本發(fā)明涉及狐貍膽囊膽汁中膽汁酸的分離，以狐貍膽汁為原料利用hplc技術(shù)，使狐貍膽囊膽汁中的膽汁酸類(lèi)物質(zhì)得以分離。此技術(shù)適用于廢棄狐膽囊膽汁原料的有效利用。

背景技術(shù)：

hplc自20世紀(jì)70年代問(wèn)世以來(lái)，經(jīng)過(guò)幾十年的發(fā)展，在基礎(chǔ)理論、儀器裝置和色譜柱等方面的研究已經(jīng)趨于成熟，現(xiàn)在已成為最有優(yōu)勢(shì)的分離分析方法之一。它采用高壓泵及梯度調(diào)配器輸送流動(dòng)相，經(jīng)過(guò)色譜柱把樣品中各組分進(jìn)行分離，再結(jié)合紫外、熒光、視差等不同檢測(cè)器，通過(guò)計(jì)算機(jī)自動(dòng)調(diào)控、采集和處理數(shù)據(jù)，并可對(duì)已分離的組分進(jìn)行收集。動(dòng)物膽汁中膽汁酸的組成復(fù)雜，利用hplc技術(shù)可以快速將各組分分離且收集簡(jiǎn)便。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于使狐膽囊膽汁得到有效利用，應(yīng)用hplc技術(shù)將狐膽汁中膽汁酸類(lèi)物質(zhì)快速分離收集。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：新鮮狐膽囊膽汁的凍干處理，狐凍干膽粉溶液的制備，hplc技術(shù)分離。

本發(fā)明提供的一種利用hplc技術(shù)對(duì)狐膽囊膽汁中膽汁酸類(lèi)物質(zhì)的分離制備方法，其特征是：取新鮮狐膽囊膽汁，冷凍干燥制成凍干粉，用甲醇溶解膽汁凍干粉，過(guò)濾后備用。用甲醇和磷酸氫鹽溶液(ph3～4)作為色譜柱的流動(dòng)相，對(duì)凍干粉溶液中的膽汁酸類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行分離，依照保留時(shí)間分別收集檢測(cè)器流出液。

其中，膽汁酸類(lèi)物質(zhì)包括牛磺熊去氧膽酸(tudca)、?；悄懰?tca)、?；蛆Z去氧膽酸(tcdca)、?；侨パ跄懰?tdca)。

其中，將新鮮狐膽囊膽汁置入-20℃冰箱中72小時(shí)后，用冷凍干燥機(jī)真空干燥成凍干粉。

其中，加入甲醇溶解膽汁凍干粉的條件是超聲波(功率300w，頻率25khz)溶解15分鐘。

其中，膽汁凍干粉溶液過(guò)濾膜為0.45μm的脂溶性微孔濾膜。

其中，色譜柱為waterssunfiretmc18色譜柱。

其中，磷酸氫鹽為k2hpo4和/或kh2po4。

其中，磷酸氫鹽溶液摩爾濃度為0.25～0.35m，用無(wú)機(jī)酸調(diào)節(jié)ph到3～4。

其中，流動(dòng)相為甲醇:磷酸氫鹽溶液＝80:20，流速為0.9～1.1ml/min。

其中，無(wú)機(jī)酸為h3po4。

其中，檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器。

其中，檢測(cè)器流出的液體順序依次含?；切苋パ跄懰?tudca)、?；悄懰?tca)、?；蛆Z去氧膽酸(tcdca)、牛磺去氧膽酸(tdca)。

本發(fā)明的方法具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1.首次提供了一種從狐膽囊膽汁中分離獲得4種膽汁酸的有效方法；

2.為膽汁酸獲得提供了新的原料來(lái)源。

3.本方法分離效果穩(wěn)定，操作簡(jiǎn)便易掌握。

附圖說(shuō)明

附圖1，狐膽囊膽汁的hplc色譜圖；

附圖2，標(biāo)準(zhǔn)品與狐膽汁的色譜圖比較。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1制備狐膽汁樣品溶液

取新鮮狐膽汁100g盛于燒杯內(nèi)，置于-20℃冰箱中冷凍72小時(shí)，用冷凍干燥機(jī)真空干燥，最終可獲得約2～3g膽汁凍干粉。精密稱(chēng)取凍干粉350mg，溶于50ml甲醇中，超聲波溶解10min，0.45μm脂溶性微孔濾膜過(guò)濾后備用。

實(shí)施例2分離狐膽汁樣品溶液

準(zhǔn)備超聲脫氣的流動(dòng)相，流動(dòng)相分為a、b兩部分，a為色譜純甲醇，b為0.3mol/l磷酸氫鹽溶液(ph＝4)。在205nm紫外檢測(cè)波長(zhǎng)下，將流動(dòng)相以a:b＝80:20、流速1.1ml/min的色譜系統(tǒng)平衡30min。色譜系統(tǒng)穩(wěn)定后，進(jìn)樣狐膽汁樣品溶液10ul，得到狐膽汁h(huán)plc色譜圖(見(jiàn)圖1)。

實(shí)施例3收集分離流出液

樣品分離后需注意觀察色譜峰信號(hào)，檢測(cè)器可先后檢測(cè)出8個(gè)色譜峰。其中，4號(hào)峰為?；切苋パ跄懰?tudca)，5號(hào)峰為?；悄懰?tca)，7號(hào)峰為?；蛆Z去氧膽酸(tcdca)，8號(hào)峰為?；侨パ跄懰?tdca)。因此，需要對(duì)以上色譜峰依次分別進(jìn)行收集。

利用上述方法可獲得狐膽汁中已經(jīng)分離的?；切苋パ跄懰?tudca)、?；悄懰?tca)、?；蛆Z去氧膽酸(tcdca)、?；侨パ跄懰?tdca)。

在實(shí)施例2的色譜條件下，對(duì)上述4種膽汁酸標(biāo)準(zhǔn)品的hplc色譜圖和狐膽汁樣品的hplc色譜圖進(jìn)行比對(duì)(見(jiàn)圖2)，由此確定狐膽汁中含有?；切苋パ跄懰?tudca)、?；悄懰?tca)、?；蛆Z去氧膽酸(tcdca)、?；侨パ跄懰?tdca)。

技術(shù)特征：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一種利用高效液相色譜(HPLC)對(duì)狐貍膽囊膽汁中膽酸類(lèi)物質(zhì)分離的方法。目前尚缺乏有效分離狐膽囊中膽汁酸的方法，本發(fā)明提供了一種HPLC技術(shù)分離?；切苋パ跄懰?TUDCA)、?；悄懰?TCA)、牛磺鵝去氧膽酸(TCDCA)、?；侨パ跄懰?TDCA)。該方法將新鮮的狐膽囊膽汁制成凍干粉，甲醇溶解，HPLC分離。HPLC技術(shù)采用等度洗脫方式，甲醇?磷酸氫鹽溶液(0.25～0.35mol/L，PH＝3～4)為流動(dòng)相，柱溫為15～20℃，流速為0.9～1.1ml/min。本方法填補(bǔ)了目前尚無(wú)有效分離狐膽囊中膽汁酸的方法，本方法所采用的色譜條件操作簡(jiǎn)便易掌握，分離效果穩(wěn)定，檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可以用于狐膽囊中膽汁酸類(lèi)物質(zhì)的分離。

技術(shù)研發(fā)人員：肖向紅;黃金野;張晶鈺;柴龍會(huì)
受保護(hù)的技術(shù)使用者：東北林業(yè)大學(xué);肖向紅;黃金野
技術(shù)研發(fā)日：2016.03.18
技術(shù)公布日：2017.09.26