本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體是從天然產(chǎn)物中提取活性成分。

背景技術(shù)：

炎癥在醫(yī)學(xué)上占有重要的地位，它是許多疾病的基本病理過程。炎癥在疾病中所起的作用被認(rèn)為是令機(jī)體陷入了過分活躍的免疫系統(tǒng)，比如哮喘、過敏和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎?？寡姿幬锓譃殓摅w抗炎藥和非甾體抗炎藥兩種，其中人類對(duì)非甾體抗炎藥的使用從水楊酸的發(fā)現(xiàn)開始已經(jīng)有100多年的歷史。非甾體抗炎藥具有確定的抗炎、鎮(zhèn)痛的效果。此外，近年來人們正逐漸認(rèn)識(shí)到炎癥和慢性感染是人類不同腫瘤發(fā)生的重要因素之一。據(jù)研究估計(jì)，至少有15％的癌癥是由慢性炎癥發(fā)展而成的，流行病學(xué)研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，定期服用非甾體抗炎藥的人比沒有服用此類藥物的人患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)降低。在我國(guó)，非甾體抗炎藥已經(jīng)成為臨床上僅次于抗感染藥的第二大類用藥。但是，非甾體抗炎藥所致不良反應(yīng)的發(fā)生率之高，同樣不容忽視。據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)和國(guó)家權(quán)威機(jī)構(gòu)監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，在使用非甾體抗炎藥的人群中，約有20％-25％出現(xiàn)不同程度的不良反應(yīng)，主要表現(xiàn)為胃腸道反應(yīng)、神經(jīng)系統(tǒng)反應(yīng)、肝腎功能反應(yīng)以及心血管系統(tǒng)反應(yīng)等。

炎性細(xì)胞能產(chǎn)生眾多有助腫瘤形成、生長(zhǎng)和存活的物質(zhì)，其中之一是一氧化氮(no)。no是具有生物活性的氣體分子，是細(xì)胞間信息傳遞的重要調(diào)節(jié)因子，并有介導(dǎo)細(xì)胞免疫和炎癥毒性的功能。no的過量生成與炎癥密切相關(guān)，在急性炎癥部位，致炎物質(zhì)和炎癥介質(zhì)可誘導(dǎo)或增加no的合成和釋放，no本身具有細(xì)胞毒性，還能與游離基團(tuán)反應(yīng)生成如onoo-等分子，導(dǎo)致毒性增加，從而促進(jìn)炎癥部位滲出和水腫。

我國(guó)傳統(tǒng)中藥中“清熱解毒”、“祛風(fēng)除濕”、“扶正固本”等作用與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的抗炎、免疫的觀念密切相關(guān)，并且毒副作用小、資源豐富。因此通過采用現(xiàn)代的生物活性篩選模型，從中草藥中尋找到高效、毒副作用低的抗炎活性成分或先導(dǎo)化合物，尤其是有效抑制no釋放的黃酮類化合物，進(jìn)而開發(fā)為對(duì)炎癥有預(yù)防與治療的藥物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供從青天葵中提取的兩個(gè)黃酮及其制備方法和用途。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：

8kg干燥的青天葵(nerviliafordii(hance)schltr.)藥材分別加入8l的95％(體積比，下同)乙醇回流提取兩次，每次2h。醇提后的藥材殘?jiān)俜謩e用8l的蒸餾水回流提取兩次，每次2h。合并兩次的水提液，減壓濃縮，得到粗提物1022g。將粗提物上d101大孔樹脂，乙醇-水(0∶100～100∶0)梯度洗脫后得到6個(gè)流分，編號(hào)為fr.1-6；其中，第五個(gè)流分fr.5得到357g，用ods-c18柱層析，甲醇-水(0∶100～100∶0)梯度洗脫后得到6個(gè)亞流分，編號(hào)為fr.51-56；第四個(gè)亞流分fr.54得到4.8g，經(jīng)制備液相分離，色譜條件：流動(dòng)相為乙腈-水(25∶75)，色譜柱為ymcods-a(20×250mm，10μm)，流速8.0ml/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為265nm，即得到兩個(gè)化合物，通過ms、nmr等測(cè)定其結(jié)構(gòu)。

本發(fā)明的益效是：

1.提供了從青天葵中獲得兩個(gè)黃酮的制備方法。

2.本發(fā)明得到的兩個(gè)黃酮與現(xiàn)有的臨床合成藥物相比較，不但具有抗炎活性好、毒副作用低的優(yōu)點(diǎn)，而且來自傳統(tǒng)中藥，安全可靠，具有非常良好的藥用前景，可做成包括但不限于顆粒劑、片劑、注射劑等各種劑型。

附圖說明

圖1為nervilifordink的¹h-nmr

圖2為nervilifordink的¹³c-nmr

圖3為nervilifordink的hmbc

圖4為nervilifordink的hsqc

圖5為nervilifordink的高分辨質(zhì)譜圖

圖6為nervilifordinl的¹h-nmr

圖7為nervilifordinl的¹³c-nmr

圖8為nervilifordinl的hmbc

圖9為nervilifordinl的esi-ms

圖10為分離流程圖

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述。

實(shí)施例1

8kg干燥的青天葵(nerviliafordii(hance)schltr.)藥材分別加入8l的95％(體積比，下同)乙醇回流提取兩次，每次2h。醇提后的藥材殘?jiān)俜謩e用8l的蒸餾水回流提取兩次，每次2h。合并兩次的水提液，減壓濃縮，得到粗提物1022g。將粗提物上d101大孔樹脂，乙醇-水(0∶100～100∶0)梯度洗脫后得到6個(gè)流分，編號(hào)為fr.1-6；其中，第五個(gè)流分fr.5得到357g，用ods-c18柱層析，甲醇-水(0∶100～100∶0)梯度洗脫后得到6個(gè)亞流分，編號(hào)為fr.51-56；第四個(gè)亞流分fr.54得到4.8g，經(jīng)制備液相分離，色譜條件：流動(dòng)相為乙腈-水(25∶75)，色譜柱為ymcods-a(20×250mm，10μm)，流速8.0ml/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為265nm，即得到兩個(gè)化合物，通過ms、nmr等測(cè)定其結(jié)構(gòu)，分別命名為nervilifordink和nervilifordinl。結(jié)構(gòu)如下示所示。

下表為兩個(gè)化合物的nmr信號(hào)歸屬。

表1nmrdata(600and150mhz，resp.，indmso-d6)ofnervilifordinkandl.δinppm，jinhz.

藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)：

mtt法評(píng)價(jià)細(xì)胞毒性，選取無細(xì)胞毒性的藥物濃度進(jìn)行研究。取raw264.7小鼠巨噬細(xì)胞，按2×10⁵/ml的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(100μl/孔)。貼壁24h后，每孔加入50μl終濃度為1μg/ml的lps(空白對(duì)照組加入等體積的磷酸鹽緩沖液pbs)，在37℃、5％co2孵育2h后，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的樣品溶液(空白對(duì)照組和模型組加入等體積的無血清培養(yǎng)基)，每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24h后吸取培養(yǎng)上清液50μl至酶標(biāo)板中，加入等體積的griess試劑a和griess試劑b(griess試劑a為0.1％n-萘乙二胺鹽酸鹽，griess試劑b為5％h3po4含1％對(duì)氨基苯磺酰胺，用前1∶1混合)，室溫反應(yīng)10min后測(cè)定540nm處的吸光值。地塞米松為陽性對(duì)照藥品。

用濃度分別為0，1，5，10，20，50μmol/l的nano2繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)nano2標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算細(xì)胞培養(yǎng)上清液中no2^-的濃度以及對(duì)no釋放的抑制率，抑制率計(jì)算公式為：

表22個(gè)黃酮對(duì)raw264.7細(xì)胞釋放no的影響

結(jié)論：采用mtt法測(cè)定2個(gè)化合物對(duì)lps誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞raw264.7的毒性，并測(cè)定對(duì)raw264.7細(xì)胞生成no的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在對(duì)細(xì)胞正常增殖無明顯影響的濃度范圍內(nèi)，2個(gè)化合物對(duì)lps誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞raw264.7的no釋放表現(xiàn)出不同程度的抑制活性。在抗炎藥物領(lǐng)域的應(yīng)用有較好的前景。