本發(fā)明屬于有機制藥生產技術領域。

背景技術：

甲氨蝶呤（4-氨基-10-甲基葉酸，簡稱：mtx）是葉酸類似物，甲氨蝶呤于1988年開始用于治療類風濕關節(jié)炎（ra）。而甲氨蝶呤與阿達木單抗等生物制劑聯合用藥，可以更有效地緩解ra患者的疾病癥狀，減緩關節(jié)損傷的進展（x線顯示），并且可以改善身體功能。與傳統(tǒng)藥物相比，阿達木單抗等生物制劑的療效強且持久，且耐受性良好。

阿侖膦酸鈉（簡稱：aln）1995年在美國以fosamax的名稱上市，用于治療骨質疏松癥和變形性骨炎，1997年5月fda再次批準其預防骨質疏松和預防骨折的擴大適應癥，成為第一個被fda批準用于預防骨質疏松癥的非激素類藥物，阿侖膦酸鈉對骨的增重作用類似于雌激素，優(yōu)于降鈣素，能顯著增加骨密度，降低骨折發(fā)生率，口服有效，作用持久，具有良好的耐受性和較高的安全性。

中國專利文獻cn104371009a提供了一種gnrh多肽-甲氨蝶呤偶聯物的制備方法，在gnrh多肽或其類似物含有d-lys單元中的氨基的情況下，通過使甲氨蝶呤活性酯與gnrh多肽或其類似物的d-lys上的氨基發(fā)生酰胺化反應制備。該發(fā)明提供一種含有甲氨蝶呤的藥物組合物，增加藥物的靶向性，但是，這些現有技術存在原料成本高，工藝制作復雜，操作要求繁瑣等問題，因而無法大規(guī)模生產。

技術實現要素：

本發(fā)明旨在提供一種方便工業(yè)化應用的甲氨蝶呤與阿倫磷酸鈉偶聯物的制備方法。

本發(fā)明包括以下步驟：

1）將甲氨蝶呤、超純水、有機溶劑混合，取得甲氨蝶呤溶液；

2）將嗎啉乙磺酸（mes）、n-羥基丁二酰亞胺（nhs）、1-（3-二甲氨基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（edc）加入上述甲氨蝶呤溶液中，得甲氨蝶呤混合溶液；

3）在磁力攪拌下，將甲氨蝶呤混合溶液與阿侖膦酸鈉混合進行反應；

4）反應結束后，將所得溶液經300～600的分子量透析袋透析后，取透析袋中物質冷凍干燥，得到納米級甲氨蝶呤與阿倫磷酸鈉偶聯物。

本發(fā)明以甲氨蝶呤提供羧基的原料，嗎啉乙磺酸（mes）用于將反應液形成生物緩沖液，防止反應期間ph變化太大，nhs和edc聯用作為反應的交聯劑，可活化羧基，活化之后加入原料阿侖膦酸鈉，提供氨基與甲氨蝶呤的羧基耦合，生成目標產物。然后透析掉原料，冷凍干燥以得到成品。

本發(fā)明采用以上方法制得的甲氨蝶呤與阿倫磷酸鈉偶聯物為納米級，這種偶聯物可以獲得一種新型骨科靶向藥物，使得藥物能夠向骨科病炤部位富集，從而達到更好的治療效果。

進一步地，本發(fā)明甲氨蝶呤與阿侖膦酸鈉的投料摩爾比為1∶1～1.2。該用料比可節(jié)約原料，并且控制甲氨蝶呤與阿侖膦酸鈉按1∶1的比例耦合。

所述有機溶劑為丙酮或氯仿?？商岣咴霞装钡实娜芙舛?，從而提高原料的利用率。

所述嗎啉乙磺酸（mes）、n-羥基丁二酰亞胺（nhs）和1-（3-二甲氨基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（edc）的投料摩爾比為1∶0.2～5∶0.2～5。該用料比可提高催化劑的濃度以增加催化活性，從而提高產率。

所述甲氨蝶呤與嗎啉乙磺酸（mes）的投料摩爾比為1∶1～2。該用料比可防止反應期間ph值變化太大導致反應產率降低。

為了使反應物盡量完全反應，從而提高原料利用率，所述反應時間為1～12小時。

所述透析時，將透析袋置于超純水，并且每2～6h更換一次超純水，能在保證透析干凈的前提下減少水的用量，節(jié)約資源和成本。

附圖說明

圖1為本發(fā)明方法的反應式。

圖2為甲氨蝶呤、阿倫磷酸鈉和制成的偶聯物的紅外表征對比圖譜。

圖3為甲氨蝶呤、阿倫磷酸鈉和制成的偶聯物的uv-vis對比圖譜。

圖4為甲氨蝶呤的核磁共振氫譜。

圖5為阿倫磷酸鈉的核磁共振氫譜。

圖6為甲氨蝶呤與阿倫磷酸鈉偶聯物的核磁共振氫譜。

圖7為通過trap染色，純水（0毫摩爾每升甲氨蝶呤和阿侖膦酸鹽的耦合物）對于破骨細胞分化的抑制作用的效果圖。

圖8為通過trap染色，0.2毫摩爾每升甲氨蝶呤和阿侖膦酸鹽的耦合物對于破骨細胞分化的抑制作用的效果圖。

圖9為通過trap染色，0.4毫摩爾每升甲氨蝶呤和阿侖膦酸鹽的耦合物對于破骨細胞分化的抑制作用的效果圖。

圖10為通過trap染色，0.8毫摩爾每升甲氨蝶呤和阿侖膦酸鹽的耦合物對于破骨細胞分化的抑制作用的效果圖。

圖11為甲氨蝶呤-阿侖膦酸鹽偶聯物在二型膠原誘導的大鼠類風濕關節(jié)炎模型中，通過影像學microct的方法展示對腳部關節(jié)的骨質破壞及骨質溶解的治療作用效果圖。

圖12為甲氨蝶呤-阿侖膦酸鹽偶聯物在二型膠原誘導的大鼠類風濕關節(jié)炎模型中，通過組織學trap染色的方法展示對腳部關節(jié)的骨質破壞及骨質溶解的治療作用效果圖。

具體實施方式

一、制備工藝：

例1：

用電子天平稱取3.6g甲氨蝶呤與90ml的超純水混合，滴加丙酮，至甲氨蝶呤基本溶解，形成甲氨蝶呤溶液。

向甲氨蝶呤溶液中加入3g的2-嗎啉乙磺酸（mes）、1.8g的n-羥基丁二酰亞胺（nhs）、3g的1-（3-二甲氨基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（edc）。

再加入6g阿侖膦酸鈉，置于磁力攪拌器，繼續(xù)攪拌反應3小時。

反應結束后，將所得溶液倒入300分子量透析袋中，并置于裝有超純水的大燒杯中透析24h，每2-6h換一次超純水。

透析結束后，取出透析袋中物質，將取出的物質在敞口容器凍實且以保鮮膜包好，然后軋孔進行干燥48小時，得到所要目標產物。

例2：

用電子天平稱取7.2g甲氨蝶呤與180ml的超純水混合，滴加氯仿，至甲氨蝶呤基本溶解，形成甲氨蝶呤溶液。

向形成甲氨蝶呤溶液中加入6g的2-嗎啉乙磺酸（mes）、3.6g的n-羥基丁二酰亞胺（nhs）、6g的1-（3-二甲氨基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（edc）。

再加入12g阿侖膦酸鈉，置于磁力攪拌器，繼續(xù)攪拌反應12小時。

反應結束后，將所得溶液倒入600分子量透析袋中，并置于裝有超純水的大燒杯中透析24h，每2-6h換一次超純水。

透析結束后，取出透析袋中物質，將取出的物質在敞口容器凍實且以保鮮膜包好，然后軋孔進行干燥72小時，得到所要目標產物。

以上兩例的反應過程如圖1所示。

二、目標產物的性狀驗證：

1、圖2為例1方法所得樣品與甲氨蝶呤和阿倫磷酸鈉純樣對比的紅外表征圖譜。其中曲線a為甲氨蝶呤（mtx）的紅外表征圖譜；曲線b（aln）為阿倫磷酸鈉的紅外表征圖譜；曲線c為例1制得的目標產物的紅外表征圖譜。

由圖2的曲線c可以發(fā)現：在1569和1724cm^-1處發(fā)現酰胺-nh彎曲，從而推斷出：例1所得的目標產物中甲氨蝶呤確實連接上了阿倫磷酸鈉，例1得到了甲氨蝶呤與阿倫磷酸鈉偶聯物。

2、圖3為例2方法所得樣品與甲氨蝶呤和阿倫磷酸鈉純樣對比的uv-vis表征結果，其中曲線a為甲氨蝶呤（mtx）的uv-vis表征圖；曲線b（aln）為阿倫磷酸鈉的uv-vis表征圖；曲線c為例1制得的目標產物的uv-vis表征圖。

由圖3可見：阿倫磷酸鈉純樣沒有出現信號，而實施方案2所得樣品出現了甲氨蝶呤的特征峰，可以推斷出甲氨蝶呤確實偶聯上了阿倫磷酸鈉。

3、由圖4的甲氨蝶呤的核磁共振氫譜可見：化學位移7～9ppm左右的峰為芳環(huán)的特征峰，為原料甲氨蝶呤獨有。

4、由圖5的阿倫磷酸鈉的核磁共振氫譜可見：化學位移4.9ppm左右是磷酸的氫的出峰位置，為原料阿侖膦酸鈉獨有。

5、由圖6的以上兩例制成的目標產物——甲氨蝶呤與阿倫磷酸鈉偶聯物的核磁共振氫譜可見：目標產物在4.9ppm、7.8ppm和8.4ppm出現信號，證明阿倫磷酸鈉修飾了甲氨蝶呤。

6、在體外，將甲氨蝶呤、阿侖膦酸鹽和本發(fā)明制成的目標產物分別對骨髓來源巨噬細胞向破骨細胞分化進行抑制試驗，通過trap染色，試驗驗證了甲氨蝶呤和阿侖膦酸鹽的耦合物相比甲氨蝶呤和阿侖膦酸鹽單獨使用時的抑制結果。

本發(fā)明制成的目標產物對骨髓來源巨噬細胞向破骨細胞分化進行抑制試驗結果如圖7至10所示，由圖7至10可以看出：本發(fā)明制成的耦合物對于破骨細胞分化的抑制作用更加明顯，且濃度更低，達到了良好的低劑量藥物抑制破骨細胞分化的效益。

7、通過影像學microct和組織學trap染色的方法，將本發(fā)明制成的目標產物作用于大鼠的類風濕關節(jié)炎模型中進行試驗。

結果見圖11、12，圖11和圖12顯示了是在大鼠的類風濕關節(jié)炎模型中，甲氨蝶呤和阿侖膦酸鹽兩者的耦合的藥效應當是強于單獨使用兩者其中之一，并且耦合物在使用時，可以降低藥物的使用劑量。