本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株具有鼠傷寒沙門氏菌防治效果的噬菌體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

鼠傷寒沙門氏菌(salmonellatyphimurium)是一群非適應(yīng)性或泛嗜性的沙門氏菌，具有廣泛的宿主，是目前世界各國分離率最高的菌型之一。能引起各種家禽、犬、貓的副傷寒，表現(xiàn)為胃腸炎或敗血癥；在牛、羊和馬中引起流產(chǎn)和急性胃腸炎；也可引起人類食物中毒。目前世界上最大的一起沙門氏菌食物中毒是1953年于瑞典由豬肉中的沙門氏菌引起的，造成7717人中毒，90人死亡。因此，對鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)行防治具有重要的公共衛(wèi)生意義。

目前，預(yù)防和控制鼠傷寒沙門氏菌最常用的方法是使用抗生素，但是隨著抗生素的濫用，鼠傷寒沙門氏菌的耐藥性不斷增強(qiáng)，已成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。因此，亟需研究開發(fā)一種新型的產(chǎn)品，以解決抗生素濫用導(dǎo)致的細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)問題。

噬菌體是一類細(xì)菌性病毒，其中裂解性噬菌體在感染宿主菌后能快速復(fù)制、增殖，并最終裂解細(xì)菌從而達(dá)到抗菌效果。早在1917年，法裔加拿大微生物學(xué)家felixdherelle首次發(fā)現(xiàn)噬菌體后，科學(xué)界就一直嘗試將其用于治療人或動物的細(xì)菌性感染；2013年2月由美國intralytix公司研發(fā)的針對沙門菌的噬菌體制劑salmofreshtm被美國食品藥品監(jiān)督管理局(fda)認(rèn)定為公認(rèn)安全級產(chǎn)品(gras)，并獲批準(zhǔn)上市。隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人們對動物性食品安全問題廣泛關(guān)注，噬菌體作為一種天然綠色、安全有效的抗生素替代品，具有廣闊的應(yīng)用前景。

然而，大多數(shù)噬菌體生物控制研究集中在大腸桿菌、李斯特氏菌和梭菌的控制上，而針對鼠傷寒沙門氏菌能夠進(jìn)行特異性防治的噬菌體的相關(guān)報道較少。因此，開發(fā)新型對鼠傷寒沙門氏菌具有防治效果的噬菌體具有十分重要的意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的是提供一株具有鼠傷寒沙門氏菌防治效果的噬菌體。

本發(fā)明的另一目的是提供該噬菌體在殺滅畜禽體內(nèi)、畜禽體表、畜禽飼料、養(yǎng)殖器具或養(yǎng)殖空間環(huán)境中的鼠傷寒沙門氏菌中的用途。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明的第一方面，提供一株具有鼠傷寒沙門氏菌防治效果的噬菌體，所述噬菌體的分類命名為鼠傷寒沙門氏菌噬菌體(salmonellatyphimuriumphage)φsa-1，已于2017年4月28日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為cctccm2017217，地址：中國武漢，武漢大學(xué)。

本發(fā)明的噬菌體分離自糞液污水，噬菌體的形態(tài)特征為：該噬菌體具有呈正多面體的頭部結(jié)構(gòu)，沒有尾部，頭部直徑約65nm，應(yīng)屬于復(fù)層噬菌體科(tectiviridae)；噬菌體株在固體培養(yǎng)基上可以形成較大空斑，周圍有暈環(huán)，邊緣清晰規(guī)則，直徑為2～3mm。

上述的噬菌體在制備用于預(yù)防和/或治療由鼠傷寒沙門氏菌引起的感染性疾病的藥物中的用途也是本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明的第二方面，提供一種用于預(yù)防和/或治療由鼠傷寒沙門氏菌引起的感染性疾病的組合物，其包含上述的噬菌體作為有效成分。

上述組合物可以以本發(fā)明的噬菌體作為唯一活性成分；還可以含有除本發(fā)明的噬菌體以外的其他噬菌體，其與本發(fā)明的噬菌體復(fù)配使用可以得到與之相當(dāng)或者更好的防治鼠傷寒沙門氏菌的效果。

上述組合物可以被制備成各種使用形式，如液體制劑、凍干制劑或口服固體制劑等，經(jīng)口服、噴霧或注射等方式用于殺滅鼠傷寒沙門氏菌。

本發(fā)明的第三方面，提供包含上述噬菌體作為有效成分的飼料添加劑、飲用水添加劑、飼料、飲用水、清潔劑或消毒劑。

本發(fā)明的第四方面，提供利用上述噬菌體或包含上述噬菌體作為活性成分的組合物來預(yù)防和/或治療由鼠傷寒沙門氏菌引起的感染性疾病的方法。

上述技術(shù)方案具有如下有益效果：

本發(fā)明的噬菌體對鼠傷寒沙門氏菌具有特異性的殺傷活性，能夠選擇性的殺死特定的致病菌，而不會殺死有益細(xì)菌，不會引起藥物的抗性。

本發(fā)明的噬菌體具有優(yōu)異的耐酸性和耐熱性，可以被制備成飼料添加劑、飲用水添加劑、飼料、飲用水、清潔劑或消毒劑各種形式的產(chǎn)品，能夠在較廣的溫度范圍和ph條件下對鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)行殺滅。

附圖說明

構(gòu)成本申請的一部分的說明書附圖用來提供對本申請的進(jìn)一步理解，本申請的示意性實施例及其說明用于解釋本申請，并不構(gòu)成對本申請的不當(dāng)限定。

圖1為噬菌體φsa-1電鏡圖；

圖2為噬菌體φsa-1雙層平板；

圖3為不同溫度對噬菌體φsa-1的作用結(jié)果；

圖4為不同ph條件對噬菌體φsa-1的作用結(jié)果；

圖5為噬菌體φsa-1一步生長曲線圖；

圖6為噬菌體φsa-1對小鼠鼠傷寒沙門氏菌感染的預(yù)防和治療效果。

具體實施方式

應(yīng)該指出，以下詳細(xì)說明都是示例性的，旨在對本發(fā)明提供進(jìn)一步的說明。除非另有指明，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。

需要注意的是，這里所使用的術(shù)語僅是為了描述具體實施方式，而非意圖限制根據(jù)本發(fā)明的示例性實施方式。如在這里所使用的，除非上下文另外明確指出，否則單數(shù)形式也意圖包括復(fù)數(shù)形式，此外，還應(yīng)當(dāng)理解的是，當(dāng)在本說明書中使用術(shù)語“包含”和/或“包括”時，其指明存在特征、步驟、操作和/或它們的組合。

正如背景技術(shù)所介紹的，針對目前禽業(yè)養(yǎng)殖中鼠傷寒沙門氏菌引起的疾病并沒有有效的控制措施?；诖耍景l(fā)明提出了一株具有鼠傷寒沙門氏菌防治效果的噬菌體及其應(yīng)用。

在本發(fā)明的一種實施方案中，提供了對鼠傷寒沙門氏菌具有特異性殺傷活性的新型噬菌體。

噬菌體是能夠感染特定細(xì)菌并抑制細(xì)菌生長的細(xì)菌特異性病毒，并且是包含單鏈或雙鏈脫氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)作為遺傳物質(zhì)的病毒。

具體而言，本發(fā)明的噬菌體是由發(fā)明人分離自糞液污水的新型噬菌體，該噬菌體具有呈正多面體的頭部結(jié)構(gòu)，沒有尾部，頭部直徑約65nm，應(yīng)屬于復(fù)層噬菌體科；噬菌體株在固體培養(yǎng)基上可以形成較大空斑，周圍有暈環(huán)，邊緣清晰規(guī)則，直徑為2～3mm。已于2017年4月28日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為cctccm2017217，地址：中國武漢，武漢大學(xué)。

在本發(fā)明的另一種實施方案中，提供了一種用于預(yù)防和/或治療由鼠傷寒沙門氏菌引起的感染性疾病的組合物，其包含上述的噬菌體作為有效成分。

由于本發(fā)明的噬菌體展現(xiàn)了能夠特異性的殺死鼠傷寒沙門氏菌的抗菌活性，因此，本發(fā)明的噬菌體能夠用于預(yù)防和/或治療由鼠傷寒沙門氏菌的感染引起的疾病。

本文中，術(shù)語“預(yù)防”指的是通過給動物施用噬菌體作為有效成分的組合物抑制相應(yīng)疾病或者延緩相應(yīng)疾病發(fā)生的所有措施。

本文中，術(shù)語“治療”指的是通過給動物施用噬菌體作為有效成分的組合物改善或減輕感染性疾病的癥狀的所有措施。

本文中，術(shù)語“鼠傷寒沙門氏菌引起的感染性疾病”指的是鼠傷寒沙門氏菌感染后的癥狀，如發(fā)燒、頭疼、腹瀉和嘔吐等。

本實施方案中，用于預(yù)防和/或治療由鼠傷寒沙門氏菌引起的感染性疾病的組合物中，噬菌體的含量為3×10⁹pfu/ml。

根據(jù)該實施方案，本發(fā)明的組合物中還可以包含其他非致病性的噬菌體，與本發(fā)明的噬菌體復(fù)配使用，以達(dá)到對鼠傷寒沙門氏菌更好的殺滅效果。

本發(fā)明的又一種實施方案中，提供飼料添加劑或飲用水添加劑，其包含本發(fā)明的噬菌體為有效成分。

飼料用添加劑或飲用水用添加劑可以通過如下來使用：使用本發(fā)明的噬菌體或包含其的組合物單獨(dú)制備飼料用添加劑或飲用水用添加劑，并將飼料或飲用水與添加劑混合，或者在制備飼料或飲用水的過程中直接添加本發(fā)明的噬菌體或包含其的組合物。

本實施方案中，飼料用或飲用水用的添加劑的形式為：將所述的噬菌體制備成液體、凍干粉或藥片形式，單獨(dú)使用或與其他噬菌體復(fù)配后，經(jīng)口服、噴霧或注射等方式，用于殺滅畜禽體內(nèi)、畜禽體表、畜禽飼料、養(yǎng)殖器具或養(yǎng)殖空間環(huán)境中的鼠傷寒沙門氏菌。

在本發(fā)明的再一種實施方案中，提供通過向飼料或飲用水添加包含本發(fā)明的噬菌體作為有效成分的飼料用添加劑或飲用水用添加劑。

在該實施方式中使用的飼料不受特別限制，并且可以使用相關(guān)領(lǐng)域中常用的任何飼料；在該實施方式中使用的飲用水不受特別限制，并且可以使用相關(guān)領(lǐng)域中常用的任何飲用水。

在本發(fā)明的又一種實施方案中，提供包含本發(fā)明的噬菌體作為有效成分的消毒劑或清潔劑。消毒劑或清潔劑的劑型不受特別限制，并且可以使用相關(guān)領(lǐng)域中常用的任何劑型。

為了去除鼠傷寒沙門氏菌，可以將消毒劑噴灑于動物的住處、屠宰場，死亡區(qū)域、廚房和烹飪設(shè)備，但不限于此。

清潔劑可以被用于洗滌暴露于或有可能暴露于鼠傷寒沙門氏菌的動物的身體部位或真皮的表面上，但不限于此。

為了使得本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠更加清楚地了解本發(fā)明的技術(shù)方案，以下將結(jié)合具體的實施例詳細(xì)說明本發(fā)明的技術(shù)方案。

實施例1：噬菌體的分離制備

本發(fā)明中的糞液污水樣品采自山東省泰安市農(nóng)貿(mào)市場；

宿主菌為鼠傷寒沙門氏菌atcc14028。

在50ml離心管中裝入20mltris-hcl緩沖液，然后加入少量糞液污水樣品，4℃靜置過夜。將樣品以8000r/min離心10min去除雜質(zhì)，上清液4000r/min離心10min并以0.22μm微孔濾器過濾得到濾液并保存。

取上述20ml濾液加入20mltsb培養(yǎng)基中，再加入lml處于對數(shù)生長期的宿主菌懸液，混勻37℃振蕩培養(yǎng)過夜。次日8000r/min離心30min，取上清9ml加10mltsb培養(yǎng)基及宿主菌懸液0.3ml，室溫放置lh，37℃振蕩(180r/min)3h，取出后再次離心(12000r/min，30min)，將上清液0.3ml和0.3ml宿主菌懸液一并加入3ml45℃半固體培養(yǎng)基中，充分混勻后，傾倒于固體瓊脂培養(yǎng)基上制成雙層平板，放置37℃溫箱中孵育4-6h，觀察噬菌斑生長。

實施例2：噬菌體的擴(kuò)增培養(yǎng)和純化

用槍頭挑取直徑較大的噬菌斑，置于緩沖液中，4℃放置3h，用緩沖液作10倍梯度稀釋，雙層平板法作單斑培養(yǎng)。從其中挑直徑較大的單個噬菌斑于含宿主菌液(菌量約為10⁸cfu/ml)的液體tsb培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)6h作少量增殖，再用雙層平板法觀察噬菌斑的形態(tài)，重復(fù)操作3～5次后，即可得形狀和大小一致的噬菌斑。挑取單個噬菌斑置于緩沖液中，并將其轉(zhuǎn)接入3～5mltsb培養(yǎng)基中，加入噬菌體宿主菌液0.1ml，混勻，室溫作用15min，37℃培養(yǎng)10～14h，12000rpm，4℃，離心10min，取上清，加入0.3％氯仿。

取1ml新鮮培養(yǎng)的宿主菌，加0.1ml噬菌體裂解液(以單個噬菌體培養(yǎng)物與宿主菌分別按照1∶1、1∶10和1∶100的比例)，37℃溫育20min，使噬菌體顆粒吸附于宿主菌；加入100mltsb液體培養(yǎng)基，再加入cacl2母液至終濃度1mm，37℃搖振培養(yǎng)12～16h，12000rpm，4℃，離心10min，取上清，得到噬菌體裂解液。

在裂解液中分別加入rnasea、dnaseⅰ至1μg/ml，37℃溫育30min；加9.3gpeg8000，5.8gnacl，搖勻至溶解，冰浴1h或4℃過夜；4℃離心10000rpm10min，去上清液；加2mlsm液，充分洗滌管壁及沉淀，室溫作用1h；通過加入等體積的氯仿抽提，溫和振蕩30s；4℃，5000rpm離心10min以分離有機(jī)相和親水相，回收含有噬菌體顆粒的親水相，獲得純化的噬菌體，雙層平板檢測純化噬菌體(圖2)。

純化的噬菌體在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號為cctccm2017217，保藏日期為2017年4月28日，保藏單位地址：中國武漢市武漢大學(xué)，郵編430072。

該保藏的噬菌體具有以下微生物學(xué)特征：

1.形態(tài)學(xué)特性

在透射電子顯微鏡下觀察噬菌體顆粒(見圖1)，該噬菌體具有呈正多面體的頭部結(jié)構(gòu)，沒有尾部，頭部直徑約65nm，應(yīng)屬于復(fù)層噬菌體科。

2.培養(yǎng)學(xué)特性

噬菌體菌株在固體培養(yǎng)基上可以形成較大空斑，周圍有暈環(huán)，邊緣清晰規(guī)則，直徑為2～3mm(見圖2)。

實施例3：溫度及ph對噬菌體穩(wěn)定性的影響

各取0.5ml10⁹pfu/ml的噬菌體液于無菌ep管中，分別于30℃，40℃，50℃，60℃，70℃，80℃，90℃的水浴中作用60min，待作用時間結(jié)束后取樣，并立即將樣品置于水浴中冷卻，經(jīng)過稀釋后測定噬菌體的效價。結(jié)果見圖3，鼠傷寒沙門氏菌噬菌體φsa-1經(jīng)30℃、40℃、50℃、60℃處理1h后效價基本不變，70℃處理1h后效價下降了1個數(shù)量級，80℃處理1h后效價下降了2個數(shù)量級，90℃處理1h后全部失活。

取無菌ep管加入不同ph值(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11)的液體tsb900μl，然后將上述ep管置于37℃的水浴中，待溫度平衡后加入100μl10⁹pfu/ml的噬菌體液混勻，37℃作用2h。每管各取樣測定噬菌體的效價。結(jié)果見圖4，鼠傷寒沙門氏菌噬菌體φsa-1在ph值為2-10的范圍內(nèi)存活率較高，在ph值為1和11時全部失活，總體上來看鼠傷寒沙門氏菌噬菌體對ph值的耐受范圍比較寬。

實施例4：噬菌體φsa-1最佳感染復(fù)數(shù)實驗

培養(yǎng)宿主菌至對數(shù)生長期，按照感染復(fù)數(shù)分別為0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001的比例，加噬菌體液和宿主菌至液體tsb中，37℃振蕩培養(yǎng)3.5h，4000rpm離心30min去除菌體，測定上清液中噬菌體的滴度，以產(chǎn)生最高滴度的感染復(fù)數(shù)為最佳感染復(fù)數(shù)。結(jié)果見表1。噬菌體φsa-1在感染復(fù)數(shù)為0.0001時所產(chǎn)生子代噬菌體的滴度最高，為4.1×10¹⁰pfu/ml，表明噬菌體φsa-1最佳感染復(fù)數(shù)為0.0001。

表1φsa-1最佳感染復(fù)數(shù)試驗

實施例5：噬菌體φsa-1一步生長曲線測定

一步生長曲線的測定采用lur等改進(jìn)的方法。將噬菌體(3×10⁴pfu/ml)和宿主菌(3×10⁸cfu/ml)各400μl至40ml液體tsb中，37℃孵育10min，迅速置于37℃、180rpm振蕩培養(yǎng)，同時開始計時，在0時刻和每隔20min取樣，測定噬菌體的滴度。以感染時間為橫坐標(biāo)，噬菌體滴度為縱坐標(biāo)，繪制一步生長曲線。結(jié)果見圖5，噬菌體φsa-1感染宿主菌的潛伏期為20min左右，爆發(fā)時間為180min左右，爆發(fā)量為43333pfu/cell。爆發(fā)量＝爆發(fā)末期噬菌體滴度(1.3×10¹¹pfu/ml)/初期宿主菌濃度(3×10⁶cfu/ml)。

實施例6：噬菌體φsa-1寬宿主譜檢測

試驗選擇18株細(xì)菌(包括沙門氏菌、大腸桿菌、志賀氏菌)對噬菌體φsa-1的宿主譜進(jìn)行分析。具體操作如下：分別取18株細(xì)菌的過夜培養(yǎng)物100μl，滴加在1.5％tsb-ye平板(針對沙門氏菌)或1.5％lb平板(針對大腸桿菌和志賀氏菌)中央，用涂棒分別將它們涂制成均勻的菌苔。然后將每個平板平均分成兩個區(qū)域，其中一個區(qū)域，取10μl噬菌體φsa-1滴加在菌苔表面，另一個區(qū)域滴加10μl生理鹽水作對照，待液滴干燥后倒置于37℃培養(yǎng)12～16h，觀察結(jié)果。

結(jié)果表明(表2)：試驗選擇的細(xì)菌菌液在平板上均生長良好。滴加噬菌體φsa-1的區(qū)域在atcc13311生長的平板出現(xiàn)不長細(xì)菌的透明區(qū)域，并且對所收集的18株細(xì)菌中的10株有裂解作用，裂解率為55.55％。說明分離到的噬菌體φsa-1是一種寬宿主譜的噬菌體。

表2噬菌體φsa-1噬菌譜檢測

實施例7：噬菌體在小鼠上的安全性實驗

選用雌性balb/c小鼠(20～22克)20只，預(yù)飼兩天后隨機(jī)分為2組(噬菌體組、對照組)，每組10只。噬菌體組采用腹腔注射的方式接種0.3ml噬菌體φsa-1，劑量為2.25×10⁹pfu/kg；對照組接種0.3ml生理鹽水；連續(xù)觀察15d，分別在處理后第1天和第15天檢測小鼠盲腸內(nèi)噬菌體含量及內(nèi)臟情況。

觀察結(jié)果顯示，此劑量的噬菌體φsa-1對小鼠日常行為沒有影響，處理后第一天各組小鼠盲腸ph值相差不大(見表3)，噬菌體組盲腸內(nèi)容物噬菌體效價為1.6×10³pfu/g；處理后第十五天噬菌體組盲腸內(nèi)容物已檢測不到噬菌體的效價；說明噬菌體φsa-1進(jìn)入小鼠體內(nèi)后會逐漸排出體外，不會引起殘留。各組小鼠解剖檢查未見異常。

表3各組小鼠盲腸內(nèi)容物檢測結(jié)果

實施例8：鼠傷寒沙門氏菌atcc14028最小致死劑量的確定

選用雌性balb/c小鼠(20～22克)40只，共設(shè)4組，每組10只小鼠。每個試驗組分別腹腔注射0.3ml不同劑量的鼠傷寒沙門氏菌atcc14028(6.5×10⁸cfu/只；3.25×10⁸cfu/只；6.5×10⁷cfu/只)；對照組注射0.3ml的生理鹽水。定期觀察小鼠的死亡個數(shù)，將導(dǎo)致一組小鼠全部死亡的最小劑量定為最小致死量(mld)。

結(jié)果顯示，用高劑量(6.5×10⁸cfu/只)和中劑量(3.25×10⁸cfu/只)的鼠傷寒沙門氏菌腹腔感染小鼠時可以在3d內(nèi)使小鼠的死亡率達(dá)到100％，而當(dāng)腹腔注射低劑量(6.5×10⁷cfu/只)的鼠傷寒沙門氏菌時，小鼠的死亡率為60％。因此，可以確定鼠傷寒沙門氏菌的mld為3.25×10⁸cfu/只。

實施例9：噬菌體φsa-1對小鼠鼠傷寒沙門氏菌感染的預(yù)防和治療實驗

選用雌性balb/c小鼠(20～22克)40只，分為治療組(treatmentgroup)、陽性對照組(positivecontrolgroup)、預(yù)防組(preventivegroup)和空白對照組(blankcontrol)4組，每組10只。其中，治療組小鼠右側(cè)腹腔按3.25×10⁸cfu/只接種0.3ml鼠傷寒沙門氏菌atcc14028，5min后，對小鼠左側(cè)腹腔按10⁹pfu/只接種0.3ml噬菌體φsa-1；陽性對照組小鼠右側(cè)腹腔按3.25×10⁸cfu/只接種0.3ml鼠傷寒沙門氏菌atcc14028，左側(cè)腹腔接種0.3ml生理鹽水；預(yù)防組小鼠左側(cè)腹腔按10⁹pfu/只接種0.3ml噬菌體φsa-1，1個小時后對小鼠右側(cè)腹腔按3.25×10⁸cfu/只接種0.3ml鼠傷寒沙門氏菌atcc14028?？瞻讓φ战M小鼠左右側(cè)腹腔分別接種0.3ml生理鹽水。對小鼠進(jìn)行全天候監(jiān)視，觀察臨床表現(xiàn)，記錄死亡時間，統(tǒng)計存活率。試驗期為攻毒后的14天。

結(jié)果見圖6，處理14天后，陽性對照組小鼠存活率為0％，預(yù)防組小鼠存活率為90％，治療組小鼠存活率為80％。說明與陽性對照組相比，預(yù)防組和治療組都對小鼠抵抗沙門氏菌感染有一定的作用。其中預(yù)防組的效果要優(yōu)于治療組。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。