本發(fā)明屬于天然有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域，涉及一種降血糖活性成分植物胰島素科羅索酸的制備方法。

背景技術(shù)：

科羅索酸(corosolicacid)，2α-羥基熊果酸，商品名稱(chēng)：植物胰島素，是存在于大葉紫薇、枇杷、金蓮花等植物中的三萜類(lèi)化合物?？屏_索酸為白色無(wú)定型粉末，可溶于石油醚、苯、氯仿等有機(jī)溶劑，不溶于水，可溶于熱乙醇、甲醇。在無(wú)水條件下與強(qiáng)酸(硫酸、磷酸、高氯酸)、中強(qiáng)酸(三氯乙酸)或lewis氏酸(氯化鋅、三氯化鋁、三氯化銻)作用，會(huì)出現(xiàn)顏色反應(yīng)或熒光?？屏_索酸屬于α-香樹(shù)酯醇型或?yàn)跆K烷型五環(huán)三萜類(lèi)化合物，其基本骨架為多氫蒎的五環(huán)母核?？屏_索酸在植物體內(nèi)可游離存在，也可以皂苷的形式存在。在植物體內(nèi)，常常與其同分異構(gòu)體山楂酸共同存在，結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)相似，分離較難?？屏_索酸結(jié)構(gòu)式如下：

科羅索酸具有很強(qiáng)的生物活性，包括降血糖等。科羅索酸已進(jìn)入美國(guó)食品和藥物管理局的iii期臨床藥效學(xué)評(píng)價(jià)，作為食品補(bǔ)充劑已在國(guó)外得到認(rèn)可，在食品、保健品等工業(yè)中具有較好的發(fā)展前景?？屏_索酸的來(lái)源主要是從天然植物提取和有機(jī)合成。鞠建華等將枇杷葉采用95％的乙醇回流提取獲得乙醇提取物，后經(jīng)萃取、洗脫、低壓柱色譜分離得到科羅索酸。陳龍勝等研究了乙醇提取枇杷葉中科羅索酸的提取工藝?？v偉等從大葉紫薇葉中，采用薄層色譜分離方法得到科羅索酸。目前科羅索酸的分離制備往往采用反復(fù)柱層析等手段，缺乏快速、簡(jiǎn)便的方法，限制了其應(yīng)用。

中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)200710009556.7，陳劍鋒等報(bào)道了從枇杷葉中分離制備科羅索酸的方法，其做法是：采用80～100％親水性有機(jī)溶劑水溶液，于50～80℃提取總?cè)扑?，在堿性條件下，趁熱過(guò)濾除雜和活性炭脫色，枇杷葉提取液采用大孔吸附樹(shù)脂富集純化科羅索酸，活性炭脫色過(guò)程科羅索酸損失率較大，枇杷葉提取液粘度和水溶性雜質(zhì)含量很高，嚴(yán)重限制了大孔吸附樹(shù)脂對(duì)科羅索酸的吸附量和選擇性，導(dǎo)致科羅索酸總收率較小、生產(chǎn)總成本居高不下、制備的科羅索酸純度偏低。

中國(guó)專(zhuān)利200810071064.5，陳劍鋒報(bào)道了從植物中提制科羅索酸的方法，其包括水溶性物質(zhì)的水煮除雜、總?cè)扑岬膲A性有機(jī)溶劑提取和科羅索酸的大孔吸附樹(shù)脂富集純化步驟，該方法中的大孔吸附樹(shù)脂色譜法同樣存在科羅索酸總收率較小、生產(chǎn)總成本高等問(wèn)題。

高速逆流色譜法(high-speedcounter-currentchromatography，hsccc)是近幾十年來(lái)發(fā)展起來(lái)的液-液色譜分離技術(shù)，利用溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑中分配系數(shù)的不同，將不同物質(zhì)進(jìn)行有效分離。此項(xiàng)技術(shù)不需要固相載體，只需要被分離物在兩相中分配，避免了固相載體帶來(lái)的大量樣品吸附、損失與污染等問(wèn)題，樣品回收率高，預(yù)處理及后處理都簡(jiǎn)單易行，已廣泛應(yīng)用于分離。與其它分離方法相比，它不使用固相載體作固定相，能采用不同的溶劑系統(tǒng)和正反相洗脫方式，克服了固相載體帶來(lái)的樣品吸附、損失、污染、峰形拖尾等缺點(diǎn)。hsccc可采用不同物化特性的溶劑體系和多樣性的操作條件，具有較強(qiáng)的適應(yīng)性，為從復(fù)雜的天然產(chǎn)物粗制品中提取不同特性(如不同極性)的有效成分提供了有利條件。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)以上問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種操作簡(jiǎn)單，溶劑用量少，無(wú)樣品吸附、損失和污染，效率高的科羅索酸的制備方法。

本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種降血糖活性成分科羅索酸的分離制備方法，其特征在于，所述的方法具體步驟如下：

(1)將吳茱萸五加粉碎，按照液料比1∶5-15的比例加入溶劑，超聲提取，濃縮提取液，得到浸膏；

(2)上述浸膏溶于氫氧化鈉溶液中，除去不溶物，溶液經(jīng)酸中和后，乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯萃取液，濃縮回收溶劑，得到粗提物；

(3)將上述粗提物采用高速逆流色譜法分離。高速逆流色譜的兩相溶劑系統(tǒng)由烷烴、脂肪酯或醚、脂肪醇或脂肪酮和水體積比3-6∶3-7∶4-8∶4-6組成，將兩相溶劑系統(tǒng)按比例混勻靜置后，分開(kāi)上下相，超聲，選擇其中一相作為固定相，另一相作為流動(dòng)相，將固定相泵入管路，待充滿(mǎn)整個(gè)管路后，停泵，啟動(dòng)主機(jī)，然后以一定速度泵入流動(dòng)相，當(dāng)上下相平衡時(shí)，取步驟(2)制備的粗提物，溶解于固定相中，進(jìn)樣，紫外檢測(cè)器在線(xiàn)檢測(cè)，收集餾分減壓濃縮，結(jié)晶，干燥，得到科羅索酸。

步驟(1)中所述的提取溶劑為甲醇、乙醇、水或者其混合物。

吳茱萸五加為吳茱萸五加的干燥根、莖、葉子或其混合物。

吳茱萸五加為吳茱萸五加的干燥葉子。

步驟(3)中所述的烷烴為正己烷或環(huán)己烷，所述的脂肪酯為乙酸乙酯或乙酸甲酯，所述的醚為乙醚或石油醚，所述的脂肪醇為甲醇、乙醇、異丙醇或正丁醇；所述的脂肪酮為丙酮。

步驟(3)中兩相溶劑體系由正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水3-6∶3-7∶4-8∶4-6比例組成。

步驟(3)中兩相溶劑體系由正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水4∶5∶5.5∶6比例組成。

步驟(3)中的高速逆流色譜法的分離條件為：主機(jī)轉(zhuǎn)速750-1000rpm/min，流動(dòng)相流速1-15ml/min，水浴溫度10-40℃。

步驟(3)中的溶劑系統(tǒng)的上相為固定相，下相為流動(dòng)相。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下：

高速逆流色譜法(high-speedcounter-currentchromatography，hsccc)利用溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑中分配系數(shù)的不同，將不同物質(zhì)進(jìn)行有效分離。此項(xiàng)技術(shù)不需要固相載體，只需要被分離物在兩相中分配，避免了固相載體帶來(lái)的大量樣品吸附、損失與污染等問(wèn)題，樣品回收率高，預(yù)處理及后處理都簡(jiǎn)單易行，與其它分離方法相比，它不使用固相載體作固定相，能采用不同的溶劑系統(tǒng)和正反相洗脫方式，客服了固相載體帶來(lái)的樣品吸附、損失、污染、峰形拖尾等缺點(diǎn)。

本發(fā)明科羅索酸的分離制備方法具有操作簡(jiǎn)單，溶劑用量少，無(wú)樣品吸附、損失和污染，效率高等優(yōu)點(diǎn)，本分明的科羅索酸的分離制備方法可制備得到純度98％以上的科羅索酸。

附圖說(shuō)明

圖1高速逆流制備科羅索酸紫外檢測(cè)圖譜

圖2科羅索酸hplc圖譜

圖3科羅索酸¹h-nmr圖譜

圖4科羅索酸¹³c-nmr圖譜

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體情況對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式做詳細(xì)說(shuō)明。

實(shí)施例1

(1)取干燥的吳茱萸五加粉碎，按照液料比1∶10的比例加入甲醇，在超聲功率600w、40℃條件下，超聲提取20min，提取3次，減壓濃縮提取液，回收甲醇，得到浸膏；

(2)上述浸膏溶于ph＝10的氫氧化鈉溶液中，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝?，靜置，過(guò)濾，除去不溶物，溶液經(jīng)1mol/l鹽酸中和后，加入等量乙酸乙酯萃取3次，收集乙酸乙酯萃取液，濃縮回收溶劑，得到粗提物；

(3)將上述粗提物采用tbe-300a高速逆流色譜儀進(jìn)行分離。具體步驟為：在分液漏斗里配制正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水兩相溶劑體系，按體積比5∶4.5∶5∶5混合，振搖后靜置分層，得上、下相，超聲，分別超聲脫氣30min。取上相注滿(mǎn)高速逆流色譜儀作為固定相，轉(zhuǎn)動(dòng)主機(jī)，轉(zhuǎn)速825rpm/min，同時(shí)以10ml/min的流速泵入下相作流動(dòng)相，水浴溫度為30℃，建立動(dòng)態(tài)平衡后，用適量流動(dòng)相溶解粗提物，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣，紫外檢測(cè)器在215nm波長(zhǎng)下在線(xiàn)監(jiān)測(cè)，收集目標(biāo)成分，連續(xù)制備，相應(yīng)合并回收試劑，濃縮后甲醇結(jié)晶，干燥，得到科羅索酸。

實(shí)施例2

(1)取干燥的吳茱萸五加粉碎，按照液料比1∶8的比例加入80％乙醇，在超聲功率600w、40℃條件下，超聲提取20min，提取3次，減壓濃縮提取液，回收甲醇，得到浸膏；

(2)上述浸膏溶于ph＝10的氫氧化鈉溶液中，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝螅o置，過(guò)濾，除去不溶物，溶液經(jīng)0.5mol/l硫酸中和后，加入等量乙酸乙酯萃取3次，收集乙酸乙酯萃取液，濃縮回收溶劑，得到粗提物；

(3)將上述粗提物采用tbe-300a高速逆流色譜儀進(jìn)行分離。具體步驟為：在分液漏斗里配制正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水兩相溶劑體系，按體積比4∶5∶5.5∶6混合，振搖后靜置分層，得上、下相，超聲，分別超聲脫氣30min。取上相注滿(mǎn)高速逆流色譜儀作為固定相，轉(zhuǎn)動(dòng)主機(jī)，轉(zhuǎn)速870rpm/min，同時(shí)以8ml/min的流速泵入下相作流動(dòng)相，水浴溫度為30℃，建立動(dòng)態(tài)平衡后，用適量流動(dòng)相溶解粗提物，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣，紫外檢測(cè)器在215nm波長(zhǎng)下在線(xiàn)監(jiān)測(cè)，收集目標(biāo)成分，連續(xù)制備，相應(yīng)合并回收試劑，濃縮后甲醇結(jié)晶，干燥，得到科羅索酸。

實(shí)施例3

(1)取干燥的吳茱萸五加粉碎，按照液料比1∶12的比例加入60％甲醇，在超聲功率600w、40℃條件下，超聲提取20min，提取3次，減壓濃縮提取液，回收甲醇，得到浸膏；

(2)上述浸膏溶于ph＝10的氫氧化鈉溶液中，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝螅o置，過(guò)濾，除去不溶物，溶液經(jīng)0.4mol/l磷酸中和后，加入等量乙酸乙酯萃取3次，收集乙酸乙酯萃取液，濃縮回收溶劑，得到粗提物；

(3)將上述粗提物采用tbe-300a高速逆流色譜儀進(jìn)行分離。具體步驟為：在分液漏斗里配制正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水兩相溶劑體系，按體積比4∶4.5∶5.5∶5混合，振搖后靜置分層，得上、下相，超聲，分別超聲脫氣30min。取上相注滿(mǎn)高速逆流色譜儀作為固定相，轉(zhuǎn)動(dòng)主機(jī)，轉(zhuǎn)速915rpm/min，同時(shí)以12ml/min的流速泵入下相作流動(dòng)相，水浴溫度為30℃，建立動(dòng)態(tài)平衡后，用適量流動(dòng)相溶解粗提物，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣，紫外檢測(cè)器在215nm波長(zhǎng)下在線(xiàn)監(jiān)測(cè)，收集目標(biāo)成分，連續(xù)制備，相應(yīng)合并回收試劑，濃縮后甲醇結(jié)晶，干燥，得到科羅索酸。

實(shí)施例4純度檢查

儀器：lc-10at型高效液相色譜儀，spd-10a型紫外可見(jiàn)檢測(cè)器，cbm-10a型色譜工作站，色譜柱promosilc18(4.6mm×250mm，5μm)；流動(dòng)相：甲醇∶1％冰醋酸(80∶20)；流速：1ml/min；柱溫：30℃；檢測(cè)時(shí)間為30min，檢測(cè)波長(zhǎng)：215nm。

取實(shí)施例1-3任一實(shí)施例中獲得的科羅索酸白色結(jié)晶粉末，精密稱(chēng)定，加甲醇溶解并定容，搖勻，過(guò)0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，hplc檢測(cè)圖譜見(jiàn)圖1。

實(shí)施例5結(jié)構(gòu)鑒定

取實(shí)施例1-3任一實(shí)施例中獲得的科羅索酸白色結(jié)晶性粉末，m.p.312-314℃，易溶于甲醇，丙酮，難溶于石油醚。tlc檢查，展開(kāi)劑石油醚∶乙酸乙酯(10∶3)，10％硫酸-乙醇顯色為紫紅色斑點(diǎn)，rf≈0.45，liebermann-burchard反應(yīng)呈陽(yáng)性，molish反應(yīng)陰性。

氘代氯仿溶劑，使用drx400/300核磁共振儀(bruker公司)分析其核磁數(shù)據(jù)。主要核磁數(shù)據(jù)如下：¹h-nmr(400mhz，c3d6o)中，δ0.82(3h，s)，δ0.87(3h，s)，δ0.90(3h，d，j＝5.0hz)，δ0.97(9h，brs，3*ch3)，δ1.09(3h，s)，δ2.75(1h，d，j＝9.2hz)δ2.78(1h，d，j＝9.2hz)，δ3.51(1h，s)，δ5.23(1h，s)；¹³c-nmr(100mhz，c3d6o)：48.1(c-1)，68.7(c-2)，83.9(c-3)，40.2(c-4)，56.1(c-5)，19.0(c-6)，33.6(c-7)，39.9(c-8)，48.2(c-9)，38.6(c-10)，23.9(c-11)，125.7(c-12)，139.4(c-13)，42.7(c-14)，28.9(c-15)，24.8(c-16)，48.1(c-17)，53.6(c-18)，39.5(c-19)，39.5(c-20)，31.2(c-21)，37.6(c-22)，29.5(c-23)，17.8(c-24)，17.1(c-25)，17.6(c-26)，24.0(c-27)，178.0(c-28)，21.5(c-29)，17.6(c-30)

譜圖如圖3、圖4所示?？屏_索酸結(jié)構(gòu)式如下：

以上實(shí)施例顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征以及本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)例的限制，上述實(shí)施例和說(shuō)明書(shū)中描述的只是說(shuō)明本發(fā)明的原理，而不是以任何方式限制本發(fā)明的范圍，在不脫離本發(fā)明范圍的前提下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的范圍內(nèi)。