本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及癌癥治療和診斷領(lǐng)域，更具體的涉及與erh基因在制備膀胱癌診治產(chǎn)品中的應(yīng)用，erh基因或其表達(dá)產(chǎn)物作為分子標(biāo)志物在檢測膀胱癌中應(yīng)用，以及作為抗腫瘤藥物開發(fā)的靶標(biāo)分子，減弱膀胱癌細(xì)胞的生長。
背景技術(shù)：
：膀胱癌是泌尿外科臨床工作中常見的疾病，也是泌尿系統(tǒng)中常見的腫瘤，具有較高的發(fā)病率和致死率。膀胱癌的傳統(tǒng)的診斷方法有尿液常規(guī)化驗(yàn)、尿液脫落細(xì)胞學(xué)檢查，膀胱鏡檢，kub平片、ct、mr等影像學(xué)檢查的異常表達(dá)與疾病的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。近年來針對膀胱癌的分子靶向診治作為腫瘤綜合診治的一個重要手段和新興的治療模式在臨床中受到越來越多的關(guān)注，mki67、egfr、erbb2、tp53、pcna、ets-2等多個腫瘤標(biāo)志物均被報道與膀胱癌密切相關(guān)，鑒于膀胱癌帶來的危害性，尤其是非浸潤性膀胱癌的高復(fù)發(fā)率，使得早期診斷，復(fù)發(fā)監(jiān)測和大范圍的常規(guī)篩查很有必要，尋找敏感性及特異性高的膀胱癌的分子診治靶點(diǎn)具有十分重要的意義。發(fā)明檢測了病人膀胱癌組織及癌旁組織，發(fā)現(xiàn)erh與膀胱癌具有很好的相關(guān)性，可用于制備膀胱癌輔助診療制劑，此外，還進(jìn)行了rna干擾等細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)，研究erh對膀胱癌細(xì)胞增殖的影響，本發(fā)明為臨床膀胱癌的診療提供研究基礎(chǔ)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：一種診斷膀胱癌或發(fā)展為膀胱癌傾向性的方法，包括以下步驟：(1)檢測erh在生物學(xué)樣品中的表達(dá)水平；(2)erh表達(dá)水平的升高與膀胱癌相關(guān)。進(jìn)一步，檢測erh在生物學(xué)樣品中的表達(dá)水平是通過檢測與erh部分或全部mrna和/或與編碼erh蛋白的部分或全部氨基酸序列至少80％同源性的氨基酸序列。優(yōu)選的，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或以上同源性序列。進(jìn)一步，檢測erh在生物學(xué)樣品中的表達(dá)水平是通過檢測erh部分或全部mrna和/或檢測編碼erh蛋白的部分或全部氨基酸序列進(jìn)行。進(jìn)一步，用熒光定量pcr方法、基因芯片方法檢測生物學(xué)樣品中erh基因的表達(dá)或用免疫方法檢測生物學(xué)樣品中erh蛋白的表達(dá)。優(yōu)選的，免疫方法檢測erh蛋白表達(dá)為westernblot或elisa或膠體金檢測方法。其中，罹患膀胱癌或發(fā)展為膀胱癌傾向性的生物學(xué)樣品中erh的表達(dá)水平與正常對照組織或者癌旁組織相比，表達(dá)水平升高。檢測erh基因或蛋白的表達(dá)在制備膀胱癌診斷制劑中的應(yīng)用。進(jìn)一步，膀胱癌的診斷制劑包括用熒光定量pcr方法、基因芯片方法檢測樣本中erh基因的表達(dá)水平。熒光定量pcr法是通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對pcr產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時在線監(jiān)控反應(yīng)過程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對產(chǎn)物進(jìn)行分析，計(jì)算待測樣品模板的初始濃度?；蛐酒址Q為dna微陣列(dnamicroarray)，可分為三種主要類型：1)固定在聚合物基片(尼龍膜，硝酸纖維膜等)表面上的核酸探針或cdna片段，通常用同位素標(biāo)記的靶基因與其雜交，通過放射顯影技術(shù)進(jìn)行檢測。2)用點(diǎn)樣法固定在玻璃板上的dna探針陣列，通過與熒光標(biāo)記的靶基因雜交進(jìn)行檢測。3)在玻璃等硬質(zhì)表面上直接合成的寡核苷酸探針陣列，與熒光標(biāo)記的靶基因雜交進(jìn)行檢測。用于熒光定量pcr方法檢測膀胱癌中erh基因的產(chǎn)品含有一對特異性擴(kuò)增erh基因的引物；基因芯片包括與erh基因的核酸序列雜交的探針。進(jìn)一步，膀胱癌的診斷制劑包括用免疫方法檢測膀胱癌中erh蛋白的表達(dá)水平。優(yōu)選的，免疫方法檢測膀胱癌中erh蛋白表達(dá)的為westernblot或elisa或膠體金檢測方法。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(elisa)即將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使酶標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行的技術(shù)。elisa檢測試劑盒根據(jù)檢測目的和操作步驟可分為間接法、雙抗夾心法、競爭法、雙位點(diǎn)一步法、捕獲法測igm抗體、應(yīng)用親和素和生物素的elisa。elisa檢測試劑盒中生色底物可選擇辣根過氧化物酶(hrp)或者堿性磷酸酶(ap)。常用的免疫膠體金檢測技術(shù)：(1)免疫膠體金光鏡染色法細(xì)胞懸液涂片或組織切片，可用膠體金標(biāo)記的抗體進(jìn)行染色，也可在膠體金標(biāo)記的基礎(chǔ)上，以銀顯影液增強(qiáng)標(biāo)記，使被還原的銀原子沉積于已標(biāo)記的金顆粒表面，可明顯增強(qiáng)膠體金標(biāo)記的敏感性。(2)免疫膠體金電鏡染色法可用膠體金標(biāo)記的抗體或抗抗體與負(fù)染病毒樣本或組織超薄切片結(jié)合，然后進(jìn)行負(fù)染?？捎糜诓《拘螒B(tài)的觀察和病毒檢測。(3)斑點(diǎn)免疫金滲濾法應(yīng)用微孔濾膜作載體，先將抗原或抗體點(diǎn)于膜上，封閉后加待檢樣本，洗滌后用膠體金標(biāo)記的抗體檢測相應(yīng)的抗原或抗體。(4)膠體金免疫層析法將特異性的抗原或抗體以條帶狀固定在膜上，膠體金標(biāo)記試劑(抗體)吸附在結(jié)合墊上，當(dāng)待檢樣本加到試紙條一端的樣本墊上后，通過毛細(xì)作用向前移動，溶解結(jié)合墊上的膠體金標(biāo)記試劑后相互反應(yīng)，當(dāng)移動至固定的抗原或抗體的區(qū)域時，待檢物與金標(biāo)試劑的結(jié)合物又與之發(fā)生特異性結(jié)合而被截留，聚集在檢測帶上，可通過肉眼觀察到顯色結(jié)果。進(jìn)一步，檢測erh蛋白的elisa法為使用elisa檢測試劑盒。試劑盒中的抗體可采用市售的erh單克隆抗體。進(jìn)一步，試劑盒包括：包被erh單克隆抗體的固相載體，酶標(biāo)抗體，酶的底物，蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，陰性對照品，稀釋液，洗滌液，酶反應(yīng)終止液等。進(jìn)一步，檢測erh蛋白的膠體金法為使用檢測試劑盒，抗體可采用市售的erh單克隆抗體。進(jìn)一步，膠體金檢測試劑盒采用膠體金免疫層析技術(shù)或膠體金滲濾法。進(jìn)一步，膠體金檢測試劑盒硝酸纖維素膜上的檢測區(qū)(t)噴點(diǎn)有抗erh單克隆抗體、質(zhì)控區(qū)(c)噴點(diǎn)有免疫球蛋白igg。一種膀胱癌的基因檢測試劑盒，試劑盒檢測基因erh，采用特異的上游引物和下游引物，上游引物序列為seqidno.11，下游引物序列為seqidno.12。進(jìn)一步，該pcr試劑盒適用于目前市場上各種類型熒光定量基因擴(kuò)增儀。進(jìn)一步，上述熒光定量pcr試劑盒組分包括：特異性引物、內(nèi)參引物、熒光定量pcr反應(yīng)液。其中所述的特異性引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列為seqidno.11，下游引物序列為seqidno.12。所述內(nèi)參引物為gapdh內(nèi)參引物，上游引物序列為seqidno.13，下游引物序列為seqidno.14。一種膀胱癌蛋白檢測試劑盒，檢測試劑盒檢測erh蛋白。進(jìn)一步的，試劑盒還包括其他檢測試劑。一種檢測膀胱癌的基因芯片，基因芯片包括與erh基因的核酸序列雜交的探針。本發(fā)明所述的受試者膀胱癌診斷或檢測主要是通過測量來源于患者的生物樣品，包括細(xì)胞、組織等，可以是血液或者尿液等。用于治療或預(yù)防膀胱癌的化合物的篩選方法，該方法包括以下步驟：(1)包含與erh氨基酸序列至少80％同源性序列的多肽；(2)檢測受試化合物與上述多肽之間的結(jié)合活性；(3)選擇與上述多肽結(jié)合的化合物。優(yōu)選的，多肽與erh氨基酸序列至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或以上同源性序列。用于治療或預(yù)防膀胱癌的化合物的篩選方法，該方法包括以下步驟：(1)使化合物與細(xì)胞接觸，所述細(xì)胞表達(dá)與erh核苷酸序列至少有80％同源性的序列；(2)選擇使上述細(xì)胞表達(dá)的與erh核苷酸序列至少有80％同源性的序列表達(dá)水平降低的化合物。優(yōu)選的，細(xì)胞表達(dá)與erh核苷酸序列至少有85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或以上同源性序列。進(jìn)一步，細(xì)胞為膀胱癌細(xì)胞。用于治療或預(yù)防膀胱癌的化合物的篩選方法，該方法包括以下步驟：(1)使化合物與導(dǎo)入載體的細(xì)胞接觸，所述載體包含erh基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)和在該轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的調(diào)控下表達(dá)的報道基因；(2)測定所述報道基因的表達(dá)水平或活性；(3)選擇使報道基因表達(dá)水平或活性降低的化合物。一種治療或預(yù)防膀胱癌的方法，所述方法能降低受試者erh表達(dá)量。進(jìn)一步的，使用erh的反義寡核苷酸或干擾rna降低erh表達(dá)量。rna干擾是指由于目標(biāo)mrna降解或翻譯抑制所引起的轉(zhuǎn)錄后基因沉默。一般有19-25個堿基的單鏈或雙鏈rna，即小分子干擾rna(sirnas)，又稱干擾rna?？梢酝ㄟ^rna干擾，高效、特異地阻斷體內(nèi)同源基因表達(dá)，促使同源mrna降解，誘使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型。sirna設(shè)計(jì)完成后可以采用直接合成法或者構(gòu)建sirna表達(dá)載體，制備好的sirna可以通過磷酸鈣共沉淀法、電穿孔法、deae-葡聚糖和polybrene法、顯微注射或基因槍等機(jī)械法、陽離子脂質(zhì)體試劑法等途徑轉(zhuǎn)染細(xì)胞。反義寡核苷酸(ason)是指那些能與特定的dna、rna以堿基互補(bǔ)配對的方式結(jié)合，并阻止其轉(zhuǎn)錄與翻譯的短核苷酸片段。優(yōu)選的，干擾rna包括堿基互補(bǔ)的正義鏈和反義鏈，所述正義鏈為erhmrna上19-25個連續(xù)的核苷酸，優(yōu)選的，干擾rna針對靶點(diǎn)為seqidno.15；更優(yōu)選的，干擾rna的序列為seqidno.18和seqidno.19。一種治療或預(yù)防膀胱癌的方法，所述方法包括給受試者使用藥物有效量的抗體或者其免疫學(xué)活性片段的步驟，其中所述抗體或者免疫學(xué)活性片段與erh的蛋白結(jié)合或抑制erh蛋白活性。用于治療或預(yù)防膀胱癌的組合物，包含藥學(xué)有效量的針對erh的反義寡核苷酸或干擾rna作為活性成分，還包含藥劑學(xué)上能接受的載體。用于治療或預(yù)防膀胱癌的組合物，包含藥學(xué)有效量的與erh蛋白結(jié)合的抗體或者免疫學(xué)活性片段，還包含藥劑學(xué)上能接受的載體。包含在本發(fā)明的藥劑學(xué)上能接受的載體為在制劑時通常利用的載體，該載體包含乳糖(lactose)、右旋糖(dextrose)、蔗糖(sucrose)、山梨醇(sorbitol)、甘露醇(mannitol)、淀粉、阿拉伯橡膠、磷酸鈣、藻酸鹽(alginate)、凝膠(gelatin)、硅酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)、纖維素(cellulose)、水、糖漿、甲基纖維素(methylcellulose)、羥基苯甲酸甲酯(methylhydroxybenzoate)、丙基羥基苯甲酸丙酯(propylhydroxybenzoate)、滑石、硬脂酸鎂(stearicacidmagnesium)及礦物油(mineraloil)等，但并非局限于此。本發(fā)明的組合物除了上述成分以外還可以包含潤滑劑、濕潤劑、甜味劑、香味劑、乳化劑、懸浮劑、防腐劑等。藥劑學(xué)上能接受的載體和制劑詳細(xì)記載于雷明登氏藥學(xué)全書。本發(fā)明的組合物能通過口服或非口服進(jìn)行給藥，作為非口服給藥時，能通過靜脈內(nèi)注射，鼻腔內(nèi)注射，局部注射，腦室內(nèi)注射，脊髓腔注射，皮下注射，腹腔注射，經(jīng)皮給藥等方式進(jìn)行給藥。本發(fā)明的組合物的適合的給藥劑量根據(jù)制劑化方法、給藥方式、患者的年齡、體重、性別、病態(tài)、食物、給藥時間、給藥途徑、排泄速度及反應(yīng)靈敏性之類的因素而可以進(jìn)行多種處方，通常，熟練的醫(yī)生能夠容易地決定及處方對所希望的治療或預(yù)防有效的給藥劑量。本發(fā)明的組合物根據(jù)本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員可以容易實(shí)施的方法，利用藥劑學(xué)上能接受的載體和/或賦形劑來進(jìn)行制劑化，從而能夠以單位用量形態(tài)制備或者內(nèi)裝在多容量容器內(nèi)來制備。此時，劑型是油性或者水性介質(zhì)中的溶液、懸浮液或乳化液形態(tài)，或者也可以是浸膏劑、粉末劑、顆粒劑、片劑或者膠囊劑形態(tài)，還可以包括分散劑或者穩(wěn)定劑。erh基因或蛋白抑制劑在制備抗膀胱癌制劑中的應(yīng)用。進(jìn)一步，抗膀胱癌制劑是指可以抑制膀胱癌細(xì)胞中erh基因的表達(dá)的制劑。本領(lǐng)域人員熟知抗膀胱癌制劑可以采用下述方法中的一種和/或幾種抑制膀胱癌細(xì)胞中erh的表達(dá)水平：通過激活erh基因的抑制基因、激活抑制erh基因表達(dá)的蛋白、導(dǎo)入抑制erh表達(dá)的sirna、導(dǎo)入抑制erh表達(dá)的反義寡核苷酸、導(dǎo)入抑制erh表達(dá)的載體、激活促進(jìn)erhmrna降解的microrna、導(dǎo)入促進(jìn)erh蛋白降解的分子、抑制促進(jìn)erh基因表達(dá)的因子及蛋白的表達(dá)、抑制erh基因的啟動子或增強(qiáng)子活性、增強(qiáng)erh基因沉默子活性、導(dǎo)入與erh蛋白結(jié)合的抗體或者免疫學(xué)活性片段。優(yōu)選的，干擾rna包括堿基互補(bǔ)的正義鏈和反義鏈，所述正義鏈為erhmrna上19-25個連續(xù)的核苷酸，優(yōu)選的，干擾rna針對靶點(diǎn)為seqidno.15；更優(yōu)選的，干擾rna的序列為seqidno.18和seqidno.19。優(yōu)選的，erh基因或erh蛋白的抑制劑是采用前述用于治療或預(yù)防膀胱癌的化合物的篩選方法篩選得到的化合物。本發(fā)明的目的在于提供一種抗膀胱癌制劑，抗膀胱癌制劑抑制膀胱癌細(xì)胞中erh基因的表達(dá)。進(jìn)一步，抗膀胱癌制劑抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖或轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步，抗膀胱癌制劑抑制膀胱癌細(xì)胞腫瘤的形成。一種誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的方法，所述方法包括使用有erh編碼的多肽、erh多核苷酸或含有erh多核苷酸的載體與抗原呈遞細(xì)胞接觸。一種膀胱癌診斷試劑，包含特異性擴(kuò)增erh基因的引物，優(yōu)選的，引物序列為seqidno.11和seqidno.12。進(jìn)一步，膀胱癌診斷試劑，還包含特異性擴(kuò)增mki67、egfr、erbb2、tp53、pcna基因的引物，優(yōu)選的，引物序列為seqidno.1和seqidno.2；seqidno.3和seqidno.4；seqidno.5和seqidno.6；seqidno.7和seqidno.8；seqidno.9和seqidno.10。一種膀胱癌診斷試劑，包含與erh基因的核酸序列雜交的探針。一種膀胱癌診斷試劑，包含與erh蛋白結(jié)合的抗體或免疫學(xué)活性片段。一種干擾rna，包括堿基互補(bǔ)的正義鏈和反義鏈，所述正義鏈為erhmrna上19-25個連續(xù)的核苷酸。優(yōu)選的，干擾rna針對靶點(diǎn)為seqidno.15；更優(yōu)選的，干擾rna的序列為seqidno.18和seqidno.19。一種載體，含有編碼上述干擾rna的序列，優(yōu)選的，載體為慢病毒載體。更優(yōu)選的，載體為psc2903。一種細(xì)胞，所述細(xì)胞包含上述載體，優(yōu)選的，包含載體psc2903。應(yīng)用與本發(fā)明的背景下的術(shù)語膀胱癌“傾向性”涵蓋受試者易感于膀胱癌，具有膀胱癌趨勢、發(fā)病性、傾向或敏感性的狀態(tài)。該術(shù)語也涵蓋受試者有獲得膀胱癌的風(fēng)險。本發(fā)明正常對照組織是指健康個體或已知未患有膀胱癌個體，以該群體中檢測erh基因表達(dá)水平為對照。除非另有定義，本發(fā)明中所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員所通常理解的含義。附圖說明圖1是gv115載體示意圖圖2是rna干擾載體構(gòu)建及陽性克隆鑒定示意圖圖3是gv112載體示意圖圖4是慢病毒感染后顯微鏡下熒光圖圖5是慢病毒感染后mrna水平erh基因消減效率圖圖6是celigo檢測erh基因消減對細(xì)胞增殖的影響圖圖7是brdu檢測erh基因消減對細(xì)胞增殖的影響圖圖8是檢測erh基因消減對細(xì)胞克隆形成能力的影響圖圖9是mtt檢測erh基因消減對細(xì)胞增殖的影響圖圖10是wb檢測靶點(diǎn)降低erh基因蛋白水平表達(dá)圖具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解：在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可以對這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限定。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照廠商所建議的條件實(shí)施檢測。實(shí)施例1組織樣本rna提取及熒光定量pcr準(zhǔn)備32對膀胱癌及癌旁組織樣本，病例樣本均是經(jīng)過病理學(xué)檢查確認(rèn)的，使用trizol法提取樣本rna，rna提取后瓊脂糖凝膠電泳，進(jìn)而通過nanodrop1000分光光度計(jì)檢測rna樣品的提取情況，其中12對樣本癌組織及癌旁組織均提取合格，具體見表1，進(jìn)行后續(xù)熒光定量檢測實(shí)驗(yàn)。表1rna檢測結(jié)果實(shí)施例2熒光定量pcr1.反轉(zhuǎn)錄獲得cdna使用promegam-mlv試劑盒，具體操作見試劑盒說明書。2.引物設(shè)計(jì)表2熒光定量pcr檢測引物3.real-timepcr檢測采用takara熒光定量試劑(cat.no.drr041b)，配置12μl反應(yīng)體系：每管加入sybrpremixextaq6μl；引物mix(5μm)0.3μl；反轉(zhuǎn)錄cdna0.6μl；rnase-free水5.1μl。兩步法進(jìn)行real-timepcr：預(yù)變性95℃30s；40個循環(huán)(變性95℃5s；退火及延伸60℃30s)。并制作溶解曲線。4.數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示實(shí)時定量pcr擴(kuò)增曲線整體平行性好，表明各反應(yīng)管的擴(kuò)增效率相近，擴(kuò)增曲線拐點(diǎn)清楚，極限平而無上揚(yáng)，曲線指數(shù)期斜率較大，說明擴(kuò)增效率較高；樣本擴(kuò)增產(chǎn)物溶解曲線為單峰，表明擴(kuò)增產(chǎn)物唯一，是特異性擴(kuò)增；rt-pcr的相對定量公式：δct＝目的基因ct值-gapdhct值；-δδct＝同一序號癌旁組織δct-同一序號各樣品δct；2-δδct反映同一序號癌組織樣本相對癌旁組織樣本目的基因相對表達(dá)水平，計(jì)算erh、mki67、egfr、erbb2、tp53、pcna基因在12對膀胱癌組織及癌旁組織的相對表達(dá)水平。表3熒光定量檢測基因在膀胱癌及癌旁組織的表達(dá)水平進(jìn)一步，以mki67、egfr、erbb2、tp53、pcna作為marker基因，校正樣本對基因表達(dá)的影響。表4marker基因的√代表該基因在此樣本表達(dá)水平與已知報道相符，弱參考是指marker基因陽性數(shù)＝2的樣本，強(qiáng)參考是指marker基因陽性數(shù)≥3的樣本，否是指marker基因陽性數(shù)<2的樣本，不作為參考。根據(jù)12對樣本候選基因的表達(dá)檢測，有7對樣本為強(qiáng)參考樣本。erh基因在6對強(qiáng)參考樣本，2對弱參考樣本中上調(diào)，反映erh基因與膀胱癌具有很好的相關(guān)性。將erh基因與mki67、egfr、erbb2、tp53、pcna聯(lián)合檢測，將進(jìn)一步提高膀胱癌檢測準(zhǔn)確率。實(shí)施例3erh基因rna干擾慢病毒載體制備1.rna干擾靶點(diǎn)設(shè)計(jì)及雙鏈dnaoligo制備erh(nm_004450homosapienshomosapiensenhancerofrudimentaryhomolog(drosophila)(erh)，mrna)，根據(jù)rna干擾序列設(shè)計(jì)原則，以erh基因?yàn)槟０?，設(shè)計(jì)多個19-21ntrna干擾靶點(diǎn)序列。經(jīng)設(shè)計(jì)軟件評估測定后，選取以下序列作為干擾靶點(diǎn)：靶點(diǎn)序列：ctggtttaccgagctgata(seqidno.15)根據(jù)已選靶點(diǎn)序列設(shè)計(jì)shrna干擾序列，并在兩端添加合適的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)以完成載體構(gòu)建。除此之外，在正鏈3’端添加ttttt終止信號,而反鏈5’端添加終止信號互補(bǔ)序列。設(shè)計(jì)完成后送捷瑞公司合成單鏈dnaoligo。表5注：ccgg：agei酶切位點(diǎn)；aattc：ecori酶切位點(diǎn)；g：ecori酶切位點(diǎn)互補(bǔ)序列。將合成的單鏈dnaoligo干粉溶解于退火緩沖液中(終濃度100m)，90℃水浴15min。自然冷卻至室溫后，形成帶粘性末端的雙鏈。2.gv115載體線性化制備按照neb說明書配制50μl反應(yīng)體系，使用agei和ecori雙酶切g(shù)v115載體(載體圖譜見圖1)使其線性化(gv115載體由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司提供)。37℃(最適溫度)反應(yīng)1h，之后切膠回收目的片段。3.rna干擾慢病毒載體構(gòu)建按照fermentast4dnaligase說明書配制20μl反應(yīng)體系，將雙鏈dnaoligo與線性化的載體相連。于16℃反應(yīng)1h-3h，連接產(chǎn)物命名為psc2903，之后進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。通過pcr鑒定陽性克隆，鑒定引物如下：上游引物：cctatttcccatgattccttcata(seqidno.16)下游引物：gtaatacggttatccacgcg(seqidno.17)以鑒定引物進(jìn)行陽性克隆測序，挑選測序結(jié)果與目標(biāo)序列完全一致的克隆進(jìn)行質(zhì)粒抽提，rna干擾載體構(gòu)建及陽性克隆鑒定示意圖見圖2。實(shí)施例4rt-pcr檢測目的細(xì)胞中目的基因的表達(dá)使用trizol法提取人膀胱癌細(xì)胞5637和t24的rna，使用rt-pcr的方法檢測erh基因在人膀胱癌細(xì)胞5637和t24中mrna的表達(dá)豐度，具體步驟參考實(shí)施例2。結(jié)果見表6，2株膀胱癌細(xì)胞均高豐度表達(dá)erh基因。表6樣本δctstdev56372.610.040t244.570.170備注：δct＝目的基因ct值-內(nèi)參基因ct值；當(dāng)δct值≤12時，該細(xì)胞中基因表達(dá)豐度為高；當(dāng)12<δct值<16時，該細(xì)胞中基因表達(dá)豐度為中；當(dāng)δct值≥16時，該細(xì)胞中基因表達(dá)豐度為低。實(shí)施例5rnai慢病毒載體構(gòu)建和包裝1.載體酶切用限制性內(nèi)切酶(agei、ecori酶)消化載體gv112(由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司提供，載體圖譜見圖3)，酶切體系：10×buffer5μl；agei、ecori酶(10u/μl)各1μl；純化的載體質(zhì)粒2μg；去離子水補(bǔ)平至50μl。37℃反應(yīng)3小時或過夜，獲得線性化載體，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收目的條帶。2.目的片段的合成合成單鏈引物gv112-erh-1：5’-ccgggcctggtttaccgagctgatactcgagtatcagctcggtaaaccaggctttttg-3’(seqidno.18)gv112-erh-2：5’-aattcaaaaagcctggtttaccgagctgatactcgagtatcagctcggtaaaccaggc-3’(seqidno.19)引物退火形成雙鏈dna，合成后成對的引物干粉溶解于退火緩沖液中，90℃水浴15min，自然冷卻至室溫，gv112-erh-1和gv112-erh-2配對。3.退火產(chǎn)物與載體進(jìn)行連接以線性化載體和退火產(chǎn)物配制反應(yīng)體系，通過t4dnaligase將雙酶切線性化的載體和退火雙鏈dna連接，16℃連接1-3h，或連接過夜。4.轉(zhuǎn)化反應(yīng)產(chǎn)物加入到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈管壁數(shù)下混勻，在冰上放置30min。42℃熱激90s，冰水浴孵育2min。加入lb培養(yǎng)基，置于37℃搖床振蕩培養(yǎng)1h。取適量菌液均勻涂布在含有相應(yīng)抗生素的平板上，在恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12-16h。5.菌落pcr鑒定鑒定引物：上游引物：5’-ccatgattccttcatatttgc-3’(seqidno.20)下游引物：5’-gtaatacggttatccacgcg-3’(seqidno.21)挑取平板上的單克隆進(jìn)行pcr鑒定，鑒定引物為seqidno.20和seqidno.21，對陽性克隆進(jìn)行測序及結(jié)果分析。將正確克隆菌液擴(kuò)大培養(yǎng)、抽提，獲得高純度質(zhì)粒，用于下游病毒包裝。實(shí)施例6慢病毒感染目的細(xì)胞及基因敲出效率1.準(zhǔn)備目的細(xì)胞從液氮罐中取出人膀胱癌細(xì)胞t24凍存管，迅速放入37℃水浴中，并搖動使其盡快解凍；完全解凍后，1300rpm，離心3min，75％酒精擦拭凍存管消毒后，移至生物安全柜；吸去凍存液上清，加入1ml新鮮的完全培養(yǎng)基(1640+10％fbs)重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液接種至含有3ml完全培養(yǎng)基的6-cmdish中，輕輕晃勻后置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱；24h后更換一次培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度達(dá)80％左右傳代培養(yǎng)，保持細(xì)胞良好的生長狀態(tài)。2.細(xì)胞慢病毒感染處于對數(shù)生長期的細(xì)胞胰酶消化，完全培養(yǎng)基制成3-5×104個/ml細(xì)胞懸液，接種適量的細(xì)胞數(shù)到培養(yǎng)板中(推薦6孔板2毫升接種面積，1毫升換液體積)，繼續(xù)培養(yǎng)保證感染時鋪板量達(dá)到15-30％左右；更換感染培養(yǎng)基，加入最適病毒量進(jìn)行感染(對照組病毒滴度5×108tu/ml，感染用量4μl；實(shí)驗(yàn)組病毒滴度1×109tu/ml，感染用量2μl)；選擇感染后最適時間點(diǎn)更換為常規(guī)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)(一般為感染后8-12h左右)。觀察感染后細(xì)胞狀態(tài)及感染效率細(xì)胞狀態(tài)良好，未出現(xiàn)大量死亡現(xiàn)象，特別是保證對照組(正常目的細(xì)胞、加陰性對照病毒感染的細(xì)胞組，shctrl)與實(shí)驗(yàn)組(正常目的細(xì)胞、加erh基因shrna病毒感染的細(xì)胞組，sherh)細(xì)胞狀態(tài)相當(dāng)；熒光標(biāo)記的慢病毒感染，感染后72h左右，熒光顯微鏡觀察報告基因表達(dá)情況，熒光率即為陽性感染率。3.基因敲減效率提取對照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞總rna，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行rt-pcr檢測，具體步驟參照前述實(shí)施例。4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果對照組及實(shí)驗(yàn)組慢病毒感染目的細(xì)胞后72小時于顯微鏡下熒光觀察，觀察結(jié)果顯示細(xì)胞感染效率達(dá)到80％以上，細(xì)胞狀態(tài)正常，結(jié)果見圖4。定量pcr結(jié)果顯示，經(jīng)shrna慢病毒感染后，實(shí)驗(yàn)組t24細(xì)胞中erh基因mrna水平的表達(dá)量受到抑制(p<0.05)，敲減效率達(dá)到92.1％，具體見圖5。實(shí)施例7celigo細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測生長1.實(shí)驗(yàn)步驟：1)將處于對數(shù)生長期的對照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞胰酶消化后，完全培養(yǎng)基重懸成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)；2)根據(jù)細(xì)胞生長快慢決定鋪板細(xì)胞密度(大多數(shù)細(xì)胞鋪板數(shù)設(shè)定為2000cell/well)。每組3復(fù)孔，培養(yǎng)體系為100μl/孔，鋪板過程中需確保每孔加入細(xì)胞數(shù)目一致，37℃、5％co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；3)從鋪板后第二天開始，每天celigo檢測讀板一次，連續(xù)檢測讀板3-5天；4)通過調(diào)整analysissettings的輸入?yún)?shù)，準(zhǔn)確地計(jì)算出每次掃描孔板中的帶綠色熒光的細(xì)胞的數(shù)量；對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)繪圖，繪出5天的細(xì)胞增殖曲線。2.數(shù)據(jù)分析及實(shí)驗(yàn)結(jié)果根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)值和時間點(diǎn)，繪制基于細(xì)胞計(jì)數(shù)值的細(xì)胞生長曲線，計(jì)算各組細(xì)胞各時間點(diǎn)細(xì)胞計(jì)數(shù)值與該組第1天的細(xì)胞計(jì)數(shù)值的比值，獲得該組細(xì)胞各時間點(diǎn)的增殖倍數(shù)，根據(jù)該增殖倍數(shù)和時間點(diǎn)，繪制基于細(xì)胞增殖倍數(shù)的生長曲線，具體見圖6。結(jié)果表明，sherh組細(xì)胞與shctrl組相比，增殖抑制明顯，表明敲減erh對細(xì)胞增殖有影響。實(shí)施例8brdu檢測溴脫氧尿嘧啶核苷(brdu)可競爭性摻入s期細(xì)胞單鏈dna核苷酸序列替代胸腺嘧啶，利用抗體連接酶或熒光素作為指示系統(tǒng)標(biāo)記brdu，當(dāng)處于旺盛分裂的細(xì)胞摻入brdu后，即可檢測出含有brdu的細(xì)胞，并以此判斷細(xì)胞的數(shù)目。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度(od值)，通過od值的高低，反映正在合成dna細(xì)胞數(shù)的多少，從而反映正處于增殖狀態(tài)的細(xì)胞量。根據(jù)實(shí)施例6進(jìn)行對照組及實(shí)驗(yàn)組慢病毒感染目的細(xì)胞，進(jìn)行brdu檢測，具體實(shí)驗(yàn)步驟參照rochebrdukit(貨號11647229001)說明書。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相比shctrl對照組，sherh實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖減緩(第1天，p<0.05)，具體見圖7(od450/倍數(shù)為各實(shí)驗(yàn)組第1天、第3天相對第1天的od450倍數(shù)，表示各天的增殖倍數(shù))。實(shí)施例9細(xì)胞凋亡檢測根據(jù)實(shí)施例6進(jìn)行對照組及實(shí)驗(yàn)組慢病毒感染目的細(xì)胞，細(xì)胞慢病毒感染后第4天傳代，第5天檢測，細(xì)胞融合度達(dá)85％。具體操作步驟參考ebioscience凋亡試劑盒(貨號：88-8007)說明書。結(jié)果顯示，shrna慢病毒感染t24細(xì)胞，培養(yǎng)5天后，對照組(shctrl)和實(shí)驗(yàn)組(sherh)平均凋亡百分比分別為4.21％和11.03％，相比對照組，sherh組凋亡數(shù)增多(p<0.05)。實(shí)施例10克隆形成檢測1.實(shí)驗(yàn)步驟(1)準(zhǔn)備感染后細(xì)胞：根據(jù)實(shí)施例6進(jìn)行對照組及實(shí)驗(yàn)組慢病毒感染目的細(xì)胞，將處于對數(shù)生長期的各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞胰酶消化，完全培養(yǎng)基重懸，制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)。(2)細(xì)胞接種：于6孔板培養(yǎng)板中各實(shí)驗(yàn)組接種400-1000個細(xì)胞/孔(根據(jù)細(xì)胞生長情況確定)，每個實(shí)驗(yàn)組設(shè)3個復(fù)孔。(3)將接種好的細(xì)胞于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)到14天或絕大多數(shù)單個克隆中細(xì)胞數(shù)大于50為止，中途每隔3天進(jìn)行換液并觀察細(xì)胞狀態(tài)。(4)實(shí)驗(yàn)終止前熒光顯微鏡下對細(xì)胞克隆進(jìn)行拍照，pbs洗滌細(xì)胞1次。(5)每孔加入1ml4％多聚甲醛，固定細(xì)胞30-60min，pbs洗滌細(xì)胞1次。(6)每孔加入潔凈、無雜質(zhì)giemsa染液500μl，染細(xì)胞10-20min。(7)ddh2o洗滌細(xì)胞數(shù)次，晾干，數(shù)碼相機(jī)拍照整，克隆計(jì)數(shù)。2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過感染后細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)板上的克隆形成能力來顯示慢病毒感染后細(xì)胞的成瘤能力，shrna慢病毒感染t24細(xì)胞后，erh基因敲減組(sherh)與對照組(shctrl)相比，sherh組克隆數(shù)明顯減少(p<0.05)，具體見圖8。實(shí)施例11mtt檢測根據(jù)實(shí)施例6進(jìn)行對照組及實(shí)驗(yàn)組慢病毒感染目的細(xì)胞，分板后24至120小時進(jìn)行檢測，具體步驟參照genview的mtt試劑盒(貨號：jt343)說明書。od490/倍數(shù)為各實(shí)驗(yàn)組第1天到第5天相對第1天的od490倍數(shù)，表示各天的增殖倍數(shù)，圖9顯示sherh組與對照組(shctrl)在酶標(biāo)儀對波長490nm的光的吸收率變化倍數(shù)隨時間變化的對比。od490在這里反映了具有活力的細(xì)胞的數(shù)量。結(jié)果表明：相比shctrl組，sherh組細(xì)胞增殖減緩。實(shí)施例12westernblot檢測靶點(diǎn)降低目的基因蛋白水平表達(dá)1.總蛋白抽提進(jìn)行對照組及實(shí)驗(yàn)組慢病毒感染，收集慢病毒感染后生長狀態(tài)良好的目的細(xì)胞，提取蛋白，bca法測定蛋白濃度(碧云天bcaproteinassaykit，貨號p0010s)。調(diào)整每個樣品蛋白濃度為2μg/μl，-80℃保存?zhèn)溆谩?.sds-page根據(jù)蛋白分子量大小，配制了濃度為10％分離膠和5％濃縮膠。膠凝固后，拔去梳子，電泳緩沖液清洗上樣孔，將準(zhǔn)備好的樣品上樣。濃縮膠80ma，20min；分離膠120ma，1h。3.免疫印跡電泳結(jié)束后，使用轉(zhuǎn)移電泳裝置(bio-rad,richmoad,ca)，在4℃，300ma恒流條件下電轉(zhuǎn)120min，將蛋白轉(zhuǎn)移到pvdf膜上。4.免疫顯色1)封閉：用封閉液(含5％脫脂牛奶的tbst溶液)室溫封閉pvdf膜1h或4℃過夜；2)一抗孵育：封閉液稀釋抗體(一抗sigmamouseanti-flag，貨號f1804，1:2000，一抗santa-cruzmouseanti-gapdh貨號sc-32233，1:2000)，然后與封閉好的pvdf膜室溫孵育2h或4℃過夜；3)洗膜：tbst洗膜3次，每次10min；4)二抗孵育：用封閉液稀釋相應(yīng)的二抗(二抗santa-cruzgoatanti-mouseigg貨號sc-2005，1:2000)，室溫下孵育pvdf膜2h；5)洗膜：tbst洗膜3次，每次10min；6)x光顯影：采用thermo公司piercetmeclwesternblottingsubstrate試劑盒。(1)將pvdf膜置于平鋪好的保鮮膜上，以1：40的比例混合a液和b液，將混合液均勻滴加在pvdf膜上，避光反應(yīng)3-5min。(2)將膜取出，稍微瀝干多余的ecl底物反應(yīng)液，放入暗盒，鋪上保鮮膜(避免產(chǎn)生氣泡)，放上x光片(避免x光片的移動)，關(guān)上暗盒，曝光1-2min。(3)取出x光片，放入顯影液中，約1min后取出，在清水中漂洗幾秒鐘，后放入定影液中至少2min。(4)取出x光片，晾干，分析。5.實(shí)驗(yàn)結(jié)果westernblot結(jié)果顯示，針對靶點(diǎn)的干擾載體sherh對目的基因的表達(dá)有明顯抑制作用，因而本發(fā)明針對的靶點(diǎn)為有效靶點(diǎn)，具體結(jié)果見圖10。sequencelisting<110>徐州市中心醫(yī)院<120>erh基因在制備膀胱癌診治產(chǎn)品中的應(yīng)用<160>21<170>patentinversion3.3<210>1<211>21<212>dna<213>人工序列<400>1gcttctcttctgaccctgatg21<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<400>2ctgatggttgaggctgttcc20<210>3<211>18<212>dna<213>人工序列<400>3ggtgaccgtttgggagtt18<210>4<211>19<212>dna<213>人工序列<400>4cctgaatgacaaggtagcg19<210>5<211>21<212>dna<213>人工序列<400>5gaggttggctctgactgtacc21<210>6<211>21<212>dna<213>人工序列<400>6tccgtcccagtagattaccac21<210>7<211>22<212>dna<213>人工序列<400>7ggaaggtgaaggtgcttggatc22<210>8<211>23<212>dna<213>人工序列<400>8tagggcataagctgtgtcaccag23<210>9<211>19<212>dna<213>人工序列<400>9tgaagcaccaaaccaggag19<210>10<211>22<212>dna<213>人工序列<400>10gaaggcatctttactacacagc22<210>11<211>18<212>dna<213>人工序列<400>11gctgctgtagcgaagaga18<210>12<211>19<212>dna<213>人工序列<400>12ggctggtatgtctgggtat19<210>13<211>21<212>dna<213>人工序列<400>13tgacttcaacagcgacaccca21<210>14<211>21<212>dna<213>人工序列<400>14caccctgttgctgtagccaaa21<210>15<211>19<212>dna<213>人工序列<400>15ctggtttaccgagctgata19<210>16<211>24<212>dna<213>人工序列<400>16cctatttcccatgattccttcata24<210>17<211>20<212>dna<213>人工序列<400>17gtaatacggttatccacgcg20<210>18<211>58<212>dna<213>人工序列<400>18ccgggcctggtttaccgagctgatactcgagtatcagctcggtaaaccaggctttttg58<210>19<211>58<212>dna<213>人工序列<400>19aattcaaaaagcctggtttaccgagctgatactcgagtatcagctcggtaaaccaggc58<210>20<211>21<212>dna<213>人工序列<400>20ccatgattccttcatatttgc21<210>21<211>20<212>dna<213>人工序列<400>21gtaatacggttatccacgcg20當(dāng)前第1頁12