專利名稱：一種體外定向協(xié)同共進化改造l-苯丙氨酸基因工程菌的方法
一種體外定向協(xié)同共進化改造L-苯丙氨酸基因工程菌的
方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及氨基酸制備技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種體外定向協(xié)同共進化改造L-苯丙氨 酸基因工程菌的方法。
背景技術(shù)：
L-苯丙氨酸(L-phenylalanine)為白色結(jié)晶粉末，是人體和動物不能在體內(nèi)自行 合成的必須的氨基酸之一，廣泛應(yīng)用于食品、飼料、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域，尤其是低熱量、高 甜度的二肽甜味劑阿斯巴甜(Aspartame)應(yīng)用目益廣泛，作為合成阿斯巴甜兩種原料之一 的L-苯丙氨酸的市場需求量迅速增加。另外L-苯丙氨酸也是抗腫瘤藥物和氨基酸輸液制 劑的必需原料，隨著其在醫(yī)藥領(lǐng)域的不斷開發(fā)，需求量也不斷增加。因此，對L-苯丙氨酸生 物合成途徑的研究、L-苯丙氨酸產(chǎn)生菌的改良和對其工業(yè)化生產(chǎn)的研究越來越受到人們的 重視。 國內(nèi)外L-苯丙氨酸的生產(chǎn)方法主要有水解抽提法、化學(xué)合成法、酶法和發(fā)酵法 等。由于天然蛋白中L-苯丙氨酸含量較低，水解抽提法很少使用；化學(xué)合成法的工藝復(fù)雜， 成本較高，在國外基本上被酶法和發(fā)酵法取代。但由于底物和酶的價格較高且來源有限，酶 法應(yīng)用也受到限制；由于微生物直接發(fā)酵法可利用廉價易得的原料，又可在常溫常壓下進 行，是目前國內(nèi)外生產(chǎn)L-苯丙氨酸的主流方法，具有較大的競爭優(yōu)勢。但是由于L-苯丙氨 酸等終產(chǎn)物對野生菌株體內(nèi)的芳香族氨基酸合成代謝途徑上的關(guān)鍵酶有著強烈的反饋抑 制作用，使其細胞不能大量蓄積苯丙氨酸，因此若要進行實際發(fā)酵生產(chǎn)，就必須改造野生菌 株，解除代謝調(diào)控，使其代謝終產(chǎn)物能過量蓄積。 傳統(tǒng)的菌株選育是從自然界中篩選有產(chǎn)酸能力的菌株，但是該方法獲得的氨基酸
種類和產(chǎn)量有限，后來在確立突變技術(shù)和闡明氨基酸合成系統(tǒng)調(diào)節(jié)機制的基礎(chǔ)上發(fā)展為營
養(yǎng)缺陷變異株、抗藥性菌株的選育。采用常規(guī)誘變育種的方法，盲目性大，工作量繁重，不能
增加基因的拷貝數(shù)量，且突變株一般都攜帶營養(yǎng)缺陷，進一步提高產(chǎn)量受到限制。 80年代中期，隨著載體和受體系統(tǒng)的構(gòu)建及基因重組等基因工程技術(shù)的發(fā)展，開
始應(yīng)用基因工程的方法對生化反應(yīng)的代謝網(wǎng)絡(luò)進行調(diào)節(jié)，對細胞的酶、轉(zhuǎn)運及調(diào)控體系進
行修飾，主要包括消除導(dǎo)致副反應(yīng)產(chǎn)品產(chǎn)生的酶、解除對變構(gòu)酶的調(diào)控、增加或抑制代謝途
徑上特定基因的表達以及導(dǎo)入外源基因等方法。 大腸桿菌合成L-苯丙氨酸以糖類為碳源，首先由糖代謝中心途徑分流出來的磷 酸烯醇丙酮酸(PEP)和赤鮮糖-4-磷酸(E-4-P)縮合形成脫氧阿拉伯糖型庚酮糖磷酸 (DAHP)，然后經(jīng)過一系列生化反應(yīng)來完成，催化第一個關(guān)鍵反應(yīng)的酶稱之為脫氧阿拉伯糖 型庚酮糖磷酸合酶(DS)，是分別由aroF、aroG和aroH三個基因編碼的三個同功酶；催化該 途徑中第二、第三個關(guān)鍵反應(yīng)的酶，分別稱之為分枝酸變位酶(CM)和預(yù)苯酸脫水酶(PD)， 它們是由同一個基因pheA編碼的雙功能酶蛋白。 有關(guān)通過對大腸桿菌L-苯丙氨酸代謝途徑進行調(diào)控，將L-苯丙氨酸代謝途徑相關(guān)的關(guān)鍵酶aroG、 pheA基因串聯(lián)表達構(gòu)建基因工程菌技術(shù)，國內(nèi)外已有相關(guān)的報道， sugimoto等將L-苯丙氨酸生物合成酶系的基因放到溫控啟動子的質(zhì)粒上，導(dǎo)入大腸桿菌， 通過溫度變化調(diào)節(jié)代謝產(chǎn)酸；1985年，0zaki等人將抗苯丙氨酸類似物的谷氨酸棒桿菌 上編碼CM和PD的基因克隆到Pce53質(zhì)粒，再導(dǎo)回親本，發(fā)現(xiàn)其酸產(chǎn)量提高50% ;美國的 Monsanto公司借著基因工程技術(shù)改良大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L_苯丙氨酸，產(chǎn)酸高達45g/l，并 已大規(guī)模生產(chǎn)，是世界上最大的L-苯丙氨酸生產(chǎn)企業(yè)。 而國內(nèi)起步較晚，1994年中國醫(yī)科大學(xué)生物技術(shù)中心的史燕東等將tyrB基因克 隆質(zhì)粒導(dǎo)入不同的宿主菌，得到產(chǎn)酸量提高的菌株；1999年，復(fù)旦大學(xué)范長勝等采用PCR技 術(shù)從大腸桿菌中克隆3個苯丙氨酸代謝途徑的關(guān)鍵酶基因aroG、pheA和tyrB，以不同順序 串聯(lián)組合導(dǎo)入短桿菌中共表達，其中aroG-pheA-tyrB順序串聯(lián)而構(gòu)建的黃色短桿菌工程 菌株中苯丙氨酸合成量提高2. 35倍，達到了 27. 7g/l，較大幅度地提高了工程菌株苯丙氨 酸的發(fā)酵產(chǎn)量，但是都未能達到工業(yè)化生產(chǎn)的水平。 從以上國內(nèi)外對L-苯丙氨酸基因工程菌育種情況看出，至今國內(nèi)外從分子水平 對L-苯丙氨酸菌株育種主要停留在構(gòu)建一般基因工程菌的水平，尚未看到在構(gòu)建基因工 程基礎(chǔ)上進一步采用分子定向進化技術(shù)進行菌種改良。 高產(chǎn)L-苯丙氨酸基因工程菌的構(gòu)建，除增加苯丙氨酸代謝途徑上關(guān)鍵酶基因的 克隆增加表達酶量，還可以通過解除L-苯丙氨酸對代謝途徑關(guān)鍵酶的反饋抑制作用來實 現(xiàn)。 對于L-苯丙氨酸基因工程菌的改良是指改變代謝途徑關(guān)鍵酶基因的分子結(jié)構(gòu)， 從而提高關(guān)鍵酶基因的催化活性并且造成對反應(yīng)終產(chǎn)物苯丙氨酸的不敏感性(解除反饋 抑制或脫敏)，然后分離篩選對苯丙氨酸有抗性的突變株。 反饋抑制是在代謝過程中迅速調(diào)節(jié)酶活性的一種調(diào)節(jié)方式，酶的調(diào)控區(qū)具有苯丙 氨酸的結(jié)合位點，當(dāng)體系中苯丙氨酸達到一定濃度時，苯丙氨酸與酶發(fā)生結(jié)合，并促使酶蛋 白由活性態(tài)的二聚體發(fā)生多聚化，形成失活的四聚體活多聚體。酶蛋白的分子結(jié)構(gòu)是由一 些結(jié)構(gòu)元件組裝起來的，他們的各種功能與這些結(jié)構(gòu)元件相對應(yīng)。因此，如果希望對這些酶 蛋白功能元件進行分解或重組來獲得更理想更有價值的酶蛋白，可以通過酶分子定向進化 的方法來實現(xiàn)。經(jīng)過對酶分子的定向改造，改變某些氨基酸殘基的性質(zhì)，得到比天然蛋白具 有更優(yōu)良性質(zhì)的蛋白，這種方法在制藥和工業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。如改變酶的Km 值，改變酶與底物結(jié)合的能力；改變酶的最適PH值、耐熱性、溶解性等；增加酶的特異性，減 少副反應(yīng)；解除別構(gòu)效應(yīng)引起的底物對酶的反饋抑制，以增加產(chǎn)量，目標(biāo)是獲得優(yōu)良性狀且 不喪失原有的活性。 體外定向進化是一種新的蛋白質(zhì)改造策略，通過人工模擬自然進化機制來實現(xiàn) "在試管中的進化"。其具體方法是首先利用各種現(xiàn)代分子生物學(xué)方法在體外改造酶基因 來模擬自然進化的隨機突變和同源重組，并在人為創(chuàng)造的選擇壓力下，篩選出所需性質(zhì)的 進化酶。它不需事先了解酶的空間結(jié)構(gòu)和催化機制，簡而言之，定向進化=隨機突變+正向 重組+選擇(或篩選)。這樣就能在較短時間內(nèi)完成漫長的自然進化過程，甚至可以在幾 周或幾個月的時間內(nèi)創(chuàng)造出優(yōu)化的酶，而在天然的進化過程中，得到這個結(jié)果需要幾千萬 年之久，而且，對進化酶的酶學(xué)性質(zhì)分析更有助于我們深入了解該酶結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。定 向進化不但可以用來改善酶蛋白的一種性質(zhì)，而且還能將兩個或更多已優(yōu)化的性質(zhì)合為一體，創(chuàng)造出具有多種優(yōu)化性質(zhì)的進化酶。 體外定向進化兩種常用技術(shù)是易錯PCR技術(shù)和DNA改組技術(shù)，如圖l和圖2所示
所謂的易錯PCR技術(shù)是指在體外擴增目的基因時，利用Taq酶的低保真度，同時調(diào)整反應(yīng)條件，如提高鎂離子濃度、加入錳離子、改變dNTP的比例濃度等方法，以一定的頻率向目的基因隨機引入堿基錯配，導(dǎo)致目的基因的隨機突變構(gòu)成突變庫，然后選擇或者篩選出需要的突變體。由于在易錯PCR的方法中，遺傳變化只發(fā)生在單一分子內(nèi)部，所以屬于無性進化(asexualevolution)。該方法簡單且容易操作，但是其能力有限，因為與序列的大小相比，突變庫中所含有的突變體數(shù)量少，且容易出現(xiàn)同型堿基轉(zhuǎn)換，產(chǎn)生大量的中性突變，從而導(dǎo)致了大量、煩瑣的定向篩選和選擇過程。因此科學(xué)家逐漸研究并發(fā)展出"DNA改組基因重組策略"，它是將已經(jīng)獲得的存在于不同基因中的多突變信息，通過控制復(fù)性溫度和延伸反應(yīng)時間，并在pfu DNA聚合酶作用下，將含有多突變信息的小片斷連接成新的全長基因，從而形成基因的隨機突變庫，是運用基因重組原理來提高酶改造效率的一種定向進化方法。 但是定向進化作為模擬自然界分子進化的一種方式，并不能總是確切的反映進化的真實過程。定向進化操作是針對某一個酶進行的。而我們知道在自然界中，某一表型的決定往往是多個基因共同作用的結(jié)果。而這些基因產(chǎn)物間往往互相影響，互相制衡，單程某個基因的改變往往難以造成表型的變化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種體外定向協(xié)同共進化改造L-苯丙氨酸基因工程菌的方法，利用酪氨酸營養(yǎng)缺陷型菌為宿主菌，提供一種高效溫控原核表達載體pBV220與L-苯丙氨酸代謝途徑關(guān)鍵酶基因aroG和pheA偶合串聯(lián)的新基因工程菌，其發(fā)酵不僅省去IPTG誘導(dǎo)步驟，并且利用溫度調(diào)控達到高效啟動表達，利于大規(guī)模發(fā)酵，易于實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。
—種體外定向協(xié)同共進化改造L-苯丙氨酸基因工程菌的方法，主要是將L-苯丙氨酸代謝途徑的兩個關(guān)鍵酶基因aroG和pheA串聯(lián)后作為一個整體進行定向進化和篩選，從而找到新的具有抗反饋調(diào)節(jié)機制的代謝平衡，篩選其最佳的進化組合來獲得高產(chǎn)量的新L-苯丙氨酸基因工程菌；在采用的易錯PCR反應(yīng)體系中，在高鎂離子濃度和不同dNTP的濃度下，來控制隨機突變的頻率，向目的基因中引入隨機突變，構(gòu)建突變庫；最后進行高產(chǎn)酸菌株的篩選。 本發(fā)明具體包括以下幾個步驟
—、 L-苯丙氨酸基因工程菌的構(gòu)建 (1)采用PCR技術(shù)以E. coil K12總DNA為模板，設(shè)計引物，擴增獲取aroG和pheA基因，利用引物和克隆載體上的多克隆位點，分別將aroG和pheA基因插入pMD18T克隆載體上，構(gòu)建pMD-aroG和pMD-pheA重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入E. coli JM109進行測序鑒定；
(2)利用重組載體pMD-pheA上的酶切位點Kpn I和BamH I，酶切產(chǎn)物插入到相同酶切的重組載體pMD-aroG，構(gòu)建串聯(lián)重組質(zhì)粒pMD-aroG-pheA ; (3)利用重組載體pMD-aroG-pheA的酶切位點EcoR I和BamH I，酶切產(chǎn)物插入到
相同酶切的溫控原核表達載體pBV220，構(gòu)建串聯(lián)重組表達質(zhì)粒pBV-AroG-PheA ; (4)將構(gòu)建的重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酪氨酸缺陷型E. coil K12，得到L-苯丙氨酸基因工程菌； 二、體外定向協(xié)同共進化改良L-苯丙氨酸基因工程菌 (1)在普通PCR反應(yīng)緩沖體系基礎(chǔ)上添加Mg2+，改變dATP、 dGTP、 dCTP、 dTTP配比濃度，采用易錯PCR技術(shù)，構(gòu)建偶合串聯(lián)基因aroG-pheA的隨機突變庫，再以易錯PCR產(chǎn)物為模板，利用DNA改組技術(shù)，通過控制復(fù)性溫度和延伸反應(yīng)時間，并在pfu DNA聚合酶作用下，將含有多突變信息的小片斷連接成新的aroG-pheA基因，aroG-pheA突變庫基因進行重新組合，獲取新的aroG-pheA突變庫； (2)將新突變庫的偶合串聯(lián)基因aroG-pheA及其pBV220表達載體用EcoR I和BamH I雙酶切后連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入酪氨酸缺陷型E. coil K12構(gòu)建突變表達庫，運用酶標(biāo)儀高效篩選高產(chǎn)L-苯丙氨酸新的基因工程菌株； (3)分別擴增獲取產(chǎn)L-苯丙氨酸提高的4株細菌的偶合串聯(lián)基因aroG-pheA，用EcoR I和BamH I雙酶切后連接同樣雙酶切的pMD18T克隆載體，以4種含突變基因的質(zhì)粒pMD-aroG-pheA為模板，采用DNA改組技術(shù)進行第二輪次的定向協(xié)同共進化，通過控制復(fù)性溫度和延伸反應(yīng)時間，并在pfu DNA聚合酶作用下，將含有多突變信息的小片斷連接成新的aroG-pheA基因，aroG-pheA突變庫基因進行重新組合，構(gòu)建新的aroG-pheA突變庫，將新突變庫的偶合串聯(lián)基因aroG-pheA及其pBV220表達載體用EcoR I和BamH I雙酶切后連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入酪氨酸缺陷型E. coil K12構(gòu)建突變表達庫，運用酶標(biāo)儀高效篩選高產(chǎn)L-苯丙氨酸基因工程菌株。 本發(fā)明主要將本室構(gòu)建的一株L-苯丙氨酸基因工程菌上的aroG和pheA基因當(dāng)做一個整體，采用易錯PCR和DNA改組這兩種技術(shù)相結(jié)合的方法進行體外定向協(xié)同共進化改造，篩選獲得一株L-苯丙氨酸產(chǎn)量提高的114%的突變菌株。 在對L-苯丙氨酸基因工程菌進行定向進化操作以提高L-苯丙氨酸產(chǎn)量時，大腸桿菌體內(nèi)L-苯丙氨酸的代謝有多種酶共同參與，無論是對aroG，還是對pheA來說，單獨的對某一個酶進行改造，都很難破壞已經(jīng)穩(wěn)固建立的代謝平衡和酶分子間的協(xié)調(diào)。唯一的方法是將參與這一代謝途徑的所有酶或者是代謝途徑上的關(guān)鍵酶都進行改造。就是將代謝途徑上的多個關(guān)鍵酶基因同時進行隨機突變并在相同的環(huán)境壓力下進行選擇，即進行定向協(xié)同共進化，從而實現(xiàn)提高L-苯丙氨酸產(chǎn)量的目標(biāo)。 為了構(gòu)建高產(chǎn)酸的L-苯丙氨酸基因工程菌，解除產(chǎn)物L(fēng)-苯丙氨酸對關(guān)鍵酶的反饋抑制，本發(fā)明將代謝工程方法和關(guān)鍵酶分子的定向協(xié)同共進化方法相結(jié)合，對基因工程菌株的改造。在了解大腸桿菌苯丙氨酸代謝合成途徑的基礎(chǔ)上，先采用紫外誘變和NTG復(fù)合誘變技術(shù)獲得大腸桿菌K12的酪氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株作為基因工程菌的宿主，然后利用PCR技術(shù)獲取大腸桿菌K12的aroG和pheA基因并進行串聯(lián)表達，使代謝流充分流向L_苯丙氨酸產(chǎn)生的方向，以減少雜酸的產(chǎn)生。在構(gòu)建工程菌基礎(chǔ)上，為了獲取更高產(chǎn)的新基因工程菌株，就必須解除aroG和pheA關(guān)鍵酶受產(chǎn)物L(fēng)_苯丙氨酸的反饋抑制。本發(fā)明用易錯PCR技術(shù)和DNA改組相結(jié)合的方法構(gòu)建突變體庫，將L-苯丙氨酸代謝途徑相關(guān)的兩個關(guān)鍵酶基因aroG和pheA當(dāng)作一個整體同時進行隨機突變。突變庫中存在aroG和pheA基因不同程度改變的不同搭配，從而找到新的具有抗反饋調(diào)節(jié)機制的突變組合，快速獲得既有高的催化活性，又能抵抗L-苯丙氨酸反饋抑制的新的基因工程菌。 本發(fā)明將代謝工程方法和代謝途徑上關(guān)鍵酶分子的定向協(xié)同共進化相結(jié)合，進行工程菌株的改良。在了解大腸桿菌苯丙氨酸代謝途徑的基礎(chǔ)上，獲取aroG和pheA關(guān)鍵酶基 因并進行串聯(lián)表達構(gòu)建基因工程菌，使代謝流充分流向L-苯丙氨酸產(chǎn)生的方向，以減少雜 酸的產(chǎn)生。在此基礎(chǔ)上，為了獲取更高產(chǎn)的基因工程菌株，將L-苯丙氨酸工程菌代謝途徑 上的兩個關(guān)鍵酶基因當(dāng)作一個整體通過兩輪次的定向共進化進行隨機突變，采用易錯PCR 技術(shù)和DNA改組相結(jié)合的方法構(gòu)建突變體庫，再從中進行定向篩選高產(chǎn)L-苯丙氨酸的新基 因工程菌。 通過兩輪次定向協(xié)同共進化技術(shù)篩選獲取的優(yōu)良突變株中aroG和pheA基因上存 在數(shù)個位點發(fā)生堿基的突變，產(chǎn)L-苯丙氨酸水平比未改造菌株提高114X，從而找到新的 既有高的催化活性，又能抵抗L-苯丙氨酸反饋抑制的基因工程菌。該技術(shù)的應(yīng)用避免了繁 瑣的傳統(tǒng)紫外線和化學(xué)誘變的篩選方法，加速了關(guān)鍵酶基因的進化速度，加快了篩選的時 間，降低篩選成本。高產(chǎn)L-苯丙氨酸基因工程菌的定向協(xié)同共進化技術(shù)也適用于其它類型 氨基酸的進化。


圖1為定向協(xié)同共進化易錯PCR技術(shù)的示意圖；
圖2為定向協(xié)同共進化DNA改組技術(shù)的示意圖；
圖3為本發(fā)明中表達載體pBV-aroG-pheA的構(gòu)建圖；
圖4為本發(fā)明中重組質(zhì)粒pBV-aroG-pheA酶切電泳圖。
以下結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步詳述。
具體實施方式
本發(fā)明一種體外定向協(xié)同共進化改造L-苯丙氨酸基因工程菌的方法，主要包括 以下幾個步驟 步驟一 L-苯丙氨酸基因工程菌的構(gòu)建，具體包括以下構(gòu)建步驟
1、酪氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株的構(gòu)建 將野生型E. coil K12經(jīng)UV和NTG復(fù)合誘變處理，用抗生素淘汰野生型菌株，富集 營養(yǎng)缺陷型菌株；用點植對照法獲取營養(yǎng)缺陷型菌株，最后進行營養(yǎng)缺陷型菌株的鑒定，篩 選獲取酪氨酸營養(yǎng)缺陷型宿主菌。 2、堿裂解法提取E. coil K12基因組DNA的提取
3、關(guān)鍵酶aroG和pheA基因的獲得 以基因組DNA為模板，分別采用設(shè)計的aroG和pheA基因上下游引物，進行目的基 因的PCR擴增。循環(huán)參數(shù)為:95。C預(yù)變性4min，94。C變性lmin，56. 5。C退火lmin，72。C延伸 lmin，反應(yīng)35個循環(huán)，最后72。C延伸10min?；靹蚝笕? y 1產(chǎn)物1 %瓊脂糖凝膠電泳檢驗， 其余-2(TC保存?zhèn)溆?。切下特異性擴增條帶，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，按說明回收擴 增的基因片斷。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，使用凝膠成像系統(tǒng)的分析軟件估算核酸濃度。
4、重組質(zhì)粒pMD-aroG和pMD-pheA的構(gòu)建 將擴增的關(guān)鍵酶基因aroG和pMD-18T、 pheA和pMD-18T質(zhì)粒分別用EcoR I/Kpn I、 Kpn I/BamH I進行雙酶切，待酶切完全后取50 yl酶切產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢 測，并用瓊脂糖電泳PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收所需要aroG/pMD-18T、 pheA/pMD-18T基因片段，用T4DNA連接酶連接，構(gòu)建克隆質(zhì)粒pMD-aroG和pMD-pheA。 5、關(guān)鍵酶基因的連接產(chǎn)物pMD-aroG和pMD-pheA轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞 分別取新鮮制備的100 ill感受態(tài)細胞和lOiU連接產(chǎn)物于1.5mlEP管中，混
勻，冰浴30min，42。C熱激90s，再冰浴2-10min。加入890ii 1 37。C預(yù)熱的LB培養(yǎng)基，
37°C 200rpm振蕩lh，將轉(zhuǎn)化菌涂布于含7 y 1 IPIG(20%)和40 y lx-gal (2mg/y 1)的LB/
Amp+平板上，于37t:培養(yǎng)16h，經(jīng)藍白斑篩選，分別挑取數(shù)個白斑單菌落于2ml含100 y g/
ml Amp的LB培養(yǎng)基中，于37。C震蕩培養(yǎng)過夜。 6、陽性克隆子的鑒定及基因的測序分析 (1)重組質(zhì)粒pMD-aroG和pMD-pheA的快速制備 用堿裂解法提取保存于E. col i JM109中的含關(guān)鍵酶基因的pMD-aroG和 pMD-pheA。 (2)重組質(zhì)粒pMD-aroG和pMD-pheA的酶切驗證 將提取出來的重組質(zhì)粒pMD-aroG和pMD-pheA分別進行EcoR I/Kpn I及Kpn 1/ BamH I的雙酶切驗證，酶切完全后取10 y 1酶切產(chǎn)物進行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢領(lǐng)纟，出現(xiàn)目 的基因條帶即可判定所挑的菌落為陽性克隆子。
(3)關(guān)鍵酶aroG和pheA基因序列的測定 將篩選出來的陽性克隆子pMD-aroG和pMD-pheA生工，進行序列分析。
7、關(guān)鍵酶基因串聯(lián)重組子pMD-aroG-pheA的構(gòu)建
(1)目的基因的酶切、連接 將鑒定的陽性克隆質(zhì)粒pMD-aroG和pMD-pheA分別用Kpn I和BamH I進行雙酶 切，酶切完全后將分別將50 iU酶切產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用瓊脂糖電泳 PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收所需要pMD-aroG和pheA目的基因片段，用T4DNA連接酶連接，構(gòu) 建表達質(zhì)粒pMD-aroG-pheA。
(2)重組質(zhì)粒pMD-aroG-pheA的轉(zhuǎn)化 取新鮮制備的100 iil感受態(tài)細胞和lOiU連接產(chǎn)物于1. 5mlEP管中，混勻，冰浴 30min，42。C熱激90s，再冰浴2-10min。加入890 ii 1 37。C預(yù)熱的LB培養(yǎng)基，37°C 200rpm 振蕩lh，將轉(zhuǎn)化菌涂布于含7iU IPIG(20% )和40iU x-gal (2mg/的LB/Amp+平板 上，于37t:培養(yǎng)16h，分別挑取數(shù)個白斑單菌落于2ml含100 y g/ml Amp的LB培養(yǎng)基中，于 37t:震蕩培養(yǎng)過夜。 (3)重組菌陽性克隆子的快速篩選及酶切驗證 隨機挑取20個單菌落，37t:搖床培養(yǎng)過夜；分別取lml菌液到EP管中，12000rpm， 離心去上清，收集菌體；加入20iU ddH20、20iil酚氯仿異戊醇(24 : 25 : 1)和4iU 6X lddding buffer,還有少量的Rnase酶，混勻后，劇烈震蕩2min ;震蕩后，12000rpm，離心 2min，取上清進行l(wèi)^瓊脂糖凝膠電泳檢測。出現(xiàn)目的條帶即可初步判定所挑的菌落為陽性 克隆子，再提取陽性重組菌的質(zhì)粒進行EcoR I和BamH I雙酶切驗證。
8、關(guān)鍵酶基因串聯(lián)表達重組子pBV-aroG-pheA的構(gòu)建
(1)大腸桿菌培養(yǎng)及質(zhì)粒DNA的提取。 分別取含質(zhì)粒pMD-aroG-pheA和質(zhì)粒pBV220的大腸桿菌單菌落，于含100 ii g/ml Amp的LB培養(yǎng)基中，37 °C 220rpm過夜培養(yǎng)，利用堿裂解法提取其質(zhì)粒DNA。
(2)目的基因的酶切、連接 將鑒定的陽性克隆質(zhì)粒pMD-aroG-pheA和質(zhì)粒pBV220分別用EcoR I和BamH I 進行雙酶切，酶切完全后將50 酶切產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用瓊脂糖電泳 PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收所需要-aroG-pheA-和pBV220目的基因片段，用T4DNA連接酶連 接，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pBV-aroG-pheA。
(3)重組質(zhì)粒pBV-aroG-pheA的轉(zhuǎn)化 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化酪氨酸缺陷型E. coil K12感受態(tài)細胞后，涂布于含Amp的LB平
板上，于37t:過夜培養(yǎng)。 (4)重組菌陽性克隆子的快速篩選及酶切驗證 隨機挑取平板上20個陽性克隆子，37t:搖床培養(yǎng)過夜后，利用質(zhì)粒快速抽提法提 取質(zhì)粒DNA，電泳檢測后，出現(xiàn)目的條帶即可初步判定所挑的菌落為陽性克隆子，再提取陽 性重組菌的質(zhì)粒進行EcoR I和BamH I雙酶切驗證(見圖4)。
(5)質(zhì)粒穩(wěn)定性實驗 從平板中挑取一單菌落，接入2ml含Amp抗生素的LB培養(yǎng)基中，3(TC培養(yǎng)過夜，將 種子20ul接入不含Amp抗生素的LB培養(yǎng)基中，35。C培養(yǎng)使菌株在熱誘導(dǎo)前在無Amp的培 養(yǎng)基中連續(xù)生長48h，繁殖50代以上，最后一次，細菌在生長到0D600 = 0.3時，轉(zhuǎn)入37°C 誘導(dǎo)，取樣涂于不含Amp的LB平板上，次日，隨機挑取菌落100個點含Amp的平板上，在含 Amp平板上生長菌落的百分?jǐn)?shù)為98%，證明基因工程菌有較高的質(zhì)粒穩(wěn)定性。
9 、重組質(zhì)粒pBV-aroG-pheA的表達研究 挑取構(gòu)建的L-苯丙氨酸基因工程菌單克隆，至lml LB/Amp培養(yǎng)基中，37t:、 220rpm振蕩培養(yǎng)48h， 3000rpm/min離心，取發(fā)酵液上清用鹽酸稀釋后，采用酶標(biāo)儀三波段 測量法測定上清液中L-苯丙氨酸的產(chǎn)酸水平。 以上完成了酪氨酸營養(yǎng)缺陷型L-苯丙氨酸基因工程菌的構(gòu)建，將該工程菌作為 以下定向協(xié)同共進化的出發(fā)菌株。 步驟二 第一輪次體外定向協(xié)同共進化改良L-苯丙氨酸基因工程菌 1、串聯(lián)基因aroG-pheA的易錯PCR (1)大腸桿菌重組菌pMD-aroG-pheA的培養(yǎng) 在平板上挑取一個大腸桿菌重組菌pMD-aroG-pheA單菌落至含有Amp濃度為
lOOii g/ml的3ml LB的試管中，37。C過夜培養(yǎng)。 (2)堿裂解法提取重組質(zhì)粒 (3)易錯PCR擴增串聯(lián)基因aroG-pheA 利用T叫DNA聚合酶不具有3' _5'校對功能的性質(zhì)，在高鎂離子濃度(3mmo1/ L-7mmol/L)和不同濃度dNTP的濃度下(lmmol/L-2. 5mmol/L)，來控制隨機突變的頻率，向 目的基因中引入隨機突變，構(gòu)建突變庫。實驗中控制最優(yōu)的突變率約為0.7%。
易錯PCR體系(100 ill):
10 X buffer 10 ii 1 dATP 2 ii 1 dTTP 2 ii 1 dCTP 2 ii 1:0090] dGTP 2 ii 1
:0091] Mgcl2 6ul
:0092] 上游引物 4 ill
:0093] 下游引物 4 ill
:0094] 質(zhì)粒DNA模板 4 ii 1
:0095] Taq DNA聚合酶 1 ii 1
:0096] ddH20 63 ii 1
:0097] 總體積 100 ill PCR程序為94。C預(yù)變性4min，94。C變性lmin，56。C退火lmin，72。C延伸lmin40s，反應(yīng)35個循環(huán)，最后72t:延伸10min，取5iU產(chǎn)物1 %瓊脂糖凝膠電泳檢驗，-2(rC保存?zhèn)溆谩?(4)易錯PCR產(chǎn)物的回收 易錯PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳檢驗，切下特異擴增帶，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑，按說明回收擴增的基因片斷。
2、DNA改組 將易錯PCR擴增的片段庫作為DNA改組的模板，以pfu為DNA聚合酶，按以下操作進行串聯(lián)基因的DNA改組PCR程序(D94。C， lmin —50°C， lmin —72。C，20s，10個循環(huán)(2)94°C， lmin —52°C， lminlOs—72。C，20s，20個循環(huán)(3)94°C， lmin —53°C， lmin30s—72。C，20s，70個循環(huán)72"保溫10min使延伸完全。PCR體系為易錯PCR產(chǎn)物2ii 14Xd證s4ii 1上游引物(lOpmol) 2iU下游引物(lOpmol) 2iU10X buffer5ii 1pfu DNA聚合酶0. 5ii 1ddH2032 ii 1總體積50 ii 13、突變庫的構(gòu)建(1)構(gòu)建轉(zhuǎn)化菌體庫DNA改組后的混合物經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoR I和BamH I雙酶切消化后，與用相同內(nèi)切酶消化的PBV220質(zhì)粒進行連接反應(yīng)，然后用連接產(chǎn)物pBV-aroG-pheA混合物轉(zhuǎn)化E. coli
JM109，構(gòu)建轉(zhuǎn)化菌體庫。 (2)構(gòu)建表達突變庫 提取轉(zhuǎn)化菌體庫的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化酪氨酸營養(yǎng)缺陷型E. coli K-12菌株，構(gòu)建表達突變庫。
4、高產(chǎn)酸菌株的篩選 (1)挑取突變菌株至含150iU LB/Amp培養(yǎng)基的96孔板中37。C、150rpm培養(yǎng)48h，3000rpm/min離心，取突變菌株發(fā)酵液上清，待測。 (2)取發(fā)酵液上清用鹽酸稀釋倍后，采用三波段測量法，測定上清液中L-苯丙氨酸的濃度，從近萬株突變株中篩選獲取4株L-苯丙氨酸產(chǎn)量不同程度提高的優(yōu)步驟良突變株ES-1976-1、 ES-3421-1、 ES-5748-l、 ES-8768-l。 步驟三第二輪次體外定向協(xié)同共進化改良L-苯丙氨酸基因工程菌
1、重組串聯(lián)基因pBV-aroG-pheA的制備 (1)用限制性內(nèi)切酶EcoR I和BamH I消化含有4種優(yōu)良突變串聯(lián)基因aroG-pheA的質(zhì)粒和pMD-18T載體。 (2)分別將回收的4種優(yōu)良突變串聯(lián)基因aroG-pheA與限制性內(nèi)切酶EcoR I和BamH I消化的pMD-18T載體鏈接，構(gòu)建pMD-aroG-pheA突變載體。 (3)分別篩選獲取含4種優(yōu)良突變串聯(lián)基因aroG-pheA的陽性克隆子，用堿裂解法提取其質(zhì)粒，1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測，估計質(zhì)粒DNA濃度，將4種質(zhì)粒等量混合。
2、以等量混合的質(zhì)粒作為第二輪次DNA改組的模板，以pfu為DNA聚合酶，按以下操作進行串聯(lián)基因的第二輪次DNA改組PCR程序(D94。C， lmin —50°C， lmin —'72。C，20s，10個循環(huán)(2)94°C， lmin —52°C， lminlOs—72。C，20s，20個循環(huán)(3)94°C， lmin —53°C， lmin30s—72。C，20s，70個循環(huán)72"保溫10min使延伸完全。PCR體系為混合質(zhì)粒模板2ii 14Xd證s4ii 1上游引物(lOpmol) 2iU下游引物(lOpmol) 2iU10X buffer5ii 1pfu DNA聚合酶0. 5ii 1ddH2032 ii 1總體積50 ii 13、突變庫的構(gòu)建(1)構(gòu)建轉(zhuǎn)化菌體庫DNA改組后的混合物經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoR I和BamH I雙酶切消化后，與用相同內(nèi)切酶消化的pBV200質(zhì)粒進行連接反應(yīng)。然后用連接產(chǎn)物pBV-aroG-pheA混合物轉(zhuǎn)化E. coli
JM109，構(gòu)建轉(zhuǎn)化菌體庫。 (2)構(gòu)建表達突變庫 提取轉(zhuǎn)化菌體庫的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化E.coliK-12酪氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株，構(gòu)建表達突變庫。 4、高產(chǎn)酸菌株的篩選
方法同步驟二中的高產(chǎn)酸菌株篩選步驟。 從近萬個突變株中篩選獲得一株L-苯丙氨酸產(chǎn)量比未改造菌株提高114%的優(yōu)
良突變株ES2-4573。 5、優(yōu)良突變株質(zhì)粒穩(wěn)定性實驗 從平板中挑取優(yōu)良突變株ES-4573-2單菌落，接入2ml含Amp抗生素的LB培養(yǎng)基中，3(TC培養(yǎng)過夜，將種子20ul接入不含Amp抗生素的LB培養(yǎng)基中，35。C培養(yǎng)使菌株在熱誘導(dǎo)前在無Amp的培養(yǎng)基中連續(xù)生長48h，繁殖50代以上，最后一次，細菌在生長到0D600=0. 3時，轉(zhuǎn)入37。C誘導(dǎo)，取樣涂于不含Amp的LB平板上，次日，隨機挑取菌落100個點含Amp的平板上，在含Amp平板上生長菌落的百分?jǐn)?shù)為97% ，證明基因工程菌有較高的質(zhì)粒穩(wěn)定性。 6、優(yōu)良突變株aroG和pheA基因序列的分析 堿裂解法提取優(yōu)良突變株ES-4573-2的質(zhì)粒DNA，生工測定aroG和pheA基因序列。 測序結(jié)果表明通過兩次定向協(xié)同共進化篩選獲得的優(yōu)良L-苯丙氨酸基因工程菌的aroG-pheA串聯(lián)基因共5個堿基位點產(chǎn)生突變，其中aroG基因發(fā)生兩個堿基的突變，pheA基因發(fā)生3個堿基的突變。 將上述經(jīng)過兩輪改造后的基因工程菌突變株ES-4573-2應(yīng)用于擴大生產(chǎn)，在50M3發(fā)酵罐中平均產(chǎn)L-苯丙氨酸水平達6. 7g/100ml，比未改造的酪氨酸營養(yǎng)缺陷型工程菌提高114%，且生產(chǎn)性能穩(wěn)定。 本發(fā)明主要將本室構(gòu)建的一株L-苯丙氨酸基因工程菌上的aroG和pheA基因當(dāng)做一個整體，采用易錯PCR和DNA改組這兩種技術(shù)相結(jié)合的方法進行體外定向協(xié)同共進化改造，篩選獲得一株L-苯丙氨酸產(chǎn)量提高的114%的突變菌株。 在對L-苯丙氨酸基因工程菌進行定向進化操作以提高L-苯丙氨酸產(chǎn)量時，大腸桿菌體內(nèi)L-苯丙氨酸的代謝有多種酶共同參與，無論是對aroG，還是對pheA來說，單獨的對某一個酶進行改造，都很難破壞已經(jīng)穩(wěn)固建立的代謝平衡和酶分子間的協(xié)調(diào)。唯一的方法是將參與這一代謝途徑的所有酶或者是代謝途徑上的關(guān)鍵酶都進行改造。就是將代謝途徑上的多個關(guān)鍵酶基因同時進行隨機突變并在相同的環(huán)境壓力下進行選擇，即進行定向協(xié)同共進化，從而實現(xiàn)提高L-苯丙氨酸產(chǎn)量的目標(biāo)。 為了構(gòu)建高產(chǎn)酸的L-苯丙氨酸基因工程菌，解除產(chǎn)物L(fēng)-苯丙氨酸對關(guān)鍵酶的反饋抑制，本發(fā)明將代謝工程方法和關(guān)鍵酶分子的定向協(xié)同共進化方法相結(jié)合，對基因工程菌株的改造。在了解大腸桿菌苯丙氨酸代謝合成途徑的基礎(chǔ)上，先采用紫外誘變和NTG復(fù)合誘變技術(shù)獲得大腸桿菌K12的酪氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株作為基因工程菌的宿主，然后利用PCR技術(shù)獲取大腸桿菌K12的aroG和pheA基因并進行串聯(lián)表達(見圖3)，使代謝流充分流向L-苯丙氨酸產(chǎn)生的方向，以減少雜酸的產(chǎn)生。在構(gòu)建工程菌基礎(chǔ)上，為了獲取更高產(chǎn)的新基因工程菌株，就必須解除aroG和pheA關(guān)鍵酶受產(chǎn)物L(fēng)_苯丙氨酸的反饋抑制。本發(fā)明用易錯PCR技術(shù)和DNA改組相結(jié)合的方法構(gòu)建突變體庫，將L-苯丙氨酸代謝途徑相關(guān)的兩個關(guān)鍵酶基因aroG和pheA當(dāng)作一個整體同時進行隨機突變。突變庫中存在aroG和pheA基因不同程度改變的不同搭配，從而找到新的具有抗反饋調(diào)節(jié)機制的突變組合，快速獲得既有高的催化活性，又能抵抗L-苯丙氨酸反饋抑制的新的基因工程菌。
本發(fā)明將代謝工程方法和代謝途徑上關(guān)鍵酶分子的定向協(xié)同共進化相結(jié)合，進行工程菌株的改良。在了解大腸桿菌苯丙氨酸代謝途徑的基礎(chǔ)上，獲取aroG和pheA關(guān)鍵酶基因并進行串聯(lián)表達構(gòu)建基因工程菌，使代謝流充分流向L-苯丙氨酸產(chǎn)生的方向，以減少雜酸的產(chǎn)生。在此基礎(chǔ)上，為了獲取更高產(chǎn)的基因工程菌株，將L-苯丙氨酸工程菌代謝途徑上的兩個關(guān)鍵酶基因當(dāng)作一個整體通過兩輪次的定向共進化進行隨機突變，采用易錯PCR技術(shù)和DNA改組相結(jié)合的方法構(gòu)建突變體庫，再從中進行定向篩選高產(chǎn)L-苯丙氨酸的新基因工程菌。 通過兩輪次定向協(xié)同共進化技術(shù)篩選獲取的優(yōu)良突變株中aroG和pheA基因上存在數(shù)個位點發(fā)生堿基的突變，產(chǎn)L-苯丙氨酸水平比未改造菌株提高114X，從而找到新的既有高的催化活性，又能抵抗L-苯丙氨酸反饋抑制的基因工程菌。該技術(shù)的應(yīng)用避免了繁瑣的傳統(tǒng)紫外線和化學(xué)誘變的篩選方法，加速了關(guān)鍵酶基因的進化速度，加快了篩選的時間，降低篩選成本。高產(chǎn)L-苯丙氨酸基因工程菌的定向協(xié)同共進化技術(shù)也適用于其它類型氨基酸的進化。
權(quán)利要求
一種體外定向協(xié)同共進化改造L-苯丙氨酸基因工程菌的方法，其特征在于將L-苯丙氨酸代謝途徑的兩個關(guān)鍵酶基因aroG和pheA串聯(lián)后作為一個整體進行定向進化和篩選，從而找到新的具有抗反饋調(diào)節(jié)機制的代謝平衡，篩選其最佳的進化組合來獲得高產(chǎn)量的新L-苯丙氨酸基因工程菌；在采用的易錯PCR反應(yīng)體系中，在高鎂離子濃度和不同dNTP的濃度下，來控制隨機突變的頻率，向目的基因中引入隨機突變，構(gòu)建突變庫；最后進行高產(chǎn)酸菌株的篩選。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種體外定向協(xié)同共進化改造L-苯丙氨酸基因工程菌的方 法，其特征在于具體包括以下幾個步驟一、 L-苯丙氨酸基因工程菌的構(gòu)建(1) 采用PCR技術(shù)以E. coil K12總DNA為模板，設(shè)計引物，擴增獲取aroG和pheA基 因，利用引物和克隆載體上的多克隆位點，分別將aroG和pheA基因插入pMD18T克隆載體 上，構(gòu)建pMD-aroG和pMD-pheA重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入E. coli JM109進行測序鑒定；(2) 利用重組載體pMD-pheA上的酶切位點Kpn I和BamH I，酶切產(chǎn)物插入到相同酶切 的重組載體pMD-aroG，構(gòu)建串聯(lián)重組質(zhì)粒pMD-aroG-pheA ;(3) 利用重組載體pMD-aroG-pheA的酶切位點EcoR I和BamH I，酶切產(chǎn)物插入到相同 酶切的溫控原核表達載體pBV220，構(gòu)建串聯(lián)重組表達質(zhì)粒pBV-AroG-PheA ;(4) 將構(gòu)建的重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酪氨酸缺陷型E.coil K12，得到L-苯丙氨酸基因工程菌；二、 體外定向協(xié)同共進化改良L-苯丙氨酸基因工程菌(1) 在普通PCR反應(yīng)緩沖體系基礎(chǔ)上添加Mg2+，改變dATP、 dGTP、 dCTP、 dTTP配比濃 度，采用易錯PCR技術(shù)，構(gòu)建偶合串聯(lián)基因aroG-pheA的隨機突變庫，再以易錯PCR產(chǎn)物為 模板，利用DNA改組技術(shù)，通過控制復(fù)性溫度和延伸反應(yīng)時間，并在pfu DNA聚合酶作用下， 將含有多突變信息的小片斷連接成新的aroG-pheA基因，aroG-pheA突變庫基因進行重新 組合，獲取新的aroG-pheA突變庫；(2) 將新突變庫的偶合串聯(lián)基因aroG-pheA及其pBV220表達載體用EcoR I和BamH I 雙酶切后連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入酪氨酸缺陷型E. coil K12構(gòu)建突變表達庫，運用酶標(biāo)儀高效 篩選高產(chǎn)L-苯丙氨酸新的基因工程菌株；(3) 分別擴增獲取產(chǎn)L-苯丙氨酸提高的4株細菌的偶合串聯(lián)基因aroG-pheA，用 EcoR I和BamH I雙酶切后連接同樣雙酶切的pMD18T克隆載體，以4種含突變基因的質(zhì)粒 pMD-aroG-pheA為模板，采用DNA改組技術(shù)進行第二輪次的定向協(xié)同共進化，通過控制復(fù)性 溫度和延伸反應(yīng)時間，并在pfu DNA聚合酶作用下，將含有多突變信息的小片斷連接成新的 aroG-pheA基因，aroG-pheA突變庫基因進行重新組合，構(gòu)建新的aroG-pheA突變庫，將新突 變庫的偶合串聯(lián)基因aroG-pheA及其pBV220表達載體用EcoR I和BamH I雙酶切后連接， 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入酪氨酸缺陷型E. coil K12構(gòu)建突變表達庫，運用酶標(biāo)儀高效篩選高產(chǎn)L-苯 丙氨酸基因工程菌株。
全文摘要
本發(fā)明一種體外定向協(xié)同共進化改造L-苯丙氨酸基因工程菌的方法，將本室構(gòu)建的一株L-苯丙氨酸基因工程菌上的aroG和pheA基因當(dāng)做一個整體，采用易錯PCR和DNA改組這兩種技術(shù)相結(jié)合的方法進行體外定向協(xié)同共進化改造，篩選獲得一株L-苯丙氨酸產(chǎn)量提高的114％的突變菌株；本發(fā)明通過改造aroG和pheA偶合串聯(lián)的基因，將L-苯丙氨酸代謝途徑中關(guān)鍵酶基因aroG和pheA當(dāng)作一個整體同時進行定向改造，獲取新的代謝平衡，使之表達的酶既有高效的催化活性又能抵抗L-苯丙氨酸反饋抑制，從而篩選獲得改造后的高產(chǎn)L-苯丙氨酸新基因工程菌，該方法能為改造任何一種提高氨基酸基因工程菌產(chǎn)酸率提供范例。
文檔編號C12P19/00GK101698853SQ20091011138
公開日2010年4月28日 申請日期2009年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月31日 公開號200910111381.X
發(fā)明者劉建明, 吳偉斌, 吳松剛, 施巧琴, 施碧紅, 林宜云, 王明茲, 翁雪清, 鄭斌, 黃祥峰, 黃維綿 申請人:福建省麥丹生物集團有限公司 被以下專利引用 (1),