本發(fā)明屬于干細(xì)胞領(lǐng)域，涉及以干細(xì)胞為載體靶向腫瘤組織，具體涉及miR-134及其靶基因FOXM1在制備基于間充質(zhì)干細(xì)胞的胰腺癌靶向載體中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell,MSC)具有自我更新能力及多種分化潛能，已有大量的實(shí)驗(yàn)利用MSC這一特性研究相關(guān)疾病的新的治療方法?；蛑委煴徽J(rèn)為是繼手術(shù)、放療和化療等傳統(tǒng)療法之后治療腫瘤最有前景的方案之一?；蛑委煹氖滓獑栴}是選擇合適的載體，而間充質(zhì)干細(xì)胞的趨腫瘤性使其有望成為腫瘤基因治療的有效載體。

關(guān)于間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)腫瘤的靶向作用。Scott A.Bergfeld等在文章Bone marrow-derived mesenchymal stem cells and the tumor microenvironment中詳細(xì)綜述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與腫瘤的關(guān)系，腫瘤組織具有招募骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)入其腫瘤微環(huán)境的作用[Cancer Metastasis Rev(2010)29:249-261]。Nobuhiro Hata等在研究性文章PDGF-BB Mediates the Tropism ofHuman Mesenchymal Stem Cells for Malignant Gliomas中證實(shí)了人間質(zhì)干細(xì)胞具有靶向胰腺癌的功能[Neurosurgery.2010；66(1):144-157]。隨后，Seong Muk Kim等在研究性文章CXC chemokine receptor 1enhances the ability of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells to migrate toward gliomas中發(fā)現(xiàn)CXC趨化因子受體可增強(qiáng)間質(zhì)干細(xì)胞對(duì)胰腺癌的靶向[Biochem Biophys Res Commun.2011,741-746]。楊小麗等發(fā)現(xiàn)MSC具有靶向結(jié)腸癌組織的作用(間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞Hct-116形成的裸鼠腫瘤的影響，中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志2015年5月第5卷第2期)。崔鳳鳴等發(fā)現(xiàn)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外向胰腺癌細(xì)胞遷移，體內(nèi)向胰腺癌組織靶向聚集(骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為胰腺癌基因治療載體的實(shí)驗(yàn)研究，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)2011年第39卷第4期)。還有研究證實(shí)MSC可靶向腎癌組織[Therapeutic potential of human mesenchymal stem cells producing IL-12in a mouse xenograft model of renal cell carcinoma.Cancer Lett,2010,290(2):157-166]。

關(guān)于間充質(zhì)干細(xì)胞與腫瘤的關(guān)系，是促進(jìn)作用還是抑制作用。Scott A.Bergfeld等在綜述文章Bone marrow-derived mesenchymal stem cells and the tumor microenvironment中指出，目前科學(xué)界對(duì)于間充質(zhì)干細(xì)胞是促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)還是抑制腫瘤的生產(chǎn)還存在嚴(yán)重分歧，間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)不同類型的腫瘤的影響作用并不明確。[Cancer Metastasis Rev(2010)29:249-261]

從現(xiàn)有技術(shù)可以看出，MSC具有取材便捷、體外擴(kuò)增能力強(qiáng)、基因轉(zhuǎn)染效率高和低免疫原性等優(yōu)點(diǎn)，可作為組織工程中的種子細(xì)胞和基因治療的靶細(xì)胞(載體)。但是，將MSC作為腫瘤組織的靶向載體至少還需解決兩個(gè)問題:第一，通過基因工程等技術(shù)對(duì)MSC進(jìn)行修飾，進(jìn)一步提高M(jìn)SC的特定腫瘤組織的靶向性；第二，如果MSC對(duì)特定腫瘤具有促進(jìn)作用，需要扭轉(zhuǎn)這種促進(jìn)作用。靜脈注射基因修飾的MSCs對(duì)肺部、腦部和皮下腫瘤的抗腫瘤作用已有報(bào)道[Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells in the treatment of gliomas.Cancer Res,2005,65:3307-3318；Antitumor effect of genetically engineered mesenchymal stem cells in a rat gliomas model.Gene Ther,2004,11:1155-1164；Mesenchymal stem cells:potential precursors for tumor stroma and targeted delivery vehicles for anticancer agents.JNatl Cancer Inst,2004,96:1593-1603；Adipose tissue-derived human mesenchymal stem cells mediated prodrug cancer gene therapy.Cancer Res,2007,67:6304-6313]。

申請(qǐng)人于2017年1月19日提交了一件miR-34a通過調(diào)節(jié)靶基因NOTCH1來提高間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)膠質(zhì)瘤U87、膠質(zhì)瘤U251、膠質(zhì)瘤C6靶向性的申請(qǐng)，該申請(qǐng)證實(shí)抑制miR-34a、上調(diào)NOTCH1基因和蛋白表達(dá)的藥物可以用于提高間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)膠質(zhì)瘤的靶向性，且該修飾的BMSC對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)無促進(jìn)作用，可以制成基于間充質(zhì)干細(xì)胞的膠質(zhì)瘤靶向載體。通過類似的技術(shù)手段可以制備基于間充質(zhì)干細(xì)胞的胰腺癌靶向載體。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在提供一種基于間充質(zhì)干細(xì)胞的胰腺癌靶向載體，通過基因工程技術(shù)對(duì)MSC進(jìn)行修飾，提高M(jìn)SC對(duì)胰腺癌的靶向性。

技術(shù)方案公布如下：

FOXM1基因在制備用于提高間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)胰腺癌靶向性的藥物中的應(yīng)用。

進(jìn)一步地，所述間充質(zhì)干細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。

一種胰腺癌靶向載體，該載體為經(jīng)過上述藥物處理過的間充質(zhì)干細(xì)胞。

FOXM1蛋白在制備用于提高間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)胰腺癌靶向性的藥物中的應(yīng)用。

進(jìn)一步地，所述間充質(zhì)干細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。

一種胰腺癌靶向載體，該載體為經(jīng)過上述藥物處理過的間充質(zhì)干細(xì)胞。

FOXM1基因的負(fù)向調(diào)節(jié)非編碼RNA miR-134在制備用于提高間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)胰腺癌靶向性的藥物中的應(yīng)用。

進(jìn)一步地，所述間充質(zhì)干細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。

一種胰腺癌靶向載體，該載體為經(jīng)過上述藥物處理過的間充質(zhì)干細(xì)胞。

上述miR-134的抑制劑用于提高間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)胰腺癌靶向性的應(yīng)用。

發(fā)明效果：

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的miR-134低表達(dá)后，間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)胰腺癌PC-3、胰腺癌PANC-1、胰腺癌SW1990的趨向性全部增強(qiáng)，靶向性增加；miR-134低表達(dá)后，F(xiàn)OXM1基因表達(dá)上調(diào)，F(xiàn)OXM1蛋白含量明顯升高，證明miR-134是通過調(diào)節(jié)其靶基因FOXM1來提高間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)胰腺癌PC-3、胰腺癌PANC-1、胰腺癌SW1990趨向性的。抑制miR-134、上調(diào)FOXM1基因和蛋白表達(dá)的藥物可以用于提高間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)胰腺癌的靶向性，且該修飾的BMSC對(duì)胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)無促進(jìn)作用，可以制成基于間充質(zhì)干細(xì)胞的胰腺癌靶向載體。

附圖說明

圖1為各組miR-134的相對(duì)表達(dá)量；

圖2為各組FOXM1蛋白相對(duì)表達(dá)量；

圖3為各組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向胰腺癌PC-3遷移細(xì)胞數(shù)；

圖4為各組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向胰腺癌PANC-1遷移細(xì)胞數(shù)；

圖5為各組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向胰腺癌SW1990遷移細(xì)胞數(shù)；

圖6為inhibitor組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向膠質(zhì)瘤U87和NIH/3T3成纖維細(xì)胞遷移數(shù)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例介紹本發(fā)明的技術(shù)方案。下述實(shí)施例中未特別強(qiáng)調(diào)的實(shí)驗(yàn)材料均為常規(guī)實(shí)驗(yàn)材料，無特別要求，都是本領(lǐng)域技術(shù)人員容易獲得的常規(guī)材料。用生物信息學(xué)在線軟件PicTar、TargetScan和MicroCosm預(yù)測(cè)miR-134的靶基因并進(jìn)行結(jié)果分析，綜合文獻(xiàn)報(bào)道和發(fā)明人前期預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定基因FOXM1為miR-134的靶基因。

實(shí)施例1：miR-134靶向調(diào)控基因FOXM1對(duì)BMSC遷移行為的影響

一、實(shí)驗(yàn)材料

miR-134mimics、miR-134mimics NC、miR-134inhibitor、miR-134inhibitor NC以及qRT-PCR引物均委托廣州市銳博生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成；其他儀器和材料均為分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)中常用的儀器和材料，無特別要求。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1、細(xì)胞培養(yǎng)

(1)BMSC的分離培養(yǎng)

取4～6周齡60～80g重的健康雄性SD大鼠，脫頸處死，無菌條件下剝離出股骨和脛骨，用DMEM培養(yǎng)液(美國Gibco公司)洗骨髓腔，獲得混合細(xì)胞懸液。離心，棄上清，加入含10％胎牛血清的DMEM制成細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶中，放置于37℃、5％CO₂培養(yǎng)。48h首次換液，可見梭狀細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。每3d換液；每日顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)及生長(zhǎng)情況。細(xì)胞融合達(dá)80-90％時(shí)，傳代培養(yǎng)。

(2)胰腺癌PC-3、胰腺癌PANC-1、胰腺癌SW1990、膠質(zhì)瘤U87和NIH/3T3成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)：胰腺癌PC-3、胰腺癌PANC-1、胰腺癌SW1990、膠質(zhì)瘤U87和NIH/3T3成纖維細(xì)胞為本公司保存。將胰腺癌細(xì)胞、膠質(zhì)瘤細(xì)胞和成纖維細(xì)胞以含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，取生長(zhǎng)狀況良好的細(xì)胞消化分裝傳代。

2、BMSC的轉(zhuǎn)染

取第4代或第5代傳代的BMSC進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前一天，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BMSC以5×10⁴/400μL鋪在24孔板中；細(xì)胞融合達(dá)到60-70％時(shí)，將0.75μL的lipo3000(美國Invitrogen公司)溶解在200μL不含血清的opti-MEM(Gibco公司，美國)中，輕輕吹勻后室溫孵育15分鐘；將10μL的20μM的mimics或mimics NC或inhibitor或inhibitor NC溶解在200μL不含血清的opti-MEM中，，輕輕吹勻后室溫孵育15分鐘；將含有l(wèi)ipo3000的opti-MEM與含有mimics或mimics NC或inhibitor或inhibitor NC的opti-MEM混合，輕吹多次以保證lipo3000和mimics、mimics NC、inhibitor、inhibitor NC充分接觸，室溫孵育15分鐘后加入相應(yīng)的各孔BMSC細(xì)胞中，室溫孵育5小時(shí)后，用PBS洗掉板中的液體，更換為含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。

分組如下：空白對(duì)照組；mimics組；mimics NC組；inhibitor組；inhibitor NC組?？瞻讓?duì)照組為不進(jìn)行任何處理的BMSC。

3、qRT-PCR測(cè)定轉(zhuǎn)染后BMSC中miR-134的表達(dá)量

采用Trizol試劑盒提取上述轉(zhuǎn)染細(xì)胞的總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)A260、A280值，計(jì)算RNA含量。采用特異性miR-134反轉(zhuǎn)錄引物及U6內(nèi)參反轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。將1μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反轉(zhuǎn)錄條件：16℃30min，42℃30min，95℃10min。cDNA標(biāo)本置于-20℃保存。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95℃3min，95℃15s，62℃40s，共40個(gè)循環(huán)。以2^-△△Ct法計(jì)算miR-134的相對(duì)表達(dá)量。

4、Western Blot測(cè)定轉(zhuǎn)染后BMSC中FOXM1蛋白的表達(dá)量

取轉(zhuǎn)染48h后的各組細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌3次并盡量吸去殘留洗滌液；用RIPA裂解液進(jìn)行蛋白質(zhì)裂解，用NanoDrop 2000紫外分光光度計(jì)檢測(cè)260nm、280nm處吸光度(A)值，取A260/280nm值約為0.55的蛋白質(zhì)上清液中加入5×SDS上樣緩沖液，混勻后95℃變性5min；按100μg蛋白質(zhì)上樣量經(jīng)100g/L SDS-PAGE電泳(80V、20min)。濕轉(zhuǎn)印法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至PVDF膜；50g/L脫脂奶粉溶液室溫封閉2h，加入FOXM1兔抗人多克隆抗體(1：500稀釋)及GAPDH兔抗人多克隆抗體(1：1000稀釋)，室溫?fù)u床輕搖過夜；TBST洗膜，加入抗兔IgG的二抗，室溫?fù)u床輕搖1h；NBT/BCIP顯色，自動(dòng)凝膠分析儀照相，分析細(xì)胞中FOXM1蛋白的表達(dá)。

5、BMSC遷移實(shí)驗(yàn)(Transwell法)

使用Transwell雙室培養(yǎng)體系進(jìn)行BMSC遷移實(shí)驗(yàn)，具體包括：

在Transwell上室的聚碳酸酯膜上先加入稀釋后的Matrigel(3.9g/L)75μL，聚合成凝膠后以DMEM平衡Transwell上、下室4h。Transwell下室中加入600μL培養(yǎng)48h所得的上述膠質(zhì)瘤、胰腺癌、成纖維細(xì)胞上清液；上室以1×10⁵個(gè)/孔準(zhǔn)確加入BMSC的DMEM懸液100μL。5％CO₂培養(yǎng)箱于37℃培養(yǎng)24h后，棄去上室液體，小心取出上室，用濕棉簽擦去膜上面未穿過膜的細(xì)胞。蘇木素染色，沖洗干凈后Clearmont雙側(cè)封片，80℃烤干。倒置顯微鏡下觀察穿過膜的細(xì)胞數(shù)。每張膜中央、周圍部分各隨機(jī)取3個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野內(nèi)穿過微孔的細(xì)胞數(shù)。

二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1、倒置顯微鏡觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)變化

原代細(xì)胞：剛接種時(shí)多數(shù)呈圓形，邊界清晰，透光性好，單個(gè)球形漂浮于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。接種24h后，培養(yǎng)瓶底即出現(xiàn)少許貼壁細(xì)胞。3d時(shí)貼壁的細(xì)胞逐漸變形，多數(shù)呈紡錘形或梭形。7d時(shí)，細(xì)胞基本變成長(zhǎng)梭形，個(gè)別細(xì)胞可見細(xì)絲狀突觸，此期細(xì)胞迅速分裂繁殖，數(shù)量明顯增多，此時(shí)細(xì)胞呈集落樣聚集生長(zhǎng)。

傳代細(xì)胞：24～48h內(nèi)基本貼壁，五六天即可鋪滿瓶底，排列整齊有序。至第3代或第4代可得到足量、純度高、生長(zhǎng)性能好的BMSC。

2、轉(zhuǎn)染后miR-134的表達(dá)量

轉(zhuǎn)染miR-134inhibitor的BMSC細(xì)胞(inhibitor組)中的miR-134表達(dá)量顯著下調(diào)，其與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(inhibitor NC組)的相對(duì)表達(dá)量如圖1所示；轉(zhuǎn)染miR-134mimics的BMSC細(xì)胞(mimics組)中的miR-134表達(dá)量顯著上調(diào)，其與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(mimics NC組)的相對(duì)表達(dá)量如圖1所示。

3、轉(zhuǎn)染后FOXM1蛋白的表達(dá)量

轉(zhuǎn)染miR-134inhibitor的BMSC細(xì)胞(inhibitor組)中的FOXM1蛋白表達(dá)量顯著上調(diào)，其與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(inhibitor NC組)的相對(duì)表達(dá)量如圖2所示；轉(zhuǎn)染miR-134mimics的BMSC細(xì)胞(mimics組)中的FOXM1蛋白表達(dá)量顯著下調(diào)，其與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(mimics NC組)的相對(duì)表達(dá)量如圖2所示。

4、遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果(各組遷移細(xì)胞數(shù))

與空白對(duì)照組和mimics NC組相比，mimics組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向三種胰腺癌細(xì)胞的遷移能力明顯降低；與空白對(duì)照組和inhibitor NC組相比，inhibitor組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向三種胰腺癌細(xì)胞的遷移能力明顯提高。圖3-5列出了mimics組、mimics NC組、inhibitor組、inhibitor NC組遷移細(xì)胞數(shù)與空白對(duì)照組遷移細(xì)胞數(shù)的比值。該結(jié)果證明，miR-134下調(diào)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)胰腺癌PC-3、胰腺癌PANC-1、胰腺癌SW1990的培養(yǎng)上清液的遷移趨勢(shì)。但miR-134下調(diào)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)膠質(zhì)瘤U87和NIH/3T3成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)上清液無明顯遷移趨勢(shì)，這證明miR-134下調(diào)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)胰腺癌的靶向性具有特異性，如圖6所示。

實(shí)施例2：修飾的BMSC對(duì)胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

發(fā)明人研究了miR-134下調(diào)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)胰腺癌PC-3、胰腺癌PANC-1、胰腺癌SW1990生長(zhǎng)的影響，未發(fā)現(xiàn)其對(duì)胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)存在促進(jìn)作用。

本發(fā)明證實(shí)對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的miR-134低表達(dá)后，間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)胰腺癌PC-3、胰腺癌PANC-1、胰腺癌SW1990的趨向性全部增強(qiáng)，靶向性增加；miR-134低表達(dá)后，F(xiàn)OXM1基因表達(dá)上調(diào)，F(xiàn)OXM1蛋白含量明顯升高，證明miR-134是通過調(diào)節(jié)其靶基因FOXM1來提高間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)胰腺癌PC-3、胰腺癌PANC-1、胰腺癌SW1990趨向性的。抑制miR-134、上調(diào)FOXM1基因和蛋白表達(dá)的藥物可以用于提高間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)胰腺癌的靶向性，且該修飾的BMSC對(duì)胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)無促進(jìn)作用，可以制成基于間充質(zhì)干細(xì)胞的胰腺癌靶向載體。

上述具體實(shí)施例僅用于解釋本發(fā)明的技術(shù)方案，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明白，本發(fā)明的保護(hù)范圍并不受限于上述具體實(shí)施例。