本發(fā)明涉及分子生物學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體地，涉及用于dna
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是指一種快速檢測唾液dna中微生物污染的試劑、試劑盒與其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：2013年5月,有6個孩子的好萊塢女星兼導(dǎo)演安吉麗娜·朱莉證實,通過基因檢測得知,自己遺傳攜帶了乳腺癌易感基因brca1,使得她患乳腺癌幾率高達(dá)87％,患卵巢癌幾率50％,同時她的母親和姨媽先后因乳腺癌不幸去世。因此,朱莉分別于2014年4月和2015年3月主動接受了雙乳和卵巢的切除手術(shù),盡可能降低患癌風(fēng)險。隨著分子遺傳學(xué)的發(fā)展,根據(jù)諾貝爾獎獲得者麥克黑爾和哈羅德的研究發(fā)現(xiàn):所有腫瘤的根本機制都是基因序列的損壞,即腫瘤是一種基因病,其主要致病因素包括先天性的家族遺傳及后天的基因突變。其中,先天性的致病基因具有家族聚集性,有害突變基因遺傳給后代的概率為50％,且遺傳到有害變異基因的人群,患癌風(fēng)險將極大升高。自2005年起,基因檢測技術(shù)在腫瘤診斷領(lǐng)域的應(yīng)用正在逐步扭轉(zhuǎn)美國腫瘤患者的生存局面。今天,美國已有超過500萬人做了基因檢測，使得一些重大慢性病治愈率大幅提高，如家族型腸癌的發(fā)病率降低了90％，死亡率降低了70％；英國超過200萬人做了基因檢測，目前基因檢測已成為該國人身保險必選項目。在進行基因檢測時，外周血是最優(yōu)秀的樣本來源，但是外周血采樣必須使用專用采血管，并且運輸上也較為困難。隨著科研人員的不斷研究發(fā)現(xiàn)，唾液樣本中有大量活細(xì)胞，狀態(tài)穩(wěn)定，便于運輸，并且唾液樣本較外周血而言采樣簡單，無需專業(yè)人員就可以進行樣本采集。然而，唾液樣本的最大問題在于口腔微生物也存在于唾液中，在進行dna提取時，微生物dna也會摻雜到唾液dna中，從而影響后續(xù)醫(yī)學(xué)檢驗分析結(jié)果，甚至?xí)?dǎo)致結(jié)果不可用。因此，如何在醫(yī)學(xué)檢驗分析前檢測并評估唾液dna中微生物的污染狀態(tài)，成為了業(yè)界目前最急需解決的問題。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的主要目的就是針對以上現(xiàn)狀，提供一種快速檢測唾液dna中微生物污染的試劑、試劑盒與其應(yīng)用，以克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足。為實現(xiàn)前述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案包括：本發(fā)明實施例提供了一種快速檢測唾液dna中微生物污染的試劑，其包含具有seqidno：1所示序列的第一引物和具有seqidno：2所示序列的第二引物。在一些較為具體的實施方案中，所述試劑包括濃度為0.5um～5um的第一引物、濃度為0.5um～5um的第二引物，其余部分包含超純水；所述快速檢測唾液dna中微生物污染的試劑的ph值為8.0～9.0。在一些更為具體的實施方案中，所述試劑包括濃度為1um的第一引物、濃度為1um的第二引物，其余部分包含超純水；所述快速檢測唾液dna中微生物污染的試劑的ph值為8.5。本發(fā)明實施例還提供了一種快速檢測唾液dna中微生物污染的試劑盒，其包括前述的快速檢測唾液dna中微生物污染的試劑。在一些較為具體的實施方案中，所述試劑盒還包括pcr擴增檢測的常規(guī)組件，所述pcr擴增檢測的常規(guī)組件包括taqdna聚合酶、pcr緩沖液、脫氧核糖核苷三磷酸混合物和超純水。在一些較為具體的實施方案中，所述試劑盒還包括陰性對照物和陽性對照物。本發(fā)明實施例還提供了一種唾液dna中微生物污染的快速檢測方法，其包括：提供所述的快速檢測唾液dna中微生物污染的試劑或所述的試劑盒；將待檢測的唾液dna樣品，所述快速檢測唾液dna中微生物污染的試劑以及pcr擴增檢測的常規(guī)組件混合均勻，之后進行pcr擴增。優(yōu)選的，所述待檢測唾液dna樣品與快速檢測唾液dna中微生物污染的試劑的體積比為1ul～5ul:15ul～25ul。在一些較為具體的實施方案中，所述pcr擴增的條件包括：預(yù)擴增，包括：在90℃～100℃溫度條件下反應(yīng)1min～5min；pcr循環(huán)，包括：首先進行10～30個循環(huán)，每個循環(huán)包括：依次在90℃～100℃下保溫10s-50s，50℃～72℃下保溫10s～50s，65℃～85℃下保溫10s～50s；其后，依次在65℃～85℃下保溫1min～5min，4℃保存。更為優(yōu)選的，所述pcr循環(huán)包括：首先進行20個循環(huán)，每個循環(huán)包括：依次在95℃下保溫30s，55℃下保溫30s，72℃下保溫30s；其后，在72℃下保溫5min，4℃保存。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點包括：(1)本發(fā)明提供的一種快速檢測唾液dna中微生物污染的試劑，可有效檢測唾液dna中微生物污染程度，有效保證二代測序靶向捕獲技術(shù)應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢驗的可靠性，并大大降低因唾液dna樣本被微生物污染導(dǎo)致的后續(xù)實驗失敗帶來的實驗風(fēng)險和成本風(fēng)險，為唾液dna用于下游分子生物學(xué)檢測保駕護航。(2)本發(fā)明提供的一種快速檢測唾液dna中微生物污染的試劑，原料簡單易得，成本低廉，難度低，無需專門技術(shù)培訓(xùn)及特殊儀器設(shè)備。(2)本發(fā)明提供的一種唾液dna中微生物污染的快速檢測方法，操作方便，通過設(shè)計一對特異性靶向富集微生物序列的探針，再通過pcr對產(chǎn)物進行半定量，同時通過比對陽性及陰性對照來判斷微生物的含量，可有效檢測唾液dna中微生物污染程度。附圖說明圖1是本發(fā)明實施例1-4中不同平臺下對3份樣本進行微生物污染檢測的結(jié)果對比示意圖。具體實施方式下文將對本發(fā)明的技術(shù)方案作更為詳盡的解釋說明。但是，應(yīng)當(dāng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。在對實例描述前，有必要提供一些備注說明：采用不同廠家、不同批次的試劑會造成實驗結(jié)果的差異，屬于正?，F(xiàn)象。在進行小規(guī)模實驗時，為保證平行實驗間的重復(fù)性，建議配置試劑后，充分混勻并分裝，以保證每次實驗試劑的均一性。本發(fā)明實施例提供了一種快速檢測唾液dna中微生物污染的試劑，其包含具有seqidno：1所示序列的第一引物和具有seqidno：2所示序列的第二引物。在一些較為具體的實施方案中，所述試劑包括濃度為0.5um～5um的第一引物、濃度為0.5um～5um的第二引物，其余部分包含超純水；所述快速檢測唾液dna中微生物污染的試劑的ph值為8.0～9.0。在一些更為具體的實施方案中，所述試劑包括濃度為1um的第一引物、濃度為1um的第二引物，其余部分包含超純水；所述快速檢測唾液dna中微生物污染的試劑的ph值為8.5。本發(fā)明實施例還提供了一種快速檢測唾液dna中微生物污染的試劑盒，其包括前述的快速檢測唾液dna中微生物污染的試劑。在一些較為具體的實施方案中，所述試劑盒還包括pcr擴增檢測的常規(guī)組件，所述pcr擴增檢測的常規(guī)組件包括taqdna聚合酶、pcr緩沖液、脫氧核糖核苷三磷酸混合物和超純水。在一些實施方案之中，所述試劑盒包含：pcr擴增檢測的常規(guī)組件(2xkapahifihotstartreadymix)5ul～15ul，0.5um～5um第一引物(oligo1)1ul～10ul，0.5um-5um第二引物(oligo2)1ul～10ul。優(yōu)選的，所述試劑盒包括：2xkapahifihotstartreadymix12.5ul，1umoligo15ul，1umoligo25ul。本發(fā)明實施例還提供了一種唾液dna中微生物污染的快速檢測方法，其包括：提供所述的快速檢測唾液dna中微生物污染的試劑或所述的試劑盒；將待檢測的唾液dna樣品，所述快速檢測唾液dna中微生物污染的試劑以及pcr擴增檢測的常規(guī)組件混合均勻，之后進行pcr擴增。優(yōu)選的，所述待檢測唾液dna樣品與快速檢測唾液dna中微生物污染的試劑的體積比為1ul～5ul:15ul～25ul。在一些較為優(yōu)選的實施方案之中，所述待檢測唾液dna樣品的用量為2ng～10ng，所述快速檢測唾液dna中微生物污染的試劑的用量為15ul～30ul。更為優(yōu)選的，所述待檢測唾液dna樣品的用量為5ng，所述快速檢測唾液dna中微生物污染的試劑的用量為22.5ul。在一些實施方案之中，所述唾液dna中微生物污染的快速檢測方法還包括向待檢測唾液dna樣品與快速檢測唾液dna中微生物污染的試劑形成的混合液中加入陽性對照物和陰性對照物。在一些較為優(yōu)選的實施方案之中，所述陽性對照物為大腸桿菌dna，所述陰性對照物為人基因組dna，但并不限于此。在一些較為具體的實施方案中，所述pcr擴增的條件包括：預(yù)擴增，包括：在90℃～100℃溫度條件下反應(yīng)1min～5min，優(yōu)選為在95℃溫度條件下反應(yīng)3min；pcr循環(huán)，包括：首先進行10～30個循環(huán)，每個循環(huán)包括：依次在90℃～100℃下保溫10s-50s，50℃～72℃下保溫10s～50s，65℃～85℃下保溫10s～50s；其后，依次在65℃～85℃下保溫1min～5min，4℃保存。更為優(yōu)選的，所述pcr循環(huán)包括：首先進行20個循環(huán)，每個循環(huán)包括：依次在95℃下保溫30s，55℃下保溫30s，72℃下保溫30s；其后，在72℃下保溫5min，4℃保存。在一些實施方案之中，所述方法還包括：pcr擴增完成后，將產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。計算微生物污染程度的算法為：將電泳完畢的瓊脂糖凝膠放入凝膠成像儀中，調(diào)整焦距至清晰后，拍照檢查pcr效果，并使用成像儀分別測定待檢測唾液dna、陽性對照物在產(chǎn)物位置的光密度，通過計算待檢測唾液dna與陽性對照物的光密度關(guān)系，計算微生物污染程度。更具體的，檢查pcr效果的方法為：檢查陰性對照是否有產(chǎn)物。若有產(chǎn)物，本次pcr實驗失敗，需重新進行pcr實驗。并使用成像儀測定待檢測唾液dna、陽性對照物在產(chǎn)物位置的光密度，通過計算二者的光密度關(guān)系，進行微生物污染程度評價。進一步的，所述待檢測唾液dna、陽性對照物的產(chǎn)物位置在520bp～550bp。更為優(yōu)選的，計算微生物污染程度的方法為：使用待檢測唾液dna的光密度除以陽性對照物的光密度，并以待檢測唾液dna的光密度與陽性對照物的光密度的比值為依據(jù)，該比值大于30％為污染；該比值小于等于30％但大于10％為有污染，用于下游分析；該比值小于等于10％為無污染。其中，所述瓊脂糖凝膠電泳無特別要求，普通瓊脂糖凝膠電泳都適用本方法。以下結(jié)合附圖和若干實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步的解釋說明。實施例11.試劑準(zhǔn)備：6×loadingdye(thermo)，100bpgeneruler(thermo)，大腸桿菌dna(promega)，人基因組dna(agilent)；試劑i：2xkapahifihotstartreadymix12.5ul，oligo1(1um)5ul，oligo2(1um)5ul。2.檢測用儀器：pcr儀(longgene)，六一電泳儀，凝膠成像儀(復(fù)日)。3.實驗操作過程：(1)將3個待測樣本，陽性對照大腸桿菌dna，陰性對照人基因組dna分別取5ng；(2)取1個1.5mlep管，ep管上標(biāo)記試劑i混合液；(3)試劑i混合液準(zhǔn)備(本實驗中n＝5)：(4)反應(yīng)體系：(5)向0.2mlpcr管中按照樣本分別加入25μlpcr反應(yīng)液；(6)將樣本放入微型式離心機，設(shè)置1000×g，離心30s；(7)離心完成后將pcr管放進pcr儀中，蓋上儀器蓋子，設(shè)置反應(yīng)條件如下：設(shè)置完成后，進行pcr。(8)pcr完成后，向產(chǎn)物中加入5ul6×loadingdye，并全部點入1.5％瓊脂糖凝膠中，100v電泳90min。(9)電泳完成后，將電泳膠放入凝膠成像儀中，檢查產(chǎn)物是否在520bp左右，并且保證陰性樣本無產(chǎn)物，拍照并通過成像儀自帶軟件分析待測產(chǎn)物和陽性對照的光密度，將待測產(chǎn)物光密度除以陽性對照光密度并換算百分比，百分比>30％視為污染；10％<百分比≤30％視為有污染，但仍可用于下游分析；百分比≤10％視為無污染。4.實驗結(jié)果：樣本光密度(iod)百分比(％)1136％211652％36830％陽性對照223100％5.實驗結(jié)論：樣本1無污染，樣本2污染嚴(yán)重，樣本3有污染，但仍可用于下游分析。實施例21.試劑準(zhǔn)備：6×loadingdye(thermo)，100bpgeneruler(thermo)，大腸桿菌dna(promega)，人基因組dna(agilent)；試劑i：2xkapahifihotstartreadymix12.5ul，oligo1(1um)5ul，oligo2(1um)5ul。2.檢測用儀器：pcr儀(mycycler,biorad)，六一電泳儀，凝膠成像儀(依科賽)。3.實驗操作過程：(1)將3個待測樣本，陽性對照大腸桿菌dna，陰性對照人基因組dna分別取5ng；(2)取1個1.5mlep管，ep管上標(biāo)記試劑i混合液；(3)試劑i混合液準(zhǔn)備(本實驗中n＝5)：(4)反應(yīng)體系：(5)向0.2mlpcr管中按照樣本分別加入25μlpcr反應(yīng)液；(6)將樣本放入微型式離心機，設(shè)置1000×g，離心30s；(7)離心完成后將pcr管放進pcr儀中，蓋上儀器蓋子，設(shè)置反應(yīng)條件如下：設(shè)置完成后，進行pcr。(8)pcr完成后，向產(chǎn)物中加入5ul6×loadingdye，并全部點入1.5％瓊脂糖凝膠中，100v電泳90min。(9)電泳完成后，將電泳膠放入凝膠成像儀中，檢查產(chǎn)物是否在520bp左右，并且保證陰性樣本無產(chǎn)物，拍照并通過成像儀自帶軟件分析待測產(chǎn)物和陽性對照的光密度，將待測產(chǎn)物光密度除以陽性對照光密度并換算百分比，百分比>30％視為污染；10％<百分比≤30％視為有污染，但仍可用于下游分析；百分比≤10％視為無污染。4.實驗結(jié)果：樣本光密度(iod)百分比(％)1279％215855％37626％陽性對照289100％5.實驗結(jié)論：樣本1無污染，樣本2污染嚴(yán)重，樣本3有污染，但仍可用于下游分析。實施例31.試劑準(zhǔn)備：6×loadingdye(thermo)，100bpgeneruler(thermo)，大腸桿菌dna(promega)，人基因組dna(agilent)；試劑i：2xkapahifihotstartreadymix12.5ul，oligo1(1um)5ul，oligo2(1um)5ul。2.檢測用儀器：pcr儀(s1000,biorad)，biorad電泳儀，凝膠成像儀(依科賽)。3.實驗操作過程：(1)將3個待測樣本，陽性對照大腸桿菌dna，陰性對照人基因組dna分別取5ng；(2)取1個1.5mlep管，ep管上標(biāo)記試劑i混合液；(3)試劑i混合液準(zhǔn)備(本實驗中n＝5)：(4)反應(yīng)體系：(5)向0.2mlpcr管中按照樣本分別加入25μlpcr反應(yīng)液；(6)將樣本放入微型式離心機，設(shè)置1000×g，離心30s；(7)離心完成后將pcr管放進pcr儀中，蓋上儀器蓋子，設(shè)置反應(yīng)條件如下：設(shè)置完成后，進行pcr。(8)pcr完成后，向產(chǎn)物中加入5ul6×loadingdye，并全部點入1.5％瓊脂糖凝膠中，100v電泳90min。(9)電泳完成后，將電泳膠放入凝膠成像儀中，檢查產(chǎn)物是否在520bp左右，并且保證陰性樣本無產(chǎn)物，拍照并通過成像儀自帶軟件分析待測產(chǎn)物和陽性對照的光密度，將待測產(chǎn)物光密度除以陽性對照光密度并換算百分比，百分比>30％視為污染；10％<百分比≤30％視為有污染，但仍可用于下游分析；百分比≤10％視為無污染。4.實驗結(jié)果：樣本光密度(iod)百分比(％)1249％215556％38129％陽性對照277100％5.實驗結(jié)論：樣本1無污染，樣本2污染嚴(yán)重，樣本3有污染，但仍可用于下游分析。實施例41.試劑準(zhǔn)備：6×loadingdye(thermo)，100bpgeneruler(thermo)，大腸桿菌dna(promega)，人基因組dna(agilent)；試劑i：2xkapahifihotstartreadymix12.5ul，oligo1(1um)5ul，oligo2(1um)5ul。2.檢測用儀器：pcr儀(s1000,biorad)，biorad電泳儀，凝膠成像儀(復(fù)日)。3.實驗操作過程：(1)將3個待測樣本，陽性對照大腸桿菌dna，陰性對照人基因組dna分別取5ng；(2)取1個1.5mlep管，ep管上標(biāo)記試劑i混合液；(3)試劑i混合液準(zhǔn)備(本實驗中n＝5)：(4)反應(yīng)體系：(5)向0.2mlpcr管中按照樣本分別加入25μlpcr反應(yīng)液；(6)將樣本放入微型式離心機，設(shè)置1000×g，離心30s；(7)離心完成后將pcr管放進pcr儀中，蓋上儀器蓋子，設(shè)置反應(yīng)條件如下：設(shè)置完成后，進行pcr。(8)pcr完成后，向產(chǎn)物中加入5ul6×loadingdye，并全部點入1.5％瓊脂糖凝膠中，100v電泳90min。(9)電泳完成后，將電泳膠放入凝膠成像儀中，檢查產(chǎn)物是否在520bp左右，并且保證陰性樣本無產(chǎn)物，拍照并通過成像儀自帶軟件分析待測產(chǎn)物和陽性對照的光密度，將待測產(chǎn)物光密度除以陽性對照光密度并換算百分比，百分比>30％視為污染；10％<百分比≤30％視為有污染，但仍可用于下游分析；百分比≤10％視為無污染。4.實驗結(jié)果：樣本光密度(iod)百分比(％)1157％210853％35829％陽性對照203100％5.實驗結(jié)論：樣本1無污染，樣本2污染嚴(yán)重，樣本3有污染，但仍可用于下游分析。圖1是實施例1-4中不同平臺下對3份樣本進行微生物污染檢測的結(jié)果對比示意圖。從以上實施例1-4和圖1可以明顯看到，本發(fā)明的一種快速檢測唾液dna中微生物污染的試劑可以有效檢測唾液dna中的微生物污染狀況，4個實施例分別在4套的檢測儀器組下使用該方法對同3份樣本進行了微生物污染檢測，得到的結(jié)果高度一致。綜上所述，本發(fā)明的試劑可有效的檢測唾液dna中的微生物污染，不受檢測平臺的限制，同時本發(fā)明的試劑配制來源簡單，操作簡便，無需特殊人員培訓(xùn)，成本低廉。通過驗證該方法可有效的檢測唾液dna中的微生物污染，大大減少因唾液dna樣本被微生物污染導(dǎo)致的后續(xù)實驗失敗帶來的實驗風(fēng)險和成本風(fēng)險，為唾液dna用于下游分子生物學(xué)檢測保駕護航。應(yīng)當(dāng)理解，上述實施例僅為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點，其目的在于讓熟悉此項技術(shù)的人士能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實施，并不能以此限制本發(fā)明的保護范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實質(zhì)所作的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。<110>蘇州貝斯派生物科技有限公司<120>快速檢測唾液dna中微生物污染的試劑、試劑盒與其應(yīng)用<160>2<170>patentinversion3.3<210>1<211>50<212>dna<213>人工序列<400>1tcgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacagcctacgggnggcwgcag50<210>2<211>55<212>dna<213>人工序列<400>2gtctcgtgggctcggagatgtgtataagagacaggactachvgggtatctaatcc55當(dāng)前第1頁12