專利名稱：一種擴(kuò)增低含量基因突變dna的引物設(shè)計(jì)方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的核酸擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)方法，尤其涉及一種基于高野生型DNA背景 下，擴(kuò)增低含量基因突變DNA的引物設(shè)計(jì)方法，及其在核酸檢測(cè)上的應(yīng)用。
技術(shù)背景聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction, PCR)是基因擴(kuò)增技術(shù)的一次重大飛 躍，該技術(shù)1985年由美國(guó)PE公司遺傳部的Kary BMullis教授發(fā)明。PCR技術(shù)首先應(yīng)用 于人e -珠蛋白DNA擴(kuò)增及鐮刀狀紅細(xì)胞貧血癥的產(chǎn)前診斷。由于此項(xiàng)技術(shù)可將極微量的 耙DNA特異地?cái)U(kuò)增上百萬(wàn)倍，從而大大提高對(duì)DNA分子的分析和檢測(cè)能力，能檢測(cè)到單分 子或在10萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中僅含1個(gè)靶DNA分子的樣品。因而，此技術(shù)在短短的幾年內(nèi)就廣泛 的應(yīng)用于分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、微生物學(xué)、遺傳學(xué)等領(lǐng)域。PCR技術(shù)實(shí)際上是在模板DNA、引物和4種脫氧核糖核苷酸存在的條件下依賴于DNA 聚合酶(如Taq酶等)的酶促合成反應(yīng)。PCR技術(shù)的特異性取決于引物和模板DNA結(jié)合的 特異性。反應(yīng)分三步①變性(denaturation):通過(guò)加熱使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，雙 鏈解離形成單鏈DNA。②退火(annealling):當(dāng)溫度突然降低時(shí)由于模板分子結(jié)構(gòu)較引 物要復(fù)雜的多，而且反應(yīng)體系中引物DNA量大大多于模板DNA,使引物和其互補(bǔ)的模板在 局部形成雜交鏈，而模板DNA雙鏈之間互補(bǔ)復(fù)性的機(jī)會(huì)較少。③延伸(extension):在 DNA聚合酶和4種脫氧核糖核苷之磷酸底物及Mg2+存在的條件下,聚合酶催化以引物為起 始點(diǎn)的DNA鏈延伸反應(yīng)。以上3步為一個(gè)循環(huán)，每一個(gè)循環(huán)的產(chǎn)物可以作為下一個(gè)循環(huán)的 模板，數(shù)小時(shí)之后，介于兩個(gè)引物之間的特異性DNA片段得到了大量復(fù)制。決定PCR擴(kuò)增 特異性的引物是由人工合成的一段寡核苷酸。在反應(yīng)最初階段，原來(lái)的DNA起著起始模板 的作用，隨著循環(huán)次數(shù)的遞增，由引物介導(dǎo)延伸的片段急劇地增多而成為主要模板。因此, 絕大多數(shù)擴(kuò)增產(chǎn)物將受到所加引物5'末端的限制，最終擴(kuò)增產(chǎn)物是介于兩種引物5'端之 間的DNA片段。隨著生命科學(xué)研究的不斷進(jìn)展，人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到核酸是決定遺傳信息的關(guān)鍵物質(zhì)，通過(guò)檢測(cè)樣品中是否存在某種(些)核酸及其序列變異，就可以判斷出檢測(cè)對(duì)象是否攜帶某 種病原微生物及其抗藥性、患有某種疾病或處于某種遺傳狀態(tài)等。因此，核酸分析技術(shù)已 經(jīng)廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究的眾多領(lǐng)域，包括病原微生物的鑒定、分型和耐藥性檢測(cè)；疾 病診斷與預(yù)后等。現(xiàn)有PCR技術(shù)設(shè)計(jì)的引物缺陷主要有l(wèi))特異性不好，針對(duì)基因突變的普通方法設(shè) 計(jì)的引物，常常產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增條帶。2)選擇性不好，在較髙的野生型模板的背景下, 針對(duì)較低含量的基因突變DNA的檢測(cè)能力有限，而往往大部分引起腫瘤的突變都是體細(xì)胞 突變，突變細(xì)胞都是摻雜在野生型細(xì)胞內(nèi)的，因此所提的DNA也是帶有大量野生型DNA 的。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于針對(duì)在較高野生型模板的背景下，為有效擴(kuò)增目的片段產(chǎn)物，提供 一種簡(jiǎn)單、廉價(jià)、高效的高特異的擴(kuò)增目的產(chǎn)物的PCR擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)方法及其應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案如下首先按常規(guī)方法設(shè)計(jì)一對(duì)靶序列特異性引物，然后在每對(duì)所述引物對(duì)中的一條引物的5'末端加一段與待擴(kuò)增靶序列無(wú)關(guān)的GC寡核苷酸尾，離3'末端 的第5-8個(gè)寡核苷酸處插入3個(gè)A堿基片段，突變位置放在3'末端1-4位。本發(fā)明所設(shè)計(jì)的引物結(jié)構(gòu)，見(jiàn)附圖1 (a)，所設(shè)計(jì)的引物對(duì)中的一條引物包括四個(gè)區(qū) 域，從5'端到3'端分別為GC區(qū)、5'端配對(duì)區(qū)、3A區(qū)和3'端突變配對(duì)區(qū)；所設(shè)計(jì)的 引物總長(zhǎng)度不大于40bp。為了使所設(shè)計(jì)的引物具有合適的TM值，所述寡核苷酸尾長(zhǎng)度優(yōu)選為2-5bp, Tra值在 6-10'C,堿基數(shù)量?jī)?yōu)選為3bp。該GC區(qū)根據(jù)待擴(kuò)增耙序列的特點(diǎn)來(lái)選擇，確保該區(qū)域與 待擴(kuò)增靶序列不會(huì)配對(duì)，且3個(gè)寡核苷酸可以是GGG或CCC,也可以是GC混合的堿基， 但是所添加的無(wú)關(guān)堿基不與弓I物其他地方形成明顯的二級(jí)結(jié)構(gòu)。引物5'端配對(duì)區(qū)堿基數(shù)在16-26個(gè)堿基，Tm值在50-55'C左右，在引物退火時(shí)起到 保證引物與靶序列有一定的結(jié)合效率的作用。由于本發(fā)明主要針對(duì)基因突變中的點(diǎn)突變、缺失突變以及插入突變等，僅僅靠增加 GC區(qū)對(duì)提髙擴(kuò)增的目的性和有效性是不夠的，為了提高擴(kuò)增的目的性和有效性，本發(fā)明在離引物3'末端的第5-8位堿基處插入3個(gè)與靶序列不匹配的A堿基片段。經(jīng)研究表明， 在離引物3'末端的第5-8位堿基處插入3個(gè)A堿基片段，可以增加引物的特異性。根據(jù) 具體序列的不同，保持引物3'末端突變匹配區(qū)的Tm值在10-15'C，盡量減少引物二級(jí)結(jié) 構(gòu)，選擇引物3'末端的第5-8位堿基處引入3個(gè)A堿基。由于該3個(gè)A堿基不與待擴(kuò)增 耙序列匹配，故這3個(gè)堿基會(huì)在退火與靶序列結(jié)合形成凸起的小尖泡，會(huì)影響整個(gè)引物與 靶序列結(jié)合效率，此時(shí)引物能否擴(kuò)增主要取決于引物3'末端的幾個(gè)堿基與靶序列的結(jié)合 力量和效率。引物3'末端突變結(jié)合匹配區(qū)的5-8個(gè)堿基，突變堿基一般位于3'末端的 3-4位，也可以根據(jù)序列的不同將突變堿基放在3'末端最后l位，從而更有利于與待擴(kuò) 增靶序列的特異性結(jié)合。當(dāng)引入的這3個(gè)堿基不是A而是其它T、 G、 C，或者堿基數(shù)不是 3個(gè)時(shí)，此時(shí)引物與待擴(kuò)增靶序列的結(jié)合就沒(méi)有3個(gè)A堿基好。本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)示意圖如圖1 (b)所示應(yīng)用本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，包括如下步驟l)預(yù)變性；2)包括若干變性、 引物退火和引物延伸循環(huán)的第一部分PCR擴(kuò)增；3)包括若干變性、引物退火和引物延伸 循環(huán)的第二部分PCR擴(kuò)增。為了提高產(chǎn)物的擴(kuò)增率，第二步驟PCR擴(kuò)增循環(huán)數(shù)設(shè)置為3-10 個(gè)循環(huán)，退火溫度設(shè)為50-55°C，研究表明退火溫度設(shè)定為50-55'C時(shí)，該溫度下最有利 于本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物與突變模板特異結(jié)合。第三步驟PCR擴(kuò)增循環(huán)數(shù)設(shè)置為35-45個(gè)，優(yōu) 選35個(gè)循環(huán)，可根據(jù)需要而定，退火溫度為第一部分退火溫度再加5-8'C。由于每一循 環(huán)的產(chǎn)物可以作為下一個(gè)循環(huán)的模板，經(jīng)過(guò)第二步驟擴(kuò)增之后，本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物所擴(kuò)增 的產(chǎn)物得到大量的積累。這些積累的產(chǎn)物又重新作為擴(kuò)增的模板，此時(shí)引物能夠與這些模 板完全匹配，結(jié)合效率大幅度提升。經(jīng)過(guò)第一部分3-10個(gè)循環(huán)擴(kuò)增，少量的突變被富集 8-1024倍(即23-2111)。進(jìn)一步研究顯示，此時(shí)退火溫度增加5-8度能夠增加引物和模板 的特異性結(jié)合效率，而引物與不匹配模板(即野生型模板)的結(jié)合效率變得更低，完全處 于與第二部分PCR產(chǎn)物結(jié)合的劣勢(shì)，幾乎不會(huì)有任何擴(kuò)增。這樣待檢DNA模板中極少量的 突變DNA，即便含量只有0.1_1%也能夠很好檢出。依本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，反應(yīng)液中DNA聚合酶、dNTP、 Mg"和反應(yīng) 緩沖液等組分與普通PCR相同，并可根據(jù)不同的反應(yīng)予以優(yōu)化。與目前通常PCR擴(kuò)增設(shè)計(jì)引物的方法相比,本發(fā)明的PCR擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)方法具有以下 特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)1) 、在PCR引物對(duì)的一條基因特異性引物的5'端加上了3個(gè)G或C，它們與擴(kuò)增靶 基因無(wú)關(guān)的序列，這樣既不影響起始PCR擴(kuò)增反應(yīng)的效率，同時(shí)增加了引物對(duì)TM值，又 可增加之后的PCR擴(kuò)增的特異性。2) 、在PCR引物離3'末端的第5-8位寡核苷酸處插入3個(gè)A堿基片段，由于該3個(gè) 堿基A不與待擴(kuò)增靶序列匹配，故這3個(gè)堿基會(huì)凸起形成小尖泡，此時(shí)3'末端的各個(gè)堿 基與耙序列的結(jié)合會(huì)收到影響，從而更有利于與待擴(kuò)增靶序列結(jié)合，增加擴(kuò)增的特異性。3) 、基于前兩點(diǎn)所述，本發(fā)明的引物設(shè)計(jì)方法針對(duì)基因突變中的點(diǎn)突變、缺失突變以 及插入突變等，結(jié)合熒光實(shí)時(shí)PCR技術(shù)可以十分有效的解決目前對(duì)于臨床上腫瘤中常見(jiàn)的 體細(xì)胞基因突變檢測(cè)靈敏度不夠這一難點(diǎn)。


圖l(a)為本發(fā)明所設(shè)計(jì)的引物結(jié)構(gòu)示意圖；圖l(b)為發(fā)明設(shè)計(jì)的弓l物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)示意圖；圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中設(shè)計(jì)的引物檢測(cè)樣品的熒光強(qiáng)度曲線，其中(a)為按照常規(guī)設(shè)計(jì)的引物來(lái)檢測(cè)樣品的K-ras基因WT〉G4T突變以及對(duì)照樣品的 不同梯度的熒光PCR擴(kuò)增儀測(cè)定的熒光強(qiáng)度曲線；(b) 為按本發(fā)明所述設(shè)計(jì)的引物來(lái)檢測(cè)樣品的K-ras基因Ggr〉G^T突變以及對(duì)照 樣品的不同梯度熒光PCR擴(kuò)增儀測(cè)定的熒光強(qiáng)度曲線；(c) 為按照常規(guī)設(shè)計(jì)的引物來(lái)檢測(cè)不含K-ras基因G^T〉G^T突變的陰性對(duì)照樣品 的熒光PCR擴(kuò)增儀測(cè)定的熒光強(qiáng)度曲線；(d) 為按本發(fā)明所述設(shè)計(jì)的引物來(lái)檢測(cè)不含K-ras基因G^DG^T突變的陰性對(duì)照 樣品的熒光PCR擴(kuò)增儀測(cè)定的熒光強(qiáng)度曲線；圖3為本發(fā)明實(shí)施例2中設(shè)計(jì)的引物檢測(cè)樣品的熒光強(qiáng)度曲線，其中 (a)為按照常規(guī)設(shè)計(jì)的引物來(lái)檢測(cè)樣品的EGFR基因19外顯子的E746-A750del突 變以及對(duì)照樣品的不同梯度的熒光PCR擴(kuò)增儀測(cè)定的熒光強(qiáng)度曲線；(b) 為按本發(fā)明所述設(shè)計(jì)的引物來(lái)檢測(cè)樣品的EGFR基因19外顯子的E746JV750del 突變以及對(duì)照樣品的不同梯度熒光PCR擴(kuò)增儀測(cè)定的熒光強(qiáng)度曲線；(c) 為按照常規(guī)設(shè)計(jì)的引物來(lái)檢測(cè)不含EGFR基因19外顯子的E746_A750del突變 的陰性對(duì)照樣品的熒光PCR擴(kuò)增儀測(cè)定的熒光強(qiáng)度曲線；(d) 為按本發(fā)明所述設(shè)計(jì)的引物來(lái)檢測(cè)不含EGFR基因19外顯子的E746_A750del 突變的陰性對(duì)照樣品的熒光PCR擴(kuò)增儀測(cè)定的熒光強(qiáng)度曲線；圖4為本發(fā)明實(shí)施例2中設(shè)計(jì)的引物檢測(cè)樣品的熒光強(qiáng)度曲線，其中(a) 為按照常規(guī)設(shè)計(jì)的引物來(lái)檢測(cè)樣品的EGFR基因21外顯子的T790M突變以及 對(duì)照樣品的不同梯度的熒光PCR擴(kuò)增儀測(cè)定的熒光強(qiáng)度曲線；(b) 為按本發(fā)明所述設(shè)計(jì)的引物來(lái)檢測(cè)樣品的EGFR基因21外顯子的T790M突變 以及對(duì)照樣品的不同梯度熒光PCR擴(kuò)增儀測(cè)定的熒光強(qiáng)度曲線；(c) 為按照常規(guī)設(shè)計(jì)的引物來(lái)檢測(cè)不含EGFR基因21外顯子的T790M突變的陰性 對(duì)照樣品的熒光PCR擴(kuò)增儀測(cè)定的熒光強(qiáng)度曲線；(d) 為按本發(fā)明所述設(shè)計(jì)的引物來(lái)檢測(cè)不含EGFR基因21外顯子的T790M突變的 陰性對(duì)照樣品的熒光PCR擴(kuò)增儀測(cè)定的熒光強(qiáng)度曲線；具體實(shí)施方式
以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實(shí)施例不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明 的限定。實(shí)施例一本實(shí)施例中以本發(fā)明方法設(shè)計(jì)一對(duì)引物同時(shí)結(jié)合熒光定量PCR技術(shù)和雙環(huán)探針技術(shù) 來(lái)檢測(cè)K-ras基因12密碼子GGT〉GAT的基因突變。 材料材料名稱購(gòu)自來(lái)源MgCl2 (25mM)國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司T叫酶上海生工生物公司PCR Buffer緩沖液 670mm Tris; 166mm (NH^SO^ 67mm EDTA;0.85mg/mlBSA pH8.0 dNTP (N=A， T, G, C) 上海生工生物公司1. 樣品和對(duì)照品的制備1) .樣品處理和模板提取接收來(lái)自臨床的石蠟組織樣品，樣品切成5-10Wn,加入lml二甲苯脫蠟，離心收集 沉淀，加入lml無(wú)水乙醇到沉淀中，室溫或37匸晾干，加入蛋白酶K和Buffer ATL, 56 'C消化裂解1小時(shí)，90'C孵化lh,加入200 ml Buffer AL混勻再加入200 W無(wú)水乙醇 充分混勻，將上清小心轉(zhuǎn)移到QIA 2 ml離心柱中，6000Xg (8000rpm)離l min，加入 500 W Buffer AW1 ， 6000Xg (8000rpm)離1 min，小心打開(kāi)蓋子加入500 W Buffer AW2, 6000Xg(8000rpm)離1 min,空管離心20000Xg(14000rpm)離3min，加入100 )4 Buffer ATE于膜中央，溫育5分鐘，20000Xg (14000rpm)離1 min。取3W測(cè)0D值，將提取的 樣品DNA稀釋到2ng/W,取進(jìn)行PCR反應(yīng)。2) 對(duì)照陽(yáng)性樣品的制備根據(jù)Cosmic數(shù)據(jù)公布的K-ras基因12密碼子的野生型基因序列和G^DGf突變基因 序列，人工合成一段帶有K-ras基因12密碼子Ggr〉G^T突變的序列，將該序列連接到T 載體中。作為檢測(cè)時(shí)的陽(yáng)性對(duì)照品，分別稀釋到103、 102、 IO1、 10°四個(gè)梯度濃度。2. 引物和探針的設(shè)計(jì)和制備根據(jù)Cosmic數(shù)據(jù)公布的K-ras基因12密碼子的野生型基因序列和突變基因序列比較 分析，設(shè)計(jì)一對(duì)探針為K-ras-P。根據(jù)Cosmic數(shù)據(jù)公布的HGH基因的野生型基因序列分 析，設(shè)計(jì)一對(duì)引物和探針?lè)謩e為:HGH-F、 HGH-R、 HGH-P。K-ras-P: FAM-5，-GGCACTCAAGAGTGCCTTGACGATACAATCGTCA3，-TAMRAHGH-F: GCAGTGCCTTCCCAACCAHGH-R: CATTCCCCAAGAGCTTACAAACHGH-P: HEX-5，-GTTGTCTTGACAACGCTATGCTCCATAGC-3，-TAMRA 根據(jù)Cosmic數(shù)據(jù)公布的K-ras基因12密碼子的野生型基因序列和突變基因序列比較 分析，按照常規(guī)設(shè)計(jì)一對(duì)基本擴(kuò)增引物，上下游引物命名為K-ras-Fl、 K-ras-Rl。然后， 如本發(fā)明前文所述，在引物的目標(biāo)核酸片段設(shè)計(jì)獨(dú)特的標(biāo)示序列，上下游引物命名分別為 K-ras-F2、 K-ras-R2。其中，序列中帶下劃線的是標(biāo)示序列，斜體堿基為突變特異性堿基 K冊(cè)F1: AACTTGTGGTAGTTGGAGCT04K普R1: TCGTCCACAAAATGATTCTGK冊(cè)F2: GGGAACTTGTGGTAGTTG GAGAAACTGATGGK普R2: TCGTCCACAAAATGATTCTG將以上設(shè)計(jì)的引物和探針?biāo)偷紻NA合成公司合成，合成完后用Tris-HCl (pH8.0)稀釋。3. 熒光PCR擴(kuò)增，其反應(yīng)體系為lxPCR緩沖液MgCl2 7.0mmol dNTP各 l.Ommol K-ras各對(duì)引物 0.5~1.0timol K-ras探針 0.5-1.0拜o1 HGH引物 0.5-1.0nmol HGH探針 0.5-1.0nmol Taq酶 1.0U 模板 總體積實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)條件是96"C預(yù)變性3分鐘，10個(gè)循環(huán)95。C變性15秒，55。C退火 25秒，72 。C延伸10秒，35個(gè)循環(huán)95 。C變性15秒，58 。C退火25秒，72 。C延伸10秒， 35個(gè)循環(huán)，后35個(gè)循環(huán)在退火時(shí)檢測(cè)FAM和HEX熒光信號(hào)。4. 檢測(cè)采用MX3000P實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增儀(SRATGENE公司)退火階段檢測(cè)熒光，將含反應(yīng)液的 PCR管逐一放到熒光PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)熒光PCR擴(kuò)增儀顯示的Ct值判斷結(jié)果 Ct值為0或35:陰性；Ct值小于28:陽(yáng)性Ct在28-35之間樣品需重新檢測(cè)，儀器 檢測(cè)時(shí)間為90分鐘。圖2 (a)為按照常規(guī)設(shè)計(jì)的引物來(lái)檢測(cè)樣品的K-ras基因GaT〉G在T突變以及對(duì)照樣品 的不同梯度的熒光PCR擴(kuò)增儀測(cè)定的熒光強(qiáng)度曲線；圖2(b)為按本發(fā)明所述設(shè)計(jì)的引 物來(lái)檢測(cè)樣品的K-ras基因G^T〉G4T突變以及對(duì)照樣品的不同梯度熒光PCR擴(kuò)增儀測(cè)定 的熒光強(qiáng)度曲線；5. 特異性分析特異性檢測(cè)以SW48細(xì)胞的DNA作為對(duì)照，分別用常規(guī)設(shè)計(jì)的引物和按照本發(fā)明設(shè)突變檢測(cè)，特異性分析結(jié)果表明，常規(guī)設(shè)計(jì)的引物在高 濃度背景下陰性對(duì)照(SW48細(xì)胞DNA)偶爾會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性，即有較弱的熒光信號(hào)。而 按本發(fā)明所述設(shè)計(jì)的引物只有在含有K-ras基因GGT〉A(chǔ)GT突變的樣品有熒光信號(hào)，陰性對(duì) 照(SW48細(xì)胞DNA)并沒(méi)有熒光信號(hào)。同時(shí)采集血站IOO例血液樣品，進(jìn)一步證明兩 種引物的特異性。結(jié)果表明按本發(fā)明所述設(shè)計(jì)的引物明顯會(huì)優(yōu)于按常規(guī)設(shè)計(jì)的引物。見(jiàn)圖 2 (c) (d)。6. 靈敏度分析以合成的含有K-ras基因GGT〉A(chǔ)GT突變的質(zhì)粒DNA進(jìn)行定量分析，取經(jīng)定量后濃度 為IOOO個(gè)拷貝數(shù)的樣品DNA,進(jìn)行10倍稀釋，共做3個(gè)稀釋度，然后分別用按常規(guī)設(shè) 計(jì)的引物和按本發(fā)明所述設(shè)計(jì)的引物對(duì)這4個(gè)稀釋度8個(gè)平行組進(jìn)行熒光PCR靈敏度檢 測(cè)。結(jié)果表明按本發(fā)明所述設(shè)計(jì)的引物的靈敏度高，1-5 copys/W即可檢出，而按常規(guī)的 引物設(shè)計(jì)方法設(shè)計(jì)的引物最低檢測(cè)限為1(M00copys/nl。7. 選擇性試驗(yàn)分別用按常規(guī)設(shè)計(jì)的引物和按本發(fā)明所述設(shè)計(jì)的引物對(duì)以合成的含有K-ras基因 GQT〉GP突變的質(zhì)粒DNA的1000、 100、 10、 1個(gè)拷貝數(shù)在10ng的背景下進(jìn)行熒光PCR 檢測(cè)。結(jié)果顯示按本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物的選擇性好。8. 重復(fù)性試驗(yàn)分別取10例經(jīng)傳統(tǒng)測(cè)序方法驗(yàn)證為陽(yáng)性和陰性的樣品，重復(fù)10次進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，io次ct值相差不o.i個(gè)循環(huán)。實(shí)施例二本實(shí)施例中以本發(fā)明方法設(shè)計(jì)一對(duì)引物同時(shí)結(jié)合熒光定量PCR技術(shù)和雙環(huán)探針技術(shù) 來(lái)檢測(cè)EGFR基因19外顯子的E746A750del基因突變。材料材料名稱購(gòu)自來(lái)源MgCl2 (25raM)國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司T叫酶上海生工生物公司PCR Buffer緩沖液670mm Tris; 166咖(NH4)2SO4,67mm EDTA;0.85mg/ml BSA pH8.0dNTP(N:A,T, G,C)上海生工生物公司1.樣品和對(duì)照品的制備1) .樣品處理和模板提取接收來(lái)自臨床的石蠟組織樣品，樣品切成5-10Mm，加入lml二甲苯脫蠟，離心收集 沉淀，加入lml無(wú)水乙醇到沉淀中，室溫或37'C晾干，加入蛋白酶K和Buffer ATL, 56 r消化裂解l小時(shí)，90'C孵化lh,加入200 ml Buffer AL混勾再加入200 W無(wú)水乙醇 充分混勻，將上清小心轉(zhuǎn)移到QIA 2 ml離心柱中，6000Xg (8000rpm)離l min,加入 500 W Buffer AW1 , 6000 X g (8000rpm)離1 min，小心打開(kāi)蓋子加入500 W Buffer AW2， 6000Xg(8000rpm)離1 min,空管離心20000Xg(14000rpm)離3 min，加入100 W Buffer ATE于膜中央，溫育5分鐘，20000Xg (14000rpm)離1 min。取3W測(cè)0D值，將提取的 樣品DNA稀釋到2ng/W，取進(jìn)行PCR反應(yīng)。2) .對(duì)照陽(yáng)性樣品的制備根據(jù)Cosmic數(shù)據(jù)公布的EGFR基因19外顯子的的野生型基因序列和E746JV750del突 變基因序列，人工合成一段帶有EGFR基因19外顯子的E746-A750del突變的序列，將該 序列連接到T載體中。作為檢測(cè)時(shí)的陽(yáng)性對(duì)照品，分別稀釋到103、 102、 IO1、 10°四個(gè)。 2 引物和探針的設(shè)計(jì)和制備根據(jù)Cosmic數(shù)據(jù)公布的EGFR基因19外顯子的野生型基因序列和E746-A750del的突 變基因序列比較分析，設(shè)計(jì)一對(duì)探針為EGFR-19-P。根據(jù)Cosmic數(shù)據(jù)公布的HGH基因 的野生型基因序列分析，設(shè)計(jì)一對(duì)引物和探針?lè)謩e為:HGH-F、 HGH-R、 HGH-P。EGFR-19-P:FAM-5 TTCTGCTAAAGCAGAAACTCACATCGAGATGTGA-3'-TAMRAHGH-F: GCAGTGCCTTCCCAACCA HGH-R: CATTCCCCAAGAGCTTACAAACHGH-P: HEX-5，-GTTGTCTTGACAACGCTATGCTCCATAGC-3' -TAMRA根據(jù)Cosmic數(shù)據(jù)公布的EGFR基因19外顯子的野生型基因序列和E746-A750del的突 變基因序列比較分析，按照常規(guī)設(shè)計(jì)一對(duì)基本擴(kuò)增引物，上下游引物命名為EGFR-F1、 EGFR-R1。然后，如本發(fā)明前文所述，在引物的目標(biāo)核酸片段設(shè)計(jì)獨(dú)特的標(biāo)示序列，上 下游引物命名分別為EGFR-F2、 EGFR-R2。其中，序列中帶下劃線的是標(biāo)示序列，斜體 堿基為突變特異性堿基EGFR-F1: GTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAAAC EGFR-R1: CCTGAGGTTCAGAGCCATGGAC EGFR墨F2: GGGGTTAAAATTCCCGTCGCTATAAACAAAAC EGFR-R2: CCTGAGGTTCAGAGCCATGGAC將以上設(shè)計(jì)的引物和探針?biāo)偷紻NA合成公司合成，合成完后用Tris-HCl (pH8.0)稀釋。3. 熒光PCR擴(kuò)增，其反應(yīng)體系為lxPCR緩沖液MgCl2 7.0mmol dNTP各 l.Ommol EGFR各對(duì)引物 0.5-l.Opmol EGFR探針 0.5-1.0拜01 HGH引物 0.5-1.0拜o1 HGH探針 0.5-1.0拜o1 Taq酶 l.OU 模板 5jU 總體積 25^1實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)條件是96。C預(yù)變性3分鐘，10個(gè)循環(huán)95。C變性15秒，55。C退火 25秒，72 。C延伸10秒，35個(gè)循環(huán)95 。C變性15秒，58 °C退火25秒，72 °C延伸10秒， 35個(gè)循環(huán)，后35個(gè)循環(huán)在退火時(shí)檢測(cè)FAM和HEX熒光信號(hào)。4. 檢測(cè)采用MX3000P實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增儀(SRATGENE公司)退火階段檢測(cè)熒光，將含反應(yīng)液的 PCR管逐一放到熒光PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)熒光PCR擴(kuò)增儀顯示的Ct值判斷結(jié)果Ct值為0或35:陰性；Ct值小于28:陽(yáng)性；Ct在28-35之間樣品需重新檢測(cè)，儀器 檢測(cè)時(shí)間為90分鐘。圖3 (a)為按照常規(guī)設(shè)計(jì)的引物來(lái)檢測(cè)樣品的EGFR基因19外顯子的E746-A750del 突變以及對(duì)照樣品的不同梯度的熒光PCR擴(kuò)增儀測(cè)定的熒光強(qiáng)度曲線；圖3 (b)為按本 發(fā)明所述設(shè)計(jì)的引物來(lái)檢測(cè)樣品的EGFR基因19外顯子的E746-A750del突變以及對(duì)照樣 品的不同梯度熒光PCR擴(kuò)增儀測(cè)定的熒光強(qiáng)度曲線；5. 特異性分析作為對(duì)照，分別用常規(guī)設(shè)計(jì)的引物和按照本發(fā)明設(shè) 計(jì)的引物進(jìn)行EGFR基因19外顯子的E746JV750del突變檢測(cè)，特異性分析結(jié)果表明，常 規(guī)設(shè)計(jì)的引物在高濃度背景下陰性對(duì)照(SW48細(xì)胞DNA)偶爾會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性，即有較 弱的熒光信號(hào)。而按本發(fā)明所述設(shè)計(jì)的引物只有在含有EGFR基因19外顯子的 E746-A750del突變的樣品有熒光信號(hào)，陰性對(duì)照(SW48細(xì)胞DNA)并沒(méi)有熒光信號(hào)。 同時(shí)采集血站IOO例血液樣品，進(jìn)一步證明兩種引物的特異性。結(jié)果表明按本發(fā)明所述設(shè) 計(jì)的引物明顯會(huì)優(yōu)于按常規(guī)設(shè)計(jì)的引物。見(jiàn)圖3 (c) (d)。6. 靈敏度分析以合成的含有EGFR基因19外顯子的E746-A750del突變的質(zhì)粒DNA進(jìn)行定量分析， 取經(jīng)定量后濃度為IOOO個(gè)拷貝數(shù)的樣品DNA,進(jìn)行10倍稀釋，共做3個(gè)稀釋度，然后 分別用按常規(guī)設(shè)計(jì)的引物和按本發(fā)明所述設(shè)計(jì)的引物對(duì)這4個(gè)稀釋度8個(gè)平行組進(jìn)行熒光 PCR靈敏度檢測(cè)。結(jié)果表明按本發(fā)明所述設(shè)計(jì)的引物的靈敏度高，l-5copys/nl即可檢出， 而按常規(guī)的引物設(shè)計(jì)方法設(shè)計(jì)的引物最低檢測(cè)限為lO-lOOcopys/pL7. 選擇性試驗(yàn)分別用按常規(guī)設(shè)計(jì)的引物和按本發(fā)明所述設(shè)計(jì)的引物對(duì)以合成的含有EGFR基因19 外顯子的E746-A750del突變的質(zhì)粒DNA的1000、 100、 10、 1個(gè)拷貝數(shù)在lOng的背景下 進(jìn)行熒光PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示按本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物的選擇性好。8. 重復(fù)性試驗(yàn)分別取10例經(jīng)傳統(tǒng)測(cè)序方法驗(yàn)證為陽(yáng)性和陰性的樣品，重復(fù)10次進(jìn)行熒光PCR擴(kuò) 增，10次Ct值相差不0.1個(gè)循環(huán)。實(shí)施例三本實(shí)施例中以本發(fā)明方法設(shè)計(jì)一對(duì)引物同時(shí)結(jié)合熒光定量PCR技術(shù)和雙環(huán)探針技術(shù) 來(lái)檢測(cè)EGFR基因21外顯子的T790M基因突變。 材料材料名稱購(gòu)自來(lái)源MgCl2 (25mM)國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司Taq酶上海生工生物公司PCR Buffer緩沖液 670mm Tris; 166mm (NH4)2SO4,67mm EDTA;0.85mg/mlBSA pH8.0 dNTP (N=A, T, G, C) 上海生工生物公司1. 樣品和對(duì)照品的制備1) .樣品處理和模板提取接收來(lái)自臨床的石蠟組織樣品，樣品切成5-lOMm,加入lml二甲苯脫蠟，離心收集 沉淀，加入lml無(wú)水乙醇到沉淀中，室溫或37'C晾干，加入蛋白酶K和Buffer ATL， 56 'C消化裂解1小時(shí)，90'C孵化lh，加入200 ml Buffer AL混勻再加入200 W無(wú)水乙醇 充分混勻，將上清小心轉(zhuǎn)移到QIA 2 ml離心柱中，6000Xg (8000rpm)離l min,加入 500 W Buffer AW1 , 6000Xg (8000rpm)離1 min,小心打開(kāi)蓋子加入500 W Buffer AW2, 6000Xg(8000rpm)離1 min,空管離心20000Xg(14000rpm)離3min，加入100 W Buffer ATE于膜中央，溫育5分鐘，20000Xg (14000rpm)離1 min。取3W測(cè)0D值，將提取的 樣品DNA稀釋到2ng/W，取進(jìn)行PCR反應(yīng)。2) .對(duì)照陽(yáng)性樣品的制備根據(jù)Cosmic數(shù)據(jù)公布的EGFR基因21外顯子的野生型基因序列和T790M突變基因序 列，人工合成一段帶有EGFR基因21外顯子的T790M突變的序列，將該序列連接到T載體 中。作為檢測(cè)時(shí)的陽(yáng)性對(duì)照品，分別稀釋到IO3、 102、 IO1、 10°四個(gè)。2. 引物和探針的設(shè)計(jì)和制備根據(jù)Cosmic數(shù)據(jù)公布的EGFR基因21外顯子的野生型基因序列和T790M的突變基因 序列比較分析，設(shè)計(jì)一對(duì)探針為EGFR-21-P。根據(jù)Cosmic數(shù)據(jù)公布的HGH基因的野生型基因序列分析，設(shè)計(jì)一對(duì)引物和探針?lè)謩e為:HGH-F、 HGH-R、 HGH-P。EGFR-21-P: FAM-5-AAGTAAGCCTCCTTACnTGCCTCCTTCTGCAAGGAGGC -3'-TAMRAHGH-F: GCAGTGCCTTCCCAACCAHGH-R: CATTCCCCAAGAGCTTACAAACHGH-P: HEX-5，-GTTGTCTTGACAACGCTATGCTCCATAGC-3' -TAMRA根據(jù)Cosmic數(shù)據(jù)公布的EGFR基因21外顯子的野生型基因序列和T790M的突變基因 序列比較分析，按照常規(guī)設(shè)計(jì)一對(duì)基本擴(kuò)增引物，上下游引物命名為EGFR-21-F1、 EGFR-21-R1。然后，如本發(fā)明前文所述，在引物的目標(biāo)核酸片段設(shè)計(jì)獨(dú)特的標(biāo)示序列，上下游引物命名分別為EGFR-21-F2、 EGFR-21-R2。其中，序列中帶下劃線的是標(biāo)示序列， 斜體堿基為突變特異性堿基EGFR-21-F1: GTCAAGATCACAGATTTTGGGCGEGFR-21-R1: TCCCTGGTGTCAGGAAAATGCTEGFR-21-F2: GGG GTCAAGATCACAGATTTTGAAAGGCGGGEGFR-21-R2: TCCCTGGTGTCAGGAAAATGCT將以上設(shè)計(jì)的引物和探針?biāo)偷紻NA合成公司合成，合成完后用Tris-HCl (p朋.O)稀釋。3. 熒光PCR擴(kuò)增，其反應(yīng)體系為lxPCR緩沖液MgCl2 7.0mrno1 dNTP各 l.Ommol EGFR-21各對(duì)弓I物 0.5-1 .OnmolEGFR-21探針 0.5- l.O^imolHGH引物 0.5~ l.OnmolHGH探針 0.5-1.0nmol Taq酶 l.OU 模板 5^1 總體積實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)條件是96 。C預(yù)變性3分鐘，10個(gè)循環(huán)95 。C變性15秒，55 。C退火 25秒，72°C延伸10秒，35個(gè)循環(huán)95 °C變性15秒，58 °C退火25秒，72 °C延伸10秒， 35個(gè)循環(huán)，后35個(gè)循環(huán)在退火時(shí)檢測(cè)FAM和HEX熒光信號(hào)。4. 檢測(cè)采用MX3000P實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增儀(SRATGENE公司)退火階段檢測(cè)熒光，將含反應(yīng)液的 PCR管逐一放到熒光PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)熒光PCR擴(kuò)增儀顯示的Ct值判斷結(jié)果 Ct值為0或35:陰性Ct值小于28:陽(yáng)性；Ct在28-35之間樣品需重新檢測(cè)，儀器 檢測(cè)時(shí)間為90分鐘。圖4 (a)為按照常規(guī)設(shè)計(jì)的引物來(lái)檢測(cè)樣品的EGFR基因21外顯子的T790M突變以 及對(duì)照樣品的不同梯度的熒光PCR擴(kuò)增儀測(cè)定的熒光強(qiáng)度曲線；圖4 (b)為按本發(fā)明所 述設(shè)計(jì)的引物來(lái)檢測(cè)樣品的EGFR基因21 顯子的T790M突變以及對(duì)照樣品的不同梯度熒光PCR擴(kuò)增儀測(cè)定的熒光強(qiáng)度曲線；5. 特異性分析特異性檢測(cè)以SW48細(xì)胞的DNA作為對(duì)照，分別用常規(guī)設(shè)計(jì)的引物和按照本發(fā)明設(shè) 計(jì)的引物進(jìn)行EGFR基因21外顯子的T790M突變檢測(cè)，特異性分析結(jié)果表明，常規(guī)設(shè)計(jì)的 引物在髙濃度背景下陰性對(duì)照(SW48細(xì)胞DNA)偶爾會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性，即有較弱的熒光 信號(hào)。而按本發(fā)明所述設(shè)計(jì)的引物只有在含有EGFR基因21外顯子的T790M突變的樣品有 熒光信號(hào)，陰性對(duì)照(SW48細(xì)胞DNA)并沒(méi)有熒光信號(hào)。同時(shí)釆集血站100例血液樣 品，進(jìn)一步證明兩種引物的特異性。結(jié)果表明按本發(fā)明所述設(shè)計(jì)的引物明顯會(huì)優(yōu)于按常規(guī) 設(shè)計(jì)的引物。見(jiàn)圖4 (c) (d)。6. 靈敏度分析以合成的含有EGFR基因21外顯子的T790M突變的質(zhì)粒DNA進(jìn)行定量分析，取經(jīng) 定量后濃度為1000個(gè)拷貝數(shù)的樣品DNA,進(jìn)行10倍稀釋，共做3個(gè)稀釋度，然后分別 用按常規(guī)設(shè)計(jì)的引物和按本發(fā)明所述設(shè)計(jì)的引物對(duì)這4個(gè)稀釋度8個(gè)平行組進(jìn)行熒光 PCR靈敏度檢測(cè)。結(jié)果表明按本發(fā)明所述設(shè)計(jì)的引物的靈敏度高，l-5copys4d即可檢出， 而按常規(guī)的引物設(shè)計(jì)方法設(shè)計(jì)的引物最低檢測(cè)限為10"100copys/nl。7. 選擇性試驗(yàn)分別用按常規(guī)設(shè)計(jì)的引物和按本發(fā)明所述設(shè)計(jì)的引物對(duì)以合成的含有EGFR基因21 外顯子的T790M突變的質(zhì)粒DNA的1000、 100、 10、 1個(gè)拷貝數(shù)在10ng的背景下進(jìn)行熒 光PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示按本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物的選擇性好。見(jiàn)圖4 (d)。8. 重復(fù)性試驗(yàn)分別取10例經(jīng)傳統(tǒng)測(cè)序方法驗(yàn)證為陽(yáng)性和陰性的樣品，重復(fù)10次進(jìn)行熒光PCR擴(kuò) 增，10次Ct值相差不0.1個(gè)循環(huán)。
權(quán)利要求
1、一種擴(kuò)增低含量基因突變DNA的引物設(shè)計(jì)方法，首先設(shè)計(jì)一對(duì)靶序列基本擴(kuò)增引物，然后在每對(duì)所述引物對(duì)中的一條引物的5′末端加一段與待擴(kuò)增靶序列無(wú)關(guān)的GC寡核苷酸尾，離3′末端的第5~8個(gè)寡核苷酸處插入3個(gè)A堿基片段，突變位置放在3′末端1-4位。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種擴(kuò)增低含量基因突變DNA的引物設(shè)計(jì)方法，其特征在于 所述GC寡核苷酸尾長(zhǎng)度為2-5個(gè)堿基。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種擴(kuò)增低含量基因突變DNA的引物設(shè)計(jì)方法，其特征在于 所述GC寡核苷酸尾的堿基數(shù)量?jī)?yōu)選為3bp，由GGG、 CCC或是GC混合的堿基組成。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種擴(kuò)增低含量基因突變DNA的引物設(shè)計(jì)方法，其特征在于-所設(shè)計(jì)的引物總長(zhǎng)度不大于40bp。
5、 一種PCR擴(kuò)增方法，包括如下步驟1)預(yù)變性；2)包括變性、弓l物退火和引物延伸 循環(huán)的第一部分PCR擴(kuò)增，循環(huán)數(shù)為3-IO個(gè)；3)包括變性、引物退火和引物延伸循 環(huán)的第二部分PCR擴(kuò)增，循環(huán)數(shù)為35—45個(gè)，其特征在于所述的PCR引物為如權(quán)利 要求1所述方法設(shè)計(jì)而得，第二部分PCR擴(kuò)增的退火溫度比第二部分PCR擴(kuò)增的退火 溫度髙5'C-8'C。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種PCR擴(kuò)增方法，其特征在于所述的第一部分PCR擴(kuò)增的 退火溫度為50-55°C。
7、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種PCR擴(kuò)增方法，其特征在于所述的第二部分PCR擴(kuò)增的 退火溫度為58-60'C。
8、 權(quán)利要求1所述的一種擴(kuò)增低含量基因突變DM的引物設(shè)計(jì)方法于核酸檢測(cè)中的應(yīng)用。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的引物設(shè)計(jì)方法于核酸檢測(cè)中的應(yīng)用，其特征在于所述核酸檢 測(cè)采用PCR方法、基因芯片檢測(cè)、膜雜交檢測(cè)。
全文摘要
一種擴(kuò)增低含量基因突變DNA的引物設(shè)計(jì)方法，涉及一種DNA擴(kuò)增技術(shù)。本發(fā)明所提供的引物，可分為四個(gè)區(qū)域，從5′端到3′端分別為GC區(qū)、5′端配對(duì)區(qū)、3A區(qū)、3′端突變配對(duì)區(qū)。其特征在于每對(duì)所述引物對(duì)中的一條引物的5′末端均加有一段與待擴(kuò)增靶序列無(wú)關(guān)的寡核苷酸尾，離3′末端的第5～8個(gè)寡核苷酸處插入3個(gè)A堿基片段，突變位置放在3′末端1-4位。本發(fā)明的引物設(shè)計(jì)方法能夠有效的在較高野生型DNA背景時(shí)突變基因DNA含量較低的情況下特異擴(kuò)增目的產(chǎn)物，可進(jìn)行單重或多重PCR擴(kuò)增，在核酸檢測(cè)中可以得到廣泛應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N15/10GK101613698SQ200910111500
公開(kāi)日2009年12月30日 申請(qǐng)日期2009年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月13日
發(fā)明者何東華, 鄭立謀, 力 阮 申請(qǐng)人:廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司