專利名稱：紅細胞生成素治療家養(yǎng)和飼養(yǎng)動物貧血癥的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及應用于家養(yǎng)和飼養(yǎng)動物的基因治療方法。本發(fā)明特別涉及通過施用編碼紅細胞生成素的表達載體而治療動物貧血癥的方法，以及含有所述表達載體的藥物組合物。
由慢性腎衰竭、施用化療藥物或手術引起的貧血癥是導致家養(yǎng)和飼養(yǎng)動物死亡和殘廢的一個主要原因。除了輸血，目前可用于治療狗、貓或豬貧血癥的唯一方法是施用重組人紅細胞生成素(EPO)。雖然這種治療有可能提高動物的生活質(zhì)量，但是它有兩個主要的缺點。第一，這種治療費用昂貴且不方便(動物一生中通常每周必須注射三次)。第二，接受治療的動物經(jīng)常產(chǎn)生針對人類蛋白質(zhì)的抗體，從而降低其療效，而且可能會與動物自身的EPO發(fā)生交叉反應，從而加劇貧血癥(Cowgill等人，美國獸醫(yī)學會雜志(J.Am.Vet.Med.Assoc.)212521-528(1998))。最近狗型、貓型和豬型EPO的獲得(Wen等人，血液(Blood)821507-1516(1993))可能會對克服由于跨種系施用EPO引起的免疫學影響有所幫助。然而，治療很可能依賴昂貴且要求經(jīng)常的重復。能避開這些問題的EPO給藥方法將是獸醫(yī)學領域的一項顯著進步。
本發(fā)明是建立在狗、貓和豬貧血癥可以通過施用編碼EPO的表達載體而減輕這一發(fā)現(xiàn)基礎上的。這種載體在體內(nèi)被細胞攝取，并在持久的一段時間內(nèi)(3-4個月)產(chǎn)生足夠量激素，以顯著提高動物體內(nèi)血球計數(shù)水平。通過使用編碼在接受治療的動物中發(fā)現(xiàn)的類型的EPO的載體(狗EPO給狗、貓EPO給貓和豬EPO給豬)，可以避免由于給這些動物施用人的EPO引起的免疫學問題。
一方面，本發(fā)明涉及通過施用表達載體來治療狗貧血癥的方法，所述表達載體含有主要由編碼狗紅細胞生成素組成的獨特EPO序列元件。術語“主要由…組成”指含有編碼狗EPO的正確氨基酸序列的核酸序列，以及編碼帶有非實質(zhì)性氨基酸差異的蛋白質(zhì)的核酸序列，這種非實質(zhì)性差異可由狗激素基本功能和免疫學特性的保留證明。在這一方面特別重要的是編碼的EPO不引起接受治療的動物體內(nèi)產(chǎn)生抗EPO抗體。EPO序列元件編碼成熟EPO蛋白的氨基酸序列，對于狗EPO而言，有166個殘基。在它的N-末端通常地有一段信號序列(優(yōu)選同源的信號序列)。術語“同源的信號序列”指與編碼的EPO通常相關的信號序列，如狗EPO信號序列將優(yōu)選地用于狗EPO結構序列。狗激素的完整氨基酸序列列于
圖1(SEQ ID NO1)。最初的26個氨基酸(圖中標有下劃線的)是狗信號序列，而剩余的氨基酸是成熟狗EPO的結構序列。
用于治療動物的表達載體應當優(yōu)選含有與EPO序列元件可操作地連接的啟動子元件。術語“可操作地連接”指兩個序列元件(即啟動子和EPO結構序列)通過這樣一種方式連接，使得轉(zhuǎn)錄在啟動子的控制下進行，并且EPO蛋白正確合成。應當給接受治療的動物施用量足以引起其血球計數(shù)在統(tǒng)計學上顯著增加的表達載體。
已記載有許多不同的藥物可用于增強施用的核酸在體內(nèi)的細胞攝取。雖然這些藥物都適合本發(fā)明，但是表達載體優(yōu)選與陽離子脂質(zhì)混合、作為脂質(zhì)體的一部分或者以無轉(zhuǎn)染促進藥物的形式施用。表達載體通常應當以0.01-10mg/ml的濃度施用，優(yōu)選的濃度約為0.1mg/ml。優(yōu)選的送遞方法是通過肌內(nèi)注射，但是也可以使用其它方法，如通過“基因槍”的方法。
本發(fā)明的另一方面，通過用貓EPO序列元件或豬序列元件取代表達載體中狗EPO序列元件，以上討論的治療貧血癥的方法可以應用于貓和豬。這樣，可以給貓施用含有主要由編碼貓EPO的核苷酸組成、并與啟動子元件可操作地連接的獨特EPO序列元件的表達載體。對于豬而言，表達載體中的獨特EPO序列元件將主要由編碼豬EPO的核苷酸組成。類似狗，所編碼的EPO的N-末端通常應當有一段信號序列，而且應當給接受治療的動物施用量足以引起其血球計數(shù)在統(tǒng)計學上顯著增加的表達載體。服用的表達載體優(yōu)選與陽離子脂質(zhì)混合，摻入作為脂質(zhì)體的一部分，或者以是無任何轉(zhuǎn)染促進藥物的形式施用。貓EPO的序列列于圖2(SEQ ID NO2)。圖中標有下劃線的氨基酸是貓信號序列。豬EPO的結構序列列于圖3(SEQ IDNO3)。
本發(fā)明還包括供腸胃外使用，含有上述狗、貓或豬表達載體的藥物組合物。載體應當懸浮或溶解于水溶劑諸如鹽溶液中，并且應當以約0.01-10mg/ml的濃度存在。優(yōu)選的濃度約為0.1mg/ml。
圖1圖1給出了狗EPO的完整氨基酸序列。標有下劃線的氨基酸是狗信號序列，而剩余的氨基酸是成熟的狗EPO的結構序列。
圖2圖2給出了貓EPO的完整氨基酸序列。標有下劃線的氨基酸是貓信號序列，而剩余的氨基酸是成熟的貓EPO的結構序列。
圖3圖3給出了成熟的豬EPO的完整結構序列。
圖4圖4顯示設計用來確定給狗施用狗EPO編碼DNA的效果的研究結果。將狗分成幾組，一組為對照，接受編碼人可溶性胚胎堿性磷酸酶基因的質(zhì)粒DNA(圖中用黑菱形表示)，另有三個實驗組。A組給予6劑于25ml體積中的7.5mg EPO DNA(圖中用黑方框表示)；B組給予6劑于25ml體積中的2.5mg EPO DNA(圖中用黑三角表示)；C組接受6劑于3ml體積中的2.5mg EPO DNA(圖中用X表示)。對研究中的各只狗進行為期32天的血球計數(shù)。
圖5圖5顯示腎衰竭模型中給予狗EPO編碼DNA的實驗結果。16只狗經(jīng)外科手術摘除一個腎，并使第二個腎減小約50％。間隔24小時給狗放血，誘導貧血癥。最后一次放血后，總共12只狗接受編碼狗EPO的DNA。其中6只狗接受無轉(zhuǎn)染促進劑的DNA，另6只狗接受與脂質(zhì)復合的DA。4只對照狗不進行處理。為期50天測定每只狗血球計數(shù)的百分比變化，圖中顯示了對照(黑方框)、用無轉(zhuǎn)染促進劑的DNA處理的動物(圓圈，短劃線)和用脂質(zhì)復合DNA處理的動物(圓圈，點線)的結果。
圖6該圖顯示的也是附圖5有關實驗的結果。將對照動物和用脂質(zhì)復合DNA處理的動物的數(shù)據(jù)用研究中約第12-38天觀察到的血球計數(shù)變化表示。還顯示了與這些數(shù)據(jù)有關的最佳直線的擬合。黑圓表示由脂質(zhì)復合DNA處理的動物得到的結果，方框表示對照動物的結果。定義下面的描述使用了許多涉及重組體DNA技術的術語。為了能對說明書和權利要求書有清晰和一致的理解，提供下列定義。
克隆載體在宿主細胞中可以自主復制、特征在于有一個或少量限制性內(nèi)切酶識別位點的質(zhì)粒、噬菌體DNA或其它DNA序列。外源DNA片段可在這些位點拼接到載體中，達到片段的復制和克隆。載體可含有適合用來鑒定轉(zhuǎn)化細胞的標記。例如，標記有可能提供四環(huán)素抗性或氨芐青霉素抗性。
表達載體與克隆載體類似、但能誘導克隆DNA在轉(zhuǎn)化宿主后表達的載體?？寺〉腄NA常常處于調(diào)控序列諸如啟動子或增強子的控制下(即與之可操作地連接)。啟動子序列可以是組成型的、誘導型的或抑制型的。
宿主作為表達載體或克隆載體受體的任何原核或真核細胞即是那種載體的“宿主”?？梢宰鳛樗拗鞯募毎睦釉诒绢I域中為人所共知，用于細胞轉(zhuǎn)化的技術同樣眾所周知(參閱，如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(Molecular CloningA Laboratory Manual)第二版，冷泉港出版社(1989))。宿主細胞可在體內(nèi)存在并且經(jīng)受給動物注射的核酸的轉(zhuǎn)染。
啟動子通常發(fā)現(xiàn)于基因的5’區(qū)域、位于起始密碼子附近的DNA序列。轉(zhuǎn)錄自啟動子起始。如果啟動子是可誘導的類型，則轉(zhuǎn)錄的速率可以用誘導劑提高。
表達表達指由DNA生成多肽的過程。這個過程涉及由編碼多肽的DNA片段轉(zhuǎn)錄成mRNA和由此mRNA翻譯成最終的多肽產(chǎn)物。
表達載體的制備本發(fā)明涉及通過分別施用編碼狗、貓和豬EPO的表達載體來治療狗、貓和豬貧血癥的方法。這些類型EPO的全長氨基酸序列列于圖1-3。Wen等人(血液，821507-1516(1993))描述了從這些物種中PCR擴增EPO的方法。MacLeod等人(美國獸醫(yī)學研究雜志(Am.J.Vet.Res.)591144-1148(1998))也描述了分離狗EPO并將之插入到表達載體中的方法。雖然這些方法可用于獲取適用于本發(fā)明的EPO序列，描述過的分離基因元件的許多其它技術也能使用(參閱如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊，第二版，冷泉港出版社(1989))。這樣，DNA可以化學合成，由篩選cDNA文庫獲取，或者用相應于已知EPO序列區(qū)域的PCR探針由cDNA擴增。優(yōu)選的方法是化學合成在5’端帶有信號序列編碼區(qū)段的所需EPO核苷酸序列。優(yōu)選與送遞的EPO類型同源的信號序列(例如，狗激素優(yōu)選使用狗信號序列)。然而，如果需要的話，其它信號序列也可使用，例如，狗信號序列可以用于豬結構序列。編碼信號序列的區(qū)域的5’端和EPO結構序列的3’端還應當包括限制性序列。這些限制性序列應當選擇與將用來表達EPO的載體內(nèi)的相應位點相配的。對于優(yōu)選的VR1012載體而言，DNA可以構建成5’末端有一個EcoRV位點和3’末端有一個BglII位點。
表達載體可以使用常規(guī)技術構建，并且應當包括與編碼EPO的DNA元件可操作連接的啟動子。轉(zhuǎn)錄增強子和其它調(diào)控元件也可以存在。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)錄由CMV(巨細胞病毒)啟動子起始。其它可以使用的啟動子的例子包括小鼠金屬硫蛋白I基因的啟動子(Haymer等人，分子應用遺傳學雜志(J.Mol.Appl.Gen.)1273(1982))；皰疹病毒的TK啟動子(McKnight，細胞，31355-365(1982))，和SV40早期啟動子(Benoist等人，自然，290304(1981))。
大量適合用于本發(fā)明的載體已經(jīng)被描述(Botstein等人，邁阿密冬季專題討論會(Miami Winter Symp.)19265(1982)；Broach，細胞，28203(1982)；Bollon等人，臨床血液學和腫瘤學雜志(J.Clin.Hematol.Oncol.)1039(1980)；和Maniatis，細胞生物學綜合論文(Cell BiologyA Comprehensive Treatise)，第三卷，學術出版社(Academic Press)，紐約，第563-608頁(1980))。優(yōu)選的表達載體，“VR1012”，可以如Hartikka等人描述地那樣(人類基因治療(Hum.Gene Ther.)71205-1217(1996))構建。
表達載體的化學形式許多不同的藥物已經(jīng)被用來促進體內(nèi)細胞的DNA攝取。本方法適合與所有這些藥物一起使用，但是，表達載體優(yōu)選以無轉(zhuǎn)染促進劑的形式施用，或者與陽離子脂質(zhì)混合。制備“裸露”DNA的合適方法描述于U.S.5,703,055中?？梢允褂玫年栯x子脂質(zhì)的例子描述于U.S.5,264,68和5,459,127中，而可以使用的陽離子脂質(zhì)體的例子可參閱U.S.4,897,355。當使用轉(zhuǎn)染促進劑時，應當以在接受治療的動物中達到表達載體最大細胞攝取而不引起相反的副作用為目標進行選擇。
施用的劑量形式和方式任何適合于體內(nèi)細胞轉(zhuǎn)染和隨后功能性EPO的表達的施用方式都可用于本方法。編碼EPO的表達載體可以作為唯一有活性的藥物或者與其它核酸或有治療活性的藥物一起施用。雖然肌內(nèi)注射是優(yōu)選的，但是還有其它可以使用的方式，包括真皮內(nèi)，經(jīng)皮，靜脈內(nèi)，動脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，皮內(nèi)和皮下方式。載體還可以通過“基因槍”的方法送遞給動物。
表達載體可以混入使用本領域常規(guī)方法制造的藥劑中(參閱，如雷明頓藥物科學(Remington’s Pharmaceutical Sciences)，第16版，A.Oslo編，Easton PA(1980))。通常，制劑應當適合于腸胃外施用，并且將包括水溶劑，諸如無菌等滲鹽溶液、乙醇、聚二醇水溶液、林格氏(Ringer)溶液等等。通常，表達載體應當占約0.01-10mg/ml的最終組合物。
治療方法診斷患有貧血癥的動物通常應當通過肌內(nèi)注射約0.5-30ml體積而施用0.01-20mg的劑量?？梢赃M行一次或多次注射。這樣，進行幾次注射的動物可以得到100mg或更多的總劑量。一種合適的方案包括對動物的每一后肢進行三次DNA注射，每次注射之間間隔30分鐘。通過6次注射(每次施用25ml 2.5mg EPO DNA)達到有效的治療。
這些劑量只是指導方針，而為個別動物選擇的實際劑量將由獸醫(yī)根據(jù)臨床狀況決定。通過有規(guī)律間隔地(如每兩周一次)測定接受治療的動物的血球計數(shù)，可以檢驗給定劑量的有效性。每三個或四個月重復施用可能是必要的，頻率可根據(jù)個別動物的反應進行調(diào)整。其它可能影響劑量的因素包括表達載體的細胞攝取效率和轉(zhuǎn)染后啟動子和其它調(diào)控元件誘導EPO合成的速率。
本方法適合于本領域已經(jīng)有所描述的任何體內(nèi)轉(zhuǎn)染方法。優(yōu)選的方法是那些描述于WO 90/11092和此處實施例部分中的方法。這些或類似的方法，可以有效地用于治療狗和貓貧血癥，不管病因是什么。這樣，不管貧血癥是由于慢性腎衰竭、化療或只是年老引起的，動物都會對治療方法有所反應。
實施例1編碼EPO的DNA的制備根據(jù)圖1和圖2給出的序列(包括編碼信號序列的核苷酸)，合成了編碼狗型和貓型EPO的DNA序列。合成的DNA 5’末端有一個EcoRV位點，3’末端有一個BglII位點。然后將DNA克隆到質(zhì)粒VR1012中。該質(zhì)粒含有一些基因元件，包括在體內(nèi)和體外都能促進克隆基因在哺乳動物細胞中表達的CMV啟動子。含有狗EPO基因的重組VR1012此后被稱作“狗EPO DNA”，而含有貓EPO基因的重組VR1012被稱作“貓EPO DNA”。從E.coli培養(yǎng)物中提取質(zhì)粒，并用氯化銫梯度超速離心或者陰離子交換層析純化。用分光光度法和瓊脂糖凝膠電泳鑒定DNA制備物的質(zhì)量。
實施例2注射狗EPO DNA后小鼠血球計數(shù)的上升這項研究涉及三個組的使用，每一組含有20只小鼠。第一組用狗EPODNA處理；第二組用不含狗EPO基因的質(zhì)粒DNA；而第三組作為未處理對照。對小鼠每一后肢的股直肌注射三次DNA。每次注射溶于50μl磷酸鹽緩沖液(PBS)中的25μg DNA，各注射之間間隔30分鐘。在第一次處理前第0天和處理后第9、16、23和36天測定血球計數(shù)。用肝素化血球計數(shù)管通過后眼窩靜脈穿刺收集血液。將血液管離心，并用微型血球計數(shù)毛細管讀數(shù)器測定血球計數(shù)。收集的數(shù)據(jù)如下表1注射了狗EPO DNA的小鼠的統(tǒng)計學配對分析
數(shù)據(jù)的配對分析顯示，用狗EPO DNA處理的小鼠與未注射對照組的小鼠血球計數(shù)相比，直到處理后36天仍有顯著的上升(P值小于0.05)。接受不含狗EPO基因的質(zhì)粒DNA的小鼠和未注射的小鼠相比較，顯示在第0天有顯著不同。由于收集血液時動物還未處理，因此認為這屬實驗異常。在任何其它時間點上，這兩個對照組間沒有顯著不同。處理兩周后，觀察到用狗EPO DNA處理的小鼠的血球計數(shù)下降，這可能歸于小鼠體內(nèi)誘導了對狗EPO的免疫反應。
實施例3注射了貓EPO DNA的小鼠血球計數(shù)的上升分別用貓EPO DNA和溶劑(PBS，“未處理對照”)處理兩組小鼠，每組5只。濃度、體積和注射方法如實施例2描述的那樣。在處理前第0天和處理后第7、14和21天測定血球計數(shù)。統(tǒng)計學分析結果，并列于表2。
表2注射了貓EPO DNA的小鼠的統(tǒng)計學配對分析
表2所示的數(shù)據(jù)配對分析顯示，用貓EPO DNA處理的小鼠相比于未處理對照組在處理后第7、14和21天其血球計數(shù)有顯著上升。
實施例4注射了狗EPO DNA的狗血球計數(shù)的上升為了估計引起狗體內(nèi)血球計數(shù)上升所需狗EPO DNA的量，將動物分成三個實驗組。遵循實施例2描述的通常方法，每組進行六次注射。每次注射的體積和量列于表3。
表3在注射了EPO DNA的狗研究中各實驗組條件
<p>每組有四只狗，兩只用狗EPO DNA處理，另兩只對照用含有人可溶性胚胎堿性磷酸酯酶(SEAP)基因的質(zhì)粒DNA處理。如上文所述測定血球計數(shù)。
注射狗EPO DNA導致在所有組中持續(xù)超過32天血球計數(shù)的上升，而注射SEAP DNA對血球計數(shù)沒有影響。雖然因樣品數(shù)相對較少而限制了統(tǒng)計學分析，但是在所有組中血球計數(shù)水平的百分比增加被認為是生理學相關的。數(shù)據(jù)顯示，(i)注射狗EPO DNA導致狗血球計數(shù)上升，這證實了基因治療的概念，和(ii)血球計數(shù)的上升持續(xù)了較長的一段時間，這說明接受處理的狗沒有產(chǎn)生針對EPO的免疫應答。
就各只動物而言，在“大體積，小劑量”組(總共注射了15mg 150ml)中的兩只狗都表現(xiàn)出血球計數(shù)的上升。在“大體積，大劑量”和“小體積，小劑量”兩組中，兩只動物中一只的反應高于另一只。當用“增強”劑量的狗EPO DNA在“大體積，小劑量”的條件下處理低反應者時，兩只狗都表現(xiàn)出血球計數(shù)的上升。這說明在“大體積，小劑量”的條件下給狗注射狗EPO DNA，可能會有更一致的血球計數(shù)反應。
實施例5評估腎切除和經(jīng)放血的狗中血球計數(shù)的恢復速率在腎衰竭實驗模型中，檢驗了注射狗EPO DNA對從貧血癥中恢復的速率的影響。將16只健康的beagle狗麻醉，并且將它們左腎的腎動脈、靜脈和輸尿管結扎并切斷。接著活動并切除左腎。將右腎的腎動脈在第一分叉處結扎并切斷，剩下約半個殘余的右腎進行正常灌注。讓狗在靜脈取血前至少恢復一周。為了引起貧血癥，將腎切除的狗間隔24小時放血三次。在每次確定時間取血時，取走等于體重百分之二的血液量，并且立即注回兩倍體積的林格氏乳酸鹽溶液。以上文描述的方式(“大體積，小劑量”條件)，給12只狗施用狗EPO DNA。給6只狗施用裸露狗EPO DNA，另6只狗施用以4mg DNA/3ml Lipofectamine比例與脂質(zhì)(Lipofectamine，生命技術公司，Gaithersburg，馬里蘭州)混合的狗EPO DNA。剩下四只狗在腎切除和靜脈放血后不做處理。
所有腎切除和靜脈放血的狗，在靜脈放血后立即記錄的數(shù)值顯示上升的血球計數(shù)。對照組四只狗中的三只(即沒有用狗EPO DNA處理的狗)顯示穩(wěn)定低于基線數(shù)值(在腎切除和靜脈放血前為狗記錄)的上升的血球計數(shù)。相反，用狗EPO DNA處理的狗血球計數(shù)上升，并穩(wěn)定在與那些在腎切除和靜脈放血前觀察到的數(shù)值可比的數(shù)值上。這說明在這些狗中血球計數(shù)的上升應歸于施用的DNA的EPO合成?？傊?，在用Lipofectamine混合的DNA處理的狗中血球計數(shù)上升的速率高于用裸露DNA處理的狗或未處理的狗中的數(shù)值。與這些觀察結果一致，用與Lipofectamine混合的狗EPODNA處理的狗中，其網(wǎng)狀細胞計數(shù)高于對照中的，說明紅血球的生成上升。這些結果說明，來自施用的DNA的EPO在貧血癥狗中引起較高的血球計數(shù)和較快的上升。雖然從貧血癥恢復的速率在用裸露狗EPO DNA處理的狗和未處理的狗中相當，研究的結果總體上說明EPO基因治療可以成功地應用于狗。
實施例6注射狗EPO DNA后遠交系小鼠(CD1)血球計數(shù)的上升在上文實施例2和3中，用50μl體積的DNA注射純系BalB/C小鼠。在本實施例中，用25μl體積的狗EPO DNA注射遠交系小鼠CD1。有些注射使用磷酸鈉作為溶劑(150mM pH7.2-7.4)進行，而其它用PBS進行(Dulbecco’s磷酸鹽緩沖液，生命技術公司(Life Technologies Inc.)，Gaithersburg，馬里蘭州)。
表4注射EPO DNA的遠交系小鼠的研究中各實驗組條件<
>得到的結果說明，基于DNA的EPO基因治療可以成功地應用于遠交系哺乳動物種群。還發(fā)現(xiàn)，溶于磷酸鈉的DNA相對于溶于PBS的DNA引起較高的血球計數(shù)反應，并且每一后肢注射一次25μl體積的DNA足以引起血球計數(shù)的顯著上升。
實施例7注射了狗EPO DNA后“衰老”小鼠血球計數(shù)的上升這項研究涉及“衰老”(退休的種畜)Balb/C小鼠血球計數(shù)上升的實例。
表5注射EPO DNA的衰老小鼠的研究中各實驗組條件
得到的結果說明，基于DNA的EPO基因治療可以成功地應用于治療“衰老”哺乳動物。
實施例8注射了貓EPO DNA后貓血球計數(shù)的上升注射6-8月齡的貓，第-25天切下脾，依照下文描述的方案用貓EPO DNA處理。依照上文描述提取質(zhì)粒DNA，溶于磷酸鈉，肌內(nèi)注射到股直肌中。對于陰性對照，用150mM，pH7.2-7.4的磷酸鈉注射貓。每組含有5只貓。
表6注射貓EPO DNA的貓研究中各實驗組條件
得到的結果說明，基于質(zhì)粒DNA的EPO基因治療可以成功地應用于貓。所有EPO DNA處理引起血球計數(shù)的顯著上升。就劑量而言，發(fā)現(xiàn)1mg DNA(以0.1mg/ml的濃度溶于10ml磷酸鈉，分兩次等體積注射，每條后肢一次)相比于未處理的貓引起血球計數(shù)的顯著上升。
序列表<110>PFIZER PRODUCTS INC.<120>紅細胞生成素治療家養(yǎng)和飼養(yǎng)動物貧血癥<130>PC10485A<140><141><160>3<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>192<212>PRT<213>家犬<400>1Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Leu Leu Leu Leu Leu Ser Leu Leu1 5 10 15Leu Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu Ile20 25 30Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Ile Leu Glu Ala Arg Glu Ala35 40 45Glu Asn Val Thr Met Gly Cys Ala Gln Gly Cys Ser Phe Ser Glu Ash50 55 60Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Thr Trp Lys Arg Met65 70 75 80Asp Val Gly Gln Gln Ala Leu Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu85 90 95Ser Glu Ala Ile Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Ala Asn Ala Ser Gln100 105 110Pro Ser Glu Thr Pro Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Ser Leu115 120 125Arg Ser Leu Thr Ser Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala130 135 140Met Ser Leu Pro Glu Glu Ala Ser Pro Ala Pro Leu Arg Thr Phe Thr145 150 155 160Val Asp Thr Leu Cys Lys Leu Phe Arg Ile Tyr Ser Asn Phe Leu Arg165 170 175Gly Lys Leu Thr Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Arg Gly Asp Arg180 185 190<210>2<211>192<212>PRT<213>Felis catus<400>2Met Gly Val Arg Glu Cys Pro Ala Leu Leu Leu Leu Leu Ser Leu Leu1 5 10 15Leu Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu Ile20 25 30Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Ile Leu Glu Ala Arg Glu Ala35 40 45Glu Asn Val Thr Met Gly Cys Ala Glu Gly Cys Ser Phe Ser Glu Asn50 55 60Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Thr Trp Lys Arg Met65 70 75 80Asp Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu85 90 95Ser Glu Ala Ile Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Ala Asn Ser Ser Gln100 105 110Pro Ser Glu Thr Pro Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Ser Leu115 120 125Arg Ser Leu Thr Ser Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala130 135 140Thr Ser Leu Pro Glu Ala Thr Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Phe Thr145 150 155 160Val Asp Thr Leu Cys Lys Leu Phe Arg Ile Tyr Ser Asn Phe Leu Arg165 170 175Gly Lys Leu Thr Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Arg Gly Asp Arg180 185 190<210>3<211>166<212>PRT<213>野豬<400>3Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Ile1 5 10 15Leu Glu Ala Arg Glu Ala Glu Asn Val Thr Met Gly Cys Ala Glu Gly20 25 30Cys Ser Phe Ser Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe35 40 45Tyr Thr Trp Lys Arg Met Asp Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp50 55 60Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Ile Leu Arg Gly Gln Ala Leu65 70 75 80Leu Ala Asn Ser Ser Gln Pro Ser Glu Thr Pro Gln Leu His Val Asp85 90 95Lys Ala Val Ser Ser Leu Arg Ser Leu Thr Ser Leu Leu Arg Ala Leu100 105 110Gly Ala Gln Lys Glu Ala Thr Ser Leu Pro Glu Ala Thr Ser Ala Ala115 120 125Pro Leu Arg Thr Phe Thr Val Asp Thr Leu Cys Lys Leu Phe Arg Ile130 135 140Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Thr Leu Tyr Thr Gly Glu Ala145 150 155 160Cys Arg Arg Gly Asp Arg16
權利要求
1.治療狗貧血癥的方法，包括給所述狗施用表達載體，其中a)該表達載體包括主要由編碼狗紅細胞生成素的核苷酸組成的獨特EPO序列元件；b)該表達載體還包括與所述EPO序列元件可操作連接的啟動子元件；和c)該表達載體以足夠引起狗血球計數(shù)在統(tǒng)計學上顯著增加的劑量施用。
2.權利要求1的方法，其中所述表達載體以無轉(zhuǎn)染促進劑的形式施用。
3.權利要求1的方法，其中所述表達載體與陽離子脂質(zhì)復合。
4.權利要求1的方法，其中所述表達載體作為脂質(zhì)體的一部分施用。
5.權利要求1的方法，其中所述表達載體以大約0.01-10mg/ml的濃度施用。
6.權利要求1的方法，其中所述表達載體以大約0.1mg/ml的濃度施用。
7.權利要求1-6中任一項的方法，其中所述載體以肌內(nèi)注射的方法施用。
8.供腸胃外使用的藥物組合物，包括(a)表達載體，其中i)該表達載體包括主要由編碼狗紅細胞生成素的核苷酸組成的獨特EPO序列元件；和ii)該表達載體還包括與所述EPO序列元件可操作連接的啟動子元件；和(b)溶解或懸浮該表達載體的水性溶劑。
9.權利要求8的藥物組合物，其中所述表達載體以大約0.01-10mg/ml的濃度存在。
10.權利要求8的藥物組合物，其中所述表達載體以大約0.1mg/ml的濃度存在。
11.治療貓貧血癥的方法，包括給所述貓施用表達載體，其中a)該表達載體包括主要由編碼貓紅細胞生成素的核苷酸組成的獨特EPO序列元件；b)該表達載體還包括與所述EPO序列元件可操作連接的啟動子元件；和c)該表達載體以足夠引起貓血球計數(shù)在統(tǒng)計學上顯著增加的劑量施用。
12.權利要求11的方法，其中所述表達載體以無轉(zhuǎn)染促進劑的形式施用。
13.權利要求11的方法，其中所述表達載體與陽離子脂質(zhì)復合。
14.權利要求11的方法，其中所述表達載體作為脂質(zhì)體的一部分施用。
15.權利要求11的方法，其中所述表達載體以大約0.01-10mg/ml的濃度施用。
16.權利要求11的方法，其中所述表達載體以大約0.1mg/ml的濃度施用。
17.權利要求11-16中任一項的方法，其中所述載體以肌內(nèi)注射的方法施用。
18.供腸胃外使用的藥物組合物，包括(a)表達載體，其中i)該表達載體包括主要由編碼貓紅細胞生成素的核苷酸組成的獨特EPO序列元件；和ii)該表達載體還包括與所述EPO序列元件可操作連接的啟動子元件；和(b)溶解或懸浮該表達載體的水性溶劑。
19.權利要求18的藥物組合物，其中所述表達載體以大約0.01-10mg/ml的濃度存在。
20.權利要求18的藥物組合物，其中所述表達載體以大約0.1mg/ml的濃度存在。
21.治療豬貧血癥的方法，包括給所述豬施用表達載體，其中a)該表達載體包括主要由編碼豬紅細胞生成素的核苷酸組成的獨特EPO序列元件；b)該表達載體還包括與所述EPO序列元件可操作連接的啟動子元件；和c)該表達載體以足夠引起豬血球計數(shù)在統(tǒng)計學上顯著增加的劑量施用。
22.權利要求21的方法，其中所述表達載體以無轉(zhuǎn)染促進劑的形式施用。
23.權利要求21的方法，其中所述表達載體與陽離子脂質(zhì)復合。
24.權利要求21的方法，其中所述表達載體作為脂質(zhì)體的一部分施用。
25.權利要求21的方法，其中所述表達載體以大約0.01-10mg/ml的濃度施用。
26.權利要求21的方法，其中所述表達載體以大約0.1mg/ml的濃度施用。
27.權利要求21-26中任一項的方法，其中所述載體以肌內(nèi)注射的方法施用。
28.供腸胃外使用的藥物組合物，包括(a)表達載體，其中i)該表達載體包括主要由編碼豬紅細胞生成素的核苷酸組成的獨特EPO序列元件；和ii)該表達載體還包括與所述EPO序列元件可操作連接的啟動子元件；和(b)溶解或懸浮該表達載體的水性溶劑。
29.權利要求28的藥物組合物，其中所述表達載體以大約0.01-10mg/ml的濃度存在。
30.權利要求28的藥物組合物，其中所述表達載體以大約0.1mg/ml的濃度存在。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過施用編碼狗、貓和豬紅細胞生成素的表達載體來治療家養(yǎng)和飼養(yǎng)動物(特別是狗、貓和豬)貧血癥的方法。此外,本發(fā)明還包括含有表達載體的藥物組合物。
文檔編號C07K14/435GK1265921SQ9912675
公開日2000年9月13日 申請日期1999年12月16日 優(yōu)先權日1998年12月17日
發(fā)明者B·R·克里斯南, M·G·謝帕德 申請人:輝瑞產(chǎn)品公司