本發(fā)明涉及一種從決明子中制備獲得純度大于98％的紅鐮霉素-6-o-β-龍膽二糖苷的制備方法，尤其是通過閃式提取從決明子中制備紅鐮霉素-6-o-β-龍膽二糖苷的工藝方法。
背景技術(shù)：
決明子(semencassiae)是豆科植物決明cassiaobtusifolial.或小決明cassiatoral.的干燥成熟種子，為臨床上常用中藥，具有清肝明目、潤腸通便的功效，常用于治療目赤澀痛、羞明多淚、頭痛眩暈、目暗不明、大便秘結(jié)等?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明決明子還具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗衰老等多方面作用。決明子無論在藥用、保健等方面都具有廣泛的研究、利用和開發(fā)前景。
決明子主要含有蒽醌類和萘并吡喃酮類等化學(xué)成分，具有多種藥理活性，如保肝、降糖、降脂、抗突變、抗雌激素樣作用等.紅鐮霉素-6-o-β-龍膽二糖苷為決明子中主要萘駢吡喃酮類成分，具有降血脂、保肝、抗突變、抗雌激素等作用，為決明子主要藥效成分之一。
姜艷艷等在對決明子化學(xué)對照品紅鐮霉素-6-o-β-龍膽二糖苷的穩(wěn)定性研究表明，紅鐮霉素-6-o-β-龍膽二糖苷對照品在60℃以下，相對濕度90％，加熱8h后仍有85.0％以上剩余，但是隨著溫度增高，濕度增大，紅鐮霉素-6-o-β-龍膽二糖苷穩(wěn)定性逐漸降低。表明其在較低溫度環(huán)境及含水較少的溶液中，紅鐮霉素-6-o-β-龍膽二糖苷穩(wěn)定性較好，
紅鐮霉素-6-o-β-龍膽二糖苷的分離制備方法主要有：劉斌等(中國專利cn201110001317.3，2014年公開)采用20％～50％乙醇加熱回流提取得決明子提取物浸膏，浸膏用甲醇回流提取得甲醇提取物；甲醇提取物采用硅膠干柱色譜法分離得到紅鐮霉素-6-o-β-龍膽二糖苷粗品，粗品采用硅膠干柱色譜法、c18反相色譜柱純化得到紅鐮霉素-6-o-β-龍膽二糖苷黃色粉末，其主要工藝步驟中用含水乙醇加熱回流提取，需要較高溫度且濕度較大，容易破壞紅鐮霉素-6-o-β-龍膽二糖苷的結(jié)構(gòu)，且在制備過程中用的試劑量很大，不利于大規(guī)模推廣應(yīng)用。目前，溫度低、時間短、工藝簡便的制備方法用于大規(guī)模(克級以上)制備98％含量紅鐮霉素-6-o-β-龍膽二糖苷的工作尚未見報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明以決明子為原料，包括原料粉碎、提取、分離、精制、干燥等步驟，其特征在于所述的制備方法包括以極性有機(jī)溶劑為溶媒、在10～60℃進(jìn)行閃式提取，提取液經(jīng)硅膠柱層析、反相色譜、冷凍干燥等工藝。本發(fā)明所述的紅鐮霉素-6-o-β-龍膽二糖苷制備方法不僅溫度低，有效成分不易破壞，而且時間短，提取率高，產(chǎn)品純度高，且可用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明的目的是開發(fā)出一種工藝簡單、提取率高且純度在98％以上的紅鐮霉素-6-o-β-龍膽二糖苷的制備方法。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案：
1.一種高純度紅鐮霉素-6-o-β-龍膽二糖苷的制備方法，尤其是通過閃式提取從決明子中制備紅鐮霉素-6-o-β-龍膽二糖苷的工藝方法。所述方法以決明子為原料，包括提取、精制、干燥等步驟，其特征在于所述的制備方法包括以下具體步驟：
(1)取決明子，加入按藥材質(zhì)量計(jì)5～20倍溶劑，閃式提取1～3次，過濾，合并提取液，回收溶劑，得決明子提取物。
(2)取步驟(1)所得決明子提取物，與硅膠以1∶1質(zhì)量比拌樣，洗脫劑氯仿-甲醇，干法上樣，洗脫3～5倍柱體積后，挖出上樣層，繼續(xù)用甲醇洗脫硅膠柱，通過tlc追蹤檢測，直至無紅鏈霉素-6-o-β-龍膽二糖苷?；厥障疵撘海玫郊t鐮霉素-6-o-β-龍膽二糖苷粗提物。
(3)將步驟(2)紅鐮霉素-6-o-β-龍膽二糖苷粗提物用體積濃度30％～80％甲醇水溶液溶解，配置成濃度為50～150mg/ml的供試品溶液，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾；采用柱長10～50cm、直徑1～10cm的高效液 相制備色譜柱進(jìn)行分離，六通閥或泵進(jìn)樣，進(jìn)樣體積為1～50ml，以體積濃度為40％～70％的甲醇-水為洗脫體系，流速控制在10～400ml/min，在線紫外檢測，收集含有紅鐮霉素-6-o-β-龍膽二糖苷的洗脫液，減壓濃縮干燥得黃色粉末i；
(4)黃色粉末i以體積濃度為35％～60％甲醇水溶液的洗脫體系進(jìn)行第二次高效液相制備，其他條件同步驟(3)，收集純度大于98％的含有紅鐮霉素-6-o-β-龍膽二糖苷的餾分；將上述餾分直接干燥即可得到純度大于98％的紅鐮霉素-6-o-β-龍膽二糖苷對照品，其為黃色粉末。
步驟(1)所述的提取溶劑為甲醇，乙醇，甲醇水溶液或乙醇水溶液。
步驟(4)中所述的干燥方法為真空干燥、微波干燥或冷凍干燥中的一種或多種。
步驟(4)中所述的干燥方法優(yōu)選冷凍干燥。
2.純度檢查
儀器：lc-10at型高效液相色譜儀，spd-10a型紫外可見檢測器，cbm-10a型色譜工作站，色譜柱promosilc18(4.6mm×250mm，5μm)；流動相：乙腈-四氫呋喃-水(18∶3∶79)；流速：1.0ml/min；柱溫：30℃；檢測時間為25min。
3.結(jié)構(gòu)鑒定
紅鐮霉素-6-o-β-龍膽二糖苷為黃色粉末(甲醇)，分子式：c27h32o15，分子量：596。
1h-nmr(dmso，400mhz)：δ7.20(1h，s，h-10)，6.94(1h，s，h-9)，6.80(1h，s，h-7)，6.20(1h，s，h-3)，5.13(1h，br，s，5-oh)，5.06(1h，d，j＝7.6hz，h-1’)，4.19(1h，d，j＝7.6hz，h-1”)，5.13～3.21(16h，m，糖基質(zhì)子)，3.87(3h，s，8-och3)，2.40(3h，s，2-ch3)。13c-nmr(dmso-d6，100mhz)∶δ183.7(c-4)，168.8(c-2)，161.9(c-5)，161.1(c-6)，157.6(c-8)，152.4(c-10a)，140.3(c-9a)，107.7(c-5a)，106.7(c-10)，103.6(c-7orc-4a)，101.1(c-3orc-1’)，100.7(c-1”)，99.7(c-9)，76.8(c-3’)，76.6(c-3”)，75.5(c-5’)，76.3(c-5”)，73.5(c-2’orc-2”)，70.0(c-4’)，69.6(c-4”)，68.6(c-6’)，61.0(c-6”)，55.4(8-och3），20.1(2-ch3)。以上數(shù)據(jù)與kitanakas等的文獻(xiàn)《tudiesontheconstituentsoftheseedsofcassiaobtusifolial.thestructureoftwonaphthopyroneglycosides》中數(shù)據(jù)一致。
以本發(fā)明從決明子中分離制備紅鐮霉素-6-o-β-龍膽二糖苷化學(xué)對照品具有如下優(yōu)點(diǎn)和進(jìn)步：
(1)本發(fā)明用甲醇或乙醇為提取溶劑，以閃式提取方法提取，保證了低溫低濕度的操作環(huán)境，使紅鐮霉素-6-o-β-龍膽二糖苷保持穩(wěn)定不被破壞，從而可以提高紅鐮霉素-6-o-β-龍膽二糖苷的提取率。
(2)本發(fā)明通過柱分離對目標(biāo)對照品進(jìn)行初步富集，以制備型高效液相為主要精制手段，使紅鐮霉素-6-o-β-龍膽二糖苷得到高效分離的同時避免了大量使用有毒揮發(fā)性流動相及開口柱。
(3)本發(fā)明所用的高效液相制備方法為快速制備方法，單針分離時間在10～30分鐘之間，非常適合大批量化學(xué)對照品的制備；同時加上制備溶劑的回收再利用，可實(shí)現(xiàn)批量制備的低成本。
(4)本發(fā)明采用紫外檢測器在線檢測，紅鐮霉素-6-o-β-龍膽二糖苷的分離情況可直接檢測，直接選擇性收集高純度樣品，從而實(shí)現(xiàn)純度保證下的高回收率。
(5)本發(fā)明采用真空干燥、微波干燥或冷凍干燥，保證了紅鐮霉素-6-o-β-龍膽二糖苷的低溫環(huán)境，大大提高了其提取率.
總之，本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了溫度低、時間短、工藝步驟簡單、純度高、提取率高，并且可大規(guī)模生產(chǎn)。
附圖說明
圖1為紅鐮霉素-6-o-β-龍膽二糖苷的hplc分析圖譜(278nm)
具體實(shí)施方式
現(xiàn)結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明，實(shí)施例僅限于說明本發(fā)明，而非對本發(fā)明的限定。
實(shí)施例1
(1)取決明子500g，加入6l甲醇，閃式提取2次，過濾，合并提取液，回收甲醇，得決明子提取物85g。
(2)取85g決明子提取物，與硅膠以1∶1質(zhì)量比拌樣，洗脫劑氯仿-甲醇，干法上樣，洗脫4倍柱體積后，挖出上樣層，繼續(xù)用甲醇洗脫硅膠柱，通過tlc追蹤檢測，直至無紅鏈霉素龍膽二糖苷?；厥障疵撘海玫郊t鐮霉素-6-o-β-龍膽二糖苷粗提物15g。
(3)將15g紅鐮霉素-6-o-β-龍膽二糖苷粗提物用體積濃度39％甲醇水溶液溶解，配置成濃度為150mg/ml的供試品溶液，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾；采用柱長35cm、直徑8cm的高效液相制備色譜柱進(jìn)行分離，六通閥進(jìn)樣，進(jìn)樣體積為50ml，以體積濃度為40％的甲醇-水溶液為洗脫體系，流速控制在155ml/min，在線紫外檢測，收集含有紅鐮霉素-6-o-β-龍膽二糖苷的洗脫液，減壓濃縮干燥得黃色粉末i3.6g。
(4)將3.6g黃色粉末i以體積濃度為42％甲醇水溶液的洗脫體系進(jìn)行第二次高效液相制備，其他條件同步驟(3)，收集純度大于98％的含有紅鐮霉素-6-o-β-龍膽二糖苷的餾分；將上述餾分冷凍干燥即可得到純度大于98％的紅鐮霉素-6-o-β-龍膽二糖苷對照品2.25g，得率為0.45％，其為黃色粉末。
實(shí)施例2
(1)取決明子100g，加入1000ml50％甲醇，閃式提取3次，過濾，合并提取液，回收甲醇，得決明子提取物16g。
(2)取16g決明子提取物，與硅膠以1∶1質(zhì)量比拌樣，洗脫劑氯仿-甲醇，干法上樣，洗脫3倍柱體積后，挖出上樣層，繼續(xù)用甲醇洗脫硅膠柱，通過tlc追蹤檢測，直至無紅鏈霉素龍膽二糖苷。低溫減壓回收洗脫液，得到紅鐮霉素-6-o-β-龍膽二糖苷粗提物3.1g。
(3)將3.1g紅鐮霉素-6-o-β-龍膽二糖苷粗提物用體積濃度35％甲醇水溶液溶解，配置成濃度為120mg/ml的供試品溶液，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾；采用柱長15cm、直徑6cm的高效液相制備色譜柱進(jìn)行分離，六通閥或泵進(jìn)樣，進(jìn)樣體積為12.5ml，以體積濃度為23％的甲醇-水溶液為洗脫體系，流速控制在150ml/min，在線紫外檢測，收集含有紅鐮霉素-6-o-β-龍膽二糖苷的洗脫液，減壓濃縮干燥得黃色粉末i0.72g。
(4)黃色粉末i以體積濃度為35％～60％甲醇水溶液的洗脫體系進(jìn)行第二次高效液相制備，其他條件同步驟(3)，收集純度大于98％的含有紅鐮霉素-6-o-β-龍膽二糖苷的餾分；將上述餾分低溫真空干燥即可得到純度大于98％的紅鐮霉素-6-o-β-龍膽二糖苷對照品0.405g，得率為0.405％，其為黃色粉末。
實(shí)施例3
(1)取決明子300g，加入4.5l乙醇，閃式提取3次，過濾，合并提取液，回收乙醇，得決明子提取物49g。
(2)取決明子提取物49g，與硅膠以1∶1質(zhì)量比拌樣，洗脫劑氯仿-甲醇，干法上樣，洗脫4倍柱體積后，挖出上樣層，繼續(xù)用甲醇洗脫硅膠柱，通過tlc追蹤檢測，直至無紅鏈霉素龍膽二糖苷。低溫減壓回收洗脫液，得到紅鐮霉素-6-o-β-龍膽二糖苷粗提物9.2g。
(3)將9.2g紅鐮霉素-6-o-β-龍膽二糖苷粗提物用體積濃度27％的甲醇水溶液溶解，配置成濃度為115mg/ml的供試品溶液，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾；采用柱長30cm、直徑8cm的高效液相制備色譜柱進(jìn)行分離，六通閥或泵進(jìn)樣，進(jìn)樣體積為40ml，以體積濃度為40％的甲醇-水為洗脫體系，流速控制在218ml/min，在線紫外檢測，收集含有紅鐮霉素-6-o-β-龍膽二糖苷的洗脫液，減壓濃縮干燥得黃色粉末i2.28g。
(4)將2.28g黃色粉末i以體積濃度為45％甲醇水溶液的洗脫體系進(jìn)行第二次高效液相制備，其他條件同步驟(3)，收集純度大于98％的含有紅鐮霉素-6-o-β-龍膽二糖苷的餾分；將上述餾分冷凍干燥即可得到純度大于98％的紅鐮霉素-6-o-β-龍膽二糖苷對照品1.31g，得率為0.437％，其為黃色粉末。
以上實(shí)施例顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征以及本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，而不是以任何方式限制本發(fā)明的范圍，在不脫離本發(fā)明范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的范圍內(nèi)。