ct-i)與C反應(yīng)管檢測(cè)的Ct值(Ct-c)的差值(ΔCt-i＝Ct-i-Ct-c)(其中，Ct值的“C”代表Cycle，“t”代表threshold，其含義是每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))、V反應(yīng)管檢測(cè)Ct值(Ct-v)與C反應(yīng)管檢測(cè)的Ct值(Ct-c)的差值(ΔCt-v＝Ct-v-Ct-c)，由此分別判斷樣本里HBV病毒中DNA發(fā)生YIDD突變和發(fā)生YVDD突變的病毒相對(duì)量，最終判斷樣本里病毒的耐藥情況。
在上述檢測(cè)拉米夫定耐藥HBV DNA方法的基礎(chǔ)上，本發(fā)明進(jìn)一步提供一種檢測(cè)試劑盒1，其組成包括核酸提取試劑核酸擴(kuò)增試劑，其組成包括C反應(yīng)液
I反應(yīng)液V反應(yīng)液熒光探針耐熱DNA聚合酶對(duì)照品I/V陽性對(duì)照品陰性對(duì)照品其中，C反應(yīng)液使用的引物序列為引物1、引物2或(和)引物3；I反應(yīng)液使用的引物序列為引物1、引物4和引物5；V反應(yīng)液使用的引物序列為引物1、引物6和引物7；熒光探針序列為探針1，其5`端用FAM標(biāo)記，其3`端用TAMRA標(biāo)記。
PCR運(yùn)行程序反應(yīng)管先在50℃反應(yīng)2分鐘，然后95℃保溫5分鐘，再按94℃20秒→53℃30秒循環(huán)40次。
在上述檢測(cè)拉米夫定耐藥HBV DNA方法的基礎(chǔ)上，本發(fā)明進(jìn)一步提供一種檢測(cè)試劑盒2，其組成包括核酸提取試劑核酸擴(kuò)增試劑PCR反應(yīng)液熒光標(biāo)記探針A熒光標(biāo)記探針B熒光標(biāo)記探針C耐熱DNA聚合酶對(duì)照品I/V陽性對(duì)照品陰性對(duì)照品其中，PCR反應(yīng)液使用的引物序列為引物1、引物2；熒光標(biāo)記探針A序列為探針1或和探針2；熒光標(biāo)記探針B序列為探針3；熒光標(biāo)記探針C序列為探針4；熒光標(biāo)記探針序列的5`端均用FAM標(biāo)記、3`端均用TAMRA標(biāo)記。
PCR運(yùn)行程序反應(yīng)管先在50℃反應(yīng)2分鐘，然后95℃保溫5分鐘，再按94℃20秒→53℃30秒 循環(huán)40次本發(fā)明還提供在三個(gè)PCR管中，通過相同的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)程序，對(duì)同一樣本進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)后的結(jié)果處理方法C反應(yīng)管使用HBV病毒DNA特異性檢測(cè)引物及相應(yīng)探針，或使用HBV病毒DNA特異性檢測(cè)探針及相應(yīng)引物，能擴(kuò)增所有型別的HBV DNA，其Ct值反映樣本中總的HBV病毒DNA的濃度；I反應(yīng)管使用YIDD特異性突變檢測(cè)引物及相應(yīng)探針或使用YIDD特異性突變檢測(cè)探針及相應(yīng)引物，能特異性擴(kuò)增擴(kuò)增YIDD突變的DNA而因其3`端與YVDD突變的基因序列不同，退火溫度(表現(xiàn)為Tm值)低于PCR擴(kuò)增過程中的退火溫度而不能進(jìn)行延伸，因此不能產(chǎn)生熒光信號(hào)。其Ct值反映樣本中HBV病毒發(fā)生YIDD突變DNA的濃度；同樣，V反應(yīng)管使用YVDD特異性突變檢測(cè)引物及相應(yīng)探針或使用YVDD特異性突變檢測(cè)探針及相應(yīng)引物，只能擴(kuò)增YVDD突變的DNA，其Ct值反映樣本中HBV病毒發(fā)生YVDD突變DNA的濃度；根據(jù)I反應(yīng)管檢測(cè)Ct值(Ct-i)、V反應(yīng)管檢測(cè)Ct值(Ct-v)分別與C反應(yīng)管檢測(cè)的Ct值(Ct-c)差值(ΔCt-i＝Ct-i-Ct-c，ΔCt-v＝Ct-v-Ct-c)可以對(duì)臨床樣本中HBV病毒發(fā)生YVDD和YIDD耐藥突變情況進(jìn)行判斷。
由于臨床上一般將耐藥病毒占總乙肝病毒10％作為耐藥與否的判斷標(biāo)準(zhǔn)，本發(fā)明根據(jù)大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)定如下判斷標(biāo)準(zhǔn)

其中進(jìn)行判斷的前提是總HBV病毒含量在本發(fā)明靈敏度之上，也即HBV總量檢測(cè)管Ct值Ct-c≤35時(shí)才對(duì)耐藥情況進(jìn)行判斷。該方法不僅能從血清中檢測(cè)出500拷貝/ml以上的HBV病毒，并能正確區(qū)分YIDD突變和YVDD突變。
本發(fā)明與現(xiàn)有HBV DNA拉米夫定耐藥檢測(cè)方法相比，具有以下有益的技術(shù)效果通過精心設(shè)計(jì)檢測(cè)反應(yīng)，優(yōu)化設(shè)計(jì)引物和探針序列，針對(duì)每種突變基因只需要兩條簡并引物即可對(duì)所有已報(bào)道的非耐藥突變基因進(jìn)行檢測(cè)，且不影響耐藥判斷，對(duì)739A→G和741G→T兩種耐藥突變檢出率達(dá)100％，同時(shí)由于TaqMan技術(shù)已成功應(yīng)用于HBV DNA等定量項(xiàng)目，本發(fā)明的三管反應(yīng)體系均使用同一上游引物和探針，下游引物間的差異也比較小，有利于使三管的擴(kuò)增效率達(dá)到一致，因此引入ΔCt值概念對(duì)耐藥毒株與敏感型病毒株間的共存關(guān)系進(jìn)行半定量分析。更準(zhǔn)確掌握患者血清中YMDD、YIDD和YVDD的動(dòng)態(tài)變化，進(jìn)一步指導(dǎo)臨床用藥。
本發(fā)明采用公用引物或公用熒光探針，合理改造特異性探針或引物，分三管對(duì)HBV拉米夫定耐藥基因突變進(jìn)行檢測(cè)，即檢測(cè)總的HBV病毒濃度和分別檢測(cè)兩種發(fā)生基因突變的HBV病毒濃度，PCR擴(kuò)增條件趨于統(tǒng)一。在保證高檢出率的同時(shí)，減少了簡并引物的數(shù)量，從而減少了因引物合成的批間差導(dǎo)致的產(chǎn)品性能的不穩(wěn)定，提高了實(shí)驗(yàn)、生產(chǎn)、質(zhì)檢及臨床使用的穩(wěn)定性，同時(shí)也降低了生產(chǎn)成本。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1設(shè)計(jì)和制備引物、探針序列(針對(duì)HBV DNA P基因相關(guān)序列設(shè)計(jì)，GeneBank序列號(hào)為AF536524，下同)引物1(上游引物)5’TGTATTCCCATCCCATCATCCT 3’、引物2(HBV檢測(cè)引物1)5’ATGTTGTACAGATTTGGTCCC 3’、引物3(HBV檢測(cè)引物2)5’TTGGCTTCCAGTACCACATCATC 3’、引物4(YIDD檢測(cè)引物1)5’CCCCAGTACCACATCATCA 3’、引物5(YIDD檢測(cè)引物2)5’CCCAGAACCACATCATCA 3’、引物6(YVDD檢測(cè)引物1)5’CCCAGTACCACATCATTCAC 3’、引物7(YVDD檢測(cè)引物2)5’CCCAGAACCACATCATTCAC 3’、探針1 5’TCCTATGGGAGTGGGCCTCAG 3’、探針1的熒光標(biāo)記為熒光發(fā)光基團(tuán)FAM、TET、JOE、Cy3、Cy5、Cy5.5、Fluorescein、Rhodamine、Rhodamine Red、Rhodamine Green、Rhodamine 6G、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、Texas Red、TAMRA、Inosine、HEX、FITC、Acridine orange、或ROX中的一種或其組合；熒光淬滅基團(tuán)為DABCYL、DABSYL、TAMRA、BHQ-1、BHQ-2或BHQ-3中的一種或其組合。乙型肝炎病毒(HBV)拉米夫定耐藥熒光PCR檢測(cè)試劑盒組成組成成分(10人份/盒) 體積提取液A 500μl×1管提取液B 500μl×1管C反應(yīng)液 280μl×1管
I反應(yīng)液 280μl×1管V反應(yīng)液 280μl×1管熒光探針 180μl×1管MgCl2溶液 240μl×1管Taq酶(含0.67U/μlTaq酶和0.02U/μlUNG酶) 90μl×1管I/V陽性對(duì)照品20μl×1管陰性對(duì)照品 50μl×1管試劑盒中三種反應(yīng)液配方

核酸提取試劑配方為提取液A8％聚乙二醇、1mol/LNaCl提取液B10mmol/L NaOH、0.1％SDS、15％Chelex-100、1％Tween-20I/V陽性對(duì)照品為人工合成的YIDD突變和YVDD突變DNA片段等濃度混合液。使用方法1、HBV DNA提取取待測(cè)血清樣本50μl，加入50μl核酸提取液A。振蕩混勻15s。13,000rpm離心10min，棄上清。加入充分混勻的核酸提取液B 50μl，振蕩混勻，100℃水浴10min，13,000rpm離心3min。取上清供PCR擴(kuò)增用。
2、熒光PCR檢測(cè)按樣本數(shù)[樣本數(shù)＝標(biāo)本數(shù)+質(zhì)控品(1)+陰性對(duì)照]n分別配制三管反應(yīng)液<C管>取C反應(yīng)液n×28ul、MgCl2n×8ul、熒光探針n×6ul、Taq酶n×3ul混于一離心管中混勻<I管>取I反應(yīng)液n×28ul、MgCl2n×8ul、熒光探針n×6ul、Taq酶n×3ul混于一離心管中混勻<V管>取V反應(yīng)液n×28ul、MgCl2n×8ul、熒光探針n×6ul、Taq酶n×3ul混于一離心管中混勻三種反應(yīng)液均按45μl/管分裝到反應(yīng)管中，取質(zhì)控品、待測(cè)樣本DNA抽提產(chǎn)物及陰性對(duì)照各5μl依次加入上述三種反應(yīng)液中，蓋緊反應(yīng)管，低速離心數(shù)秒。置全自動(dòng)熒光檢測(cè)儀上運(yùn)行如下PCR程序反應(yīng)管先在50℃反應(yīng)2分鐘，然后95℃保溫5分鐘，再按94℃20秒→53℃30秒 循環(huán)40次。
實(shí)施例2設(shè)計(jì)和制備引物、探針序列引物1(上游引物)5’TGTATTCCCATCCCATCATCCT 3’、引物2(HBV檢測(cè)引物1)5’ATGTTGTACAGATTTGGTCCC 3’、探針15’TCCTATGGGAGTGGGCCTCAG 3’、探針3(I)5’ACCACATCATCAATATAACTGAAAGCC 3’、探針4(V)5’ACCACATCATCCACATAACTGAAAGC 3’、探針1、3、4的熒光標(biāo)記分別可以為熒光發(fā)光基團(tuán)FAM、TET、JOE、Cy3、Cy5、Cy5.5、Fluorescein、Rhodamine、Rhodamine Red、Rhodamine Green、Rhodamine 6G、OregonGreen 488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、Texas Red、TAMRA、Inosine、HEX、FITC、Acridine orange、或ROX中的一種或其組合；熒光淬滅基團(tuán)為DABCYL、DABSYL、TAMRA、BHQ-1、BHQ-2或BHQ-3中的一種或其組合。
乙型肝炎病毒(HBV)拉米夫定耐藥熒光PCR檢測(cè)試劑盒組成組成成分(10人份/盒) 體積提取液A500μl×1管提取液B500μl×1管PCR反應(yīng)液 280μl×1管熒光探針1 180μl×1管熒光探針2 180μl×1管熒光探針3 180μl×1管MgCl2溶液 240μl×1管Taq酶(含0.67U/μlTaq酶和0.02U/μlUNG酶)90μl×1管I/V陽性對(duì)照品 20μl×1管陰性對(duì)照品 50μl×1管試劑盒中各組成配方

核酸提取試劑配方為提取液A8％聚乙二醇、1mol/LNaCl提取液B10mmol/L NaOH、0.1％SDS、15％Chelex-100、1％Tween-20使用方法1、HBV DNA提取取待測(cè)血清樣本50μl，加入50μl核酸提取液A。振蕩混勻15s。13,000rpm離心10min，棄上清。加入充分混勻的核酸提取液B 50μl，振蕩混勻，100℃水浴10min，13,000rpm離心3min。取上清供PCR擴(kuò)增用。
2、熒光PCR檢測(cè)按樣本數(shù)[樣本數(shù)＝標(biāo)本數(shù)+質(zhì)控品(1)+陰性對(duì)照]n分別配制三管反應(yīng)液<C管>取PCR反應(yīng)液n×28ul、MgCl2n×8ul、熒光探針1n×6ul、Taq酶n×3ul混于一離心管中混勻<I管>取PCR反應(yīng)液n×28ul、MgCl2n×8ul、熒光探針2n×6ul、Taq酶n×3ul混于一離心管中混勻<V管>取PCR反應(yīng)液n×28ul、MgCl2n×8ul、熒光探針3n×6ul、Taq酶n×3ul混于一離心管中混勻三種反應(yīng)液均按45μl/管分裝到反應(yīng)管中，取質(zhì)控品、待測(cè)樣本DNA抽提產(chǎn)物及陰性對(duì)照各5μl依次加入上述三種反應(yīng)液中，蓋緊反應(yīng)管，低速離心數(shù)秒。置全自動(dòng)熒光檢測(cè)儀上運(yùn)行如下PCR程序反應(yīng)管先在50℃反應(yīng)2分鐘，然后95℃保溫5分鐘，再按94℃20秒→53℃30秒 循環(huán)40次。
實(shí)施例3上述兩例實(shí)施方案使用相同的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法、結(jié)果判斷和質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)Ct-cC檢測(cè)管的Ct值；Ct-vV突變檢測(cè)管的Ct值；Ct-iI突變檢測(cè)管的Ct值；ΔCt-i＝Ct-i-Ct-c；ΔCt-v＝Ct-v-Ct-c。
質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)如試劑質(zhì)量完好且操作正確，相應(yīng)的結(jié)果應(yīng)當(dāng)滿足下表?xiàng)l件，否則實(shí)驗(yàn)無效，應(yīng)檢查儀器、試劑、擴(kuò)增條件等方面的誤差。

結(jié)果判斷YMDD突變判定表


患者血清中HBV病毒常為YMDD野生型和突變型共生。當(dāng)突變位點(diǎn)檢測(cè)管Ct值(Ct-i或Ct-v)為40時(shí)，表明樣本中無相應(yīng)的突變型病毒或其含量低于該試劑盒靈敏度。當(dāng)突變位點(diǎn)檢測(cè)管Ct≤35時(shí)，對(duì)于3.5＜ΔCt＜4.5的情況，總HBV數(shù)與相應(yīng)突變株的比例約為10∶1；對(duì)于6.5＜ΔCt＜8的情況，總HBV數(shù)與相應(yīng)突變株的比例約為100∶1；對(duì)于9.5＜ΔCt＜11的情況，總HBV數(shù)與相應(yīng)突變株的比例約為1000∶1。而灰區(qū)的界定由各實(shí)驗(yàn)室根據(jù)當(dāng)?shù)厝巳杭癏BV的分布狀況而定。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)拉米夫定耐藥HBV DNA的方法，其特征在于使用以下多聚核苷酸引物1 5’TGTATTCCCATCCCATCATCCT 3’、引物2 5’ATGTTGTACAGATTTGGTCCC 3’、引物3 5’TTGGCTTCCAGTACCACATCATC 3’、引物4 5’CCCCAGTACCACATCATCA 3’、引物5 5’CCCAGAACCACATCATCA 3’、引物6 5’CCCAGTACCACATCATTCAC 3’、引物7 5’CCCAGAACCACATCATTCAC 3’、探針1 5’TCCTATGGGAGTGGGCCTCAG 3’、探針2 5’CCATTTGTTCGGTGGTTCGTAG 3’、探針3 5’ACCACATCATCAATATAACTGAAAGCC 3’、或探針4 5’ACCACATCATCCACATAACTGAAAGC 3’、或者與上述序列同源性大于75％的序列、或者上述所有序列的堿基互補(bǔ)序列，使用其中的任意一種或一種以上的組合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)拉米夫定耐藥HBV DNA的方法，其特征在于標(biāo)記探針的熒光發(fā)光基團(tuán)為FAM、TET、JOE、Cy3、Cy5、Cy5.5、Fluorescein、Rhodamine、RhodamineRed、Rhodamine Green、Rhodamine 6G、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、Texas Red、TAMRA、Inosine、HEX、FITC、Acridine orange、或ROX中的任意一種或一種以上的組合；熒光淬滅基團(tuán)為DABCYL、DABSYL、TAMRA、BHQ-1、BHQ-2或BHQ-3中的任意一種或一種以上的組合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)拉米夫定耐藥HBV DNA的方法，其特征在上述各探針序列經(jīng)添加互補(bǔ)臂形成的分子信標(biāo)探針。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)拉米夫定耐藥HBV DNA的方法，其特征在于分三個(gè)反應(yīng)管在同一時(shí)間運(yùn)行同一PCR擴(kuò)增程序進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)，三管均使用探針1、探針2中任一探針和引物1，并分別添加相應(yīng)引物分別為第一管引物2或引物3；第二管引物4和引物5；第三管引物6和引物7。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)拉米夫定耐藥HBV DNA的方法，其特征在于分三個(gè)反應(yīng)管在同一時(shí)間運(yùn)行同一PCR擴(kuò)增程序進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)，三管均使用引物1和引物2，并分別添加相應(yīng)探針分別為第一管探針1或探針2；第二管探針3；第三管探針4。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)拉米夫定耐藥HBV DNA的方法，其特征在于運(yùn)行如下PCR程序反應(yīng)管先在50℃反應(yīng)2分鐘，然后95℃保溫5分鐘，再按94℃20秒→53℃30秒循環(huán)40次。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)所述的檢測(cè)拉米夫定耐藥HBV DNA的方法，其特征在于根據(jù)第二管與第一管檢測(cè)的Ct值的差值、第三管與第一管檢測(cè)的Ct值的差值分別判斷樣本中HBV DNA發(fā)生YIDD突變和發(fā)生YVDD突變的病毒相對(duì)量。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的檢測(cè)拉米夫定耐藥HBV DNA的試劑盒，其特征在于所述的試劑盒組成包括核酸提取試劑、C反應(yīng)液、I反應(yīng)液和V反應(yīng)液、熒光標(biāo)記探針、耐熱DNA聚合酶和對(duì)照品；其中，C反應(yīng)液使用的引物序列為引物1、引物2和或引物3；I反應(yīng)液使用的引物序列為引物1、引物4和引物5；V反應(yīng)液使用的引物序列為引物1、引物6和引物7；熒光標(biāo)記探針序列為5`端用FAM標(biāo)記、3`端用TAMRA標(biāo)記的探針1。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-3或5中任意一項(xiàng)所述的檢測(cè)拉米夫定耐藥HBV DNA的試劑盒，其特征在于所述的試劑盒組成包括核酸提取試劑、PCR反應(yīng)液、熒光標(biāo)記探針A、熒光標(biāo)記探針B、熒光標(biāo)記探針C、耐熱DNA聚合酶和對(duì)照品；其中，PCR反應(yīng)液使用的引物序列為引物1、引物2；熒光標(biāo)記探針A序列為探針1或和探針2；熒光標(biāo)記探針B序列為探針3；熒光標(biāo)記探針C序列為探針4；熒光標(biāo)記探針序列的5`端均用FAM標(biāo)記、3`端均用TAMRA標(biāo)記。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)HBV DNA的方法及其試劑盒，特別是涉及拉米夫定耐藥性的檢測(cè)。根據(jù)耐藥相關(guān)兩種主要的突變基因(YMDD突變?yōu)閅VDD和YIDD)設(shè)計(jì)特異性突變檢測(cè)引物和病毒特異性引物及公用的配套探針，或設(shè)計(jì)特異性突變檢測(cè)探針和病毒特異性檢測(cè)探針，分別在三個(gè)PCR管中通過相同的PCR程序?qū)ν粯颖具M(jìn)行實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)。根據(jù)I反應(yīng)管、V反應(yīng)管檢測(cè)Ct值分別與C反應(yīng)管檢測(cè)Ct值的差值(ΔCt－i＝Ct－i－Ct－c，ΔCt－v＝Ct－v－Ct－c)，對(duì)臨床樣本中HBV病毒發(fā)生YVDD和YIDD耐藥突變情況進(jìn)行判斷。本發(fā)明的試劑盒性能穩(wěn)定、靈敏度高于測(cè)序，能更精確判斷耐藥和敏感病毒的共存比例關(guān)系，適用于對(duì)耐藥病毒和總病毒數(shù)量關(guān)系進(jìn)行半定量分析。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1710098SQ200410025199
公開日2005年12月21日 申請(qǐng)日期2004年6月16日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月16日
發(fā)明者何劍軍, 周煜, 夏懿 申請(qǐng)人:上海復(fù)星醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司