本發(fā)明涉及重組蛋白的制備方法，特別涉及血栓治療的重組蛋白藥物異源二聚體蛇毒蛋白的制備方法。

背景技術(shù)：

心腦血管疾病尤其是血栓引起的腦梗塞和心機(jī)梗塞嚴(yán)重威脅著人類健康，影響患者的生存質(zhì)量。這類疾病是目前世界上的第三大致死因素，不僅在急性發(fā)作期給病人的生命帶來極大的威脅，而且由于極易發(fā)生的愈后不良，導(dǎo)致物力、財(cái)力的巨大耗費(fèi)。因此，對這類疾病尋找新的安全有效的藥物迫在眉睫，而蛇毒對凝血系統(tǒng)的作用越來越受到人們的重視，蛇毒中某些成分是治療上述疾病的有效藥物。

尖吻蝮蛇蛇毒抗血小板溶栓素是在中國科大生命學(xué)院多年對蛇毒蛋白組分分離、純化和活性研究的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)的一種C型凝集素樣蛋白，命名為Agkisacutacin，中文名為抗血小板溶栓素。Agkisacutacin為異源二聚體，兩個亞基表觀分子量非常接近，均在14-15kDa左右。經(jīng)MALDI-TOF MS精確測定了Agkisacucetin的分子量為30kDa。通過氨基酸N端序列測定、LC-MS和Agkisacucetin蛋白的晶體結(jié)構(gòu)等方法，最終得到Agkisacucetin的序列和晶體結(jié)構(gòu)。Agkisacutacin具有抑制血小板聚集的活性，前期的研究為將該蛋白開發(fā)成新型一類抗血栓藥物奠定了重要基礎(chǔ)。

目前Agkisacutacin主要來源是天然蛇毒的提取，天然蛇毒來源有限，純化步驟復(fù)雜，且得率較低，因此限制了Agkisacutacin作為抗血栓藥物的科學(xué)研究和臨床應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個目的是提供重組質(zhì)粒pPIC9K-A，如圖1所示，其中Agkisacutacin A鏈基因序列如SEQ ID NO.1所示；質(zhì)粒pUCZ-B，如圖2所示，其中Agkisacutacin B鏈基因序列如SEQ ID NO.2所示。

本發(fā)明還提供一種轉(zhuǎn)化體，含有重組質(zhì)粒pPIC9K-A、質(zhì)粒pUCZ-B之一或其組合。

本發(fā)明還提供轉(zhuǎn)化體，其表達(dá)重組異源二聚體蛇毒蛋白，所述異源二聚體蛇毒蛋白由A鏈、B鏈兩條肽鏈組成，其中，A鏈氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，B鏈氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

作為優(yōu)選，所述轉(zhuǎn)化體為細(xì)胞株畢赤酵母菌株。

特別的，在本發(fā)明的實(shí)施例部分，提供保藏編號為CCTCC No.M2016358的細(xì)胞株，分類命名為巴斯德畢赤酵母GS115。其表達(dá)重組異源二聚體蛇毒蛋白，所述異源二聚體蛇毒蛋白由A鏈、B鏈兩條肽鏈組成，A鏈氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，B鏈氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本發(fā)明還提供所述質(zhì)粒、所述轉(zhuǎn)化體在制備血栓治療藥物中的用途。

本發(fā)明還提供一種大量表達(dá)重組異源二聚體蛇毒蛋白的方法，包含以下幾個步驟：

Batch階段：取權(quán)利要求4-6任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化體二級種接入含pH4.0～6.0的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，添加甘油至4％，擴(kuò)增菌體，溶解氧含量DO急劇上升時，batch階段結(jié)束；

轉(zhuǎn)化期：持續(xù)補(bǔ)充含有10-15ml/L PTM1的50％甘油溶液，流速為10-15ml/h/L，這個過程維持至濕重在190-200g/L；

甲醇誘導(dǎo)階段：當(dāng)濕重達(dá)到190-200g/L時，停止甘油流加，按恒定甲醇流速限制性流加含有12ml/L PTM1的甲醇溶液；攪拌速度800-1200rpm，總共發(fā)酵70-90小時，濕重達(dá)400-600g/L；濕重g/L是指每升培養(yǎng)液中含有的菌體重量。

蛋白純化：發(fā)酵結(jié)束后，調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH至8.0，經(jīng)過高速離心、過柱，純化得到重組異源二聚體蛇毒蛋白。

作為優(yōu)選，整個過程溫度為28-34℃。

本發(fā)明還提供所述方法制備的重組蛋白。

本發(fā)明采用全基因合成方式，由已知的Agkisacutacin的蛋白序列和結(jié)構(gòu)形式獲得其編碼基因，發(fā)現(xiàn)甲醇利用型畢赤酵母一個是理想的Agkisacutacin表達(dá)系統(tǒng)，通過重組表達(dá)獲得大量高純度Agkisacutacin。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證酵母表達(dá)的重組Agkisacutacin為一異源二聚體蛋白，且具有生物學(xué)活性。

本發(fā)明首次利用巴斯德畢赤酵母表達(dá)Agkisacutacin，并進(jìn)行了中試規(guī)模的發(fā)酵工藝研究，在高密度發(fā)酵條件下表達(dá)量超過10mg/L；通過三步純化，純度達(dá)到95％以上。此外本發(fā)明還為Agkisacutacin的生產(chǎn)提供了一種簡單但是穩(wěn)健的發(fā)酵工藝。

生物材料保藏說明

保藏編號為CCTCC No.M2016358的細(xì)胞株于2016年6月30日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址為中國武漢市武漢大學(xué)，分類命名為巴斯德畢赤酵母GS115(Pichia pastoris GS115)。

附圖說明

圖1為Agkisacutacin A鏈表達(dá)載體結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為Agkisacutacin B鏈表達(dá)載體結(jié)構(gòu)示意圖；

圖3為Agkisacutacin的表達(dá)菌株Western Blot檢測結(jié)果；

圖4為Agkisacutacin的高表達(dá)菌株Western Blot檢測結(jié)果；

圖5為重組Agkisacutacin中試規(guī)模的發(fā)酵表達(dá)條件時間曲線；

圖6為重組Agkisacutacin中試規(guī)模的雙鏈、A鏈、B鏈不同誘導(dǎo)時間的表達(dá)情況；

圖7示蛋白Agkisacutacin的鑒定；

圖8示蛋白Agkisacutacin的純化；

圖9示重組Agkisacutacin的GP1b結(jié)合活性檢測結(jié)果。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明公開了一種異源二聚體蛇毒蛋白的制備方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的產(chǎn)品、方法已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。

下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：

1.實(shí)驗(yàn)材料

1.1菌株與質(zhì)粒

P.pastoris菌株GS115、pPIC9K載體購自Invitrogen公司，pUCZ載體(Zeocin抗性)由本室構(gòu)建。

1.2試劑

Yeast nitrogen base(YNB)購自BD公司；RPMI-1640培養(yǎng)基購自Hyclone公司；胎牛血清購自Gibco公司；Yeast extract和Trypton購自O(shè)XOID公司；BCA蛋白檢測試劑盒購自Pierce公司；d-Sorbitol、d-biotin、質(zhì)粒抽提試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒、膠回收試劑盒、DNA聚合酶、T4DNA鏈接酶、限制性內(nèi)切酶、蛋白marker和PAGE配置相關(guān)試劑購自上海生工；PHA和Endoglycosidase H(Endo H)購自Sigma-Aldrich公司；EZ-ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒購自Biological Industries公司；其他化學(xué)試劑購自國藥集團(tuán)。含硅泡敵購自江蘇賽歐信越消泡劑有限公司；抗Agkisacutacin抗體1B9來源于兆科公司。

1.3儀器

電子分析天平和pH計(jì)購自梅特勒-托利多公司；漩渦振蕩儀購自Scientific Industries公司；電泳儀，垂直電泳槽、水平電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)購自天能公司；半干轉(zhuǎn)膜儀、電轉(zhuǎn)儀購自Bio-Rad公司；化學(xué)發(fā)光檢測儀購自UVITEC公司；高壓滅菌鍋購自Hirayama公司；臺式冷凍離心機(jī)(Centrifuge 5810R、Centrifuge 5415R)購自eppendorf公司；超凈工作臺、搖床、恒溫培養(yǎng)箱購自上海智誠公司；PCR儀購自德國Biometra公司；酶標(biāo)儀(BLX-800)購自Bio-Tek公司；微量移液器購自法國Gilson公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱購自Themo公司；AKTA explorer、Labscale TFF System和Pellicon XL(10kD)購自Millipore公司；115Benchtop Fermentor購自New Brunswick Scientific公司，大滅菌鍋；Flex Stand system和0.45μm microfiltration cartridge購自GE healthcare；LTQ linear IT MS購自Thermo；EttanTM MDLC HPLC system購自GE healthcare；

1.4引物

1.AgkiA-Fw-Xho1:TCTCTCGAGAAAAGAGATGTCGATTGTCTCCCTGGTTGGTC

2.AgkiA-Rv-Not1-ng:ATATGCGGCCGCTTATGGCGGGGACTTGCAGACGAAAG

3.AgkiB-Fw-EcoR1:CTGAATTCGGTTTCTGTTGTCCCTTGCGTTGTTCG

4.AgkiB-Rv-Not1-ng:ATATGCGGCCGCTTATAGCTTGAACTTGCAGACGAAATAG

2.實(shí)驗(yàn)方法

2.1Agkisacutacin A鏈表達(dá)載體構(gòu)建

一、具有EcoR1與Not1酶切位點(diǎn)的A鏈目的基因的擴(kuò)增

全基因合成A鏈DNA序列，在引物AgkiA-Fw-Xho1和AgkiA-Rv-Not1-ng的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為：先94℃2分鐘；然后94℃30秒，55℃40秒，72℃30秒，共32個循環(huán)；最后72℃10分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到一條大小約396bp的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收目的條帶。

二、重組Agkisacutacin A鏈的畢赤酵母表達(dá)載體的構(gòu)建

用限制性內(nèi)切酶EcoR1和Not1對上步獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，再將酶切片段與經(jīng)相同酶雙酶切的質(zhì)粒pPIC9K用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性重組子，提質(zhì)粒，酶切鑒定，在將鑒定后的陽性克隆命名為pPIC9K-A，并送上海生工測序，測序結(jié)果顯示插入pPIC9K的EcoR1和Not1的識別位點(diǎn)間的DNA序列與預(yù)期結(jié)果完全一致。

2.2Agkisacutacin B鏈表達(dá)載體構(gòu)建

一、具有EcoR1與Not1酶切位點(diǎn)的B鏈目的基因的擴(kuò)增

全基因合成B鏈DNA序列，在引物AgkiB-Fw-EcoR1和AgkiB-Rv-Not1-ng的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為：先94℃2分鐘；然后94℃30秒，55℃40秒，72℃30秒，共32個循環(huán)；最后72℃10分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到一條大小約381bp的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收目的條帶。

二、重組Agkisacutacin B鏈的畢赤酵母表達(dá)載體的構(gòu)建

用限制性內(nèi)切酶EcoR1和Not1對上步獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，再將酶切片段與經(jīng)相同酶雙酶切的質(zhì)粒pPIC9K用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性重組子，提質(zhì)粒，酶切鑒定，在將鑒定后的陽性克隆命名為pPIC9K-B，并送上海生工測序，測序結(jié)果與預(yù)期結(jié)果完全一致。將該克隆質(zhì)粒使用BamH1和Not1進(jìn)行雙酶切，回收小片段，將回收的小片段與經(jīng)相同酶雙切的質(zhì)粒pUCZ用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性重組子，提質(zhì)粒，酶切鑒定，在將鑒定后的陽性克隆命名為pUCZ-B，并送上海生工測序，測序結(jié)果與預(yù)期結(jié)果完全一致。

2.3重組Agkisacutacin表達(dá)克隆的篩選

將畢赤酵母菌株GS115在YPD平板劃線。兩天后，將長出的單克隆挑到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。兩天后，酵母生長為乳白色，將此一級種接入YPD液體培養(yǎng)基中，此為二級種。使用此二級種制備酵母感受態(tài)，向其中電轉(zhuǎn)化入已經(jīng)用Sal1酶線性化的pPIC9K-A質(zhì)粒，涂MD平板。48-72小時后，將平板上長出的單克隆挑入MGY液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，兩天后，將該培養(yǎng)物1500g離心，棄上清，向其中加入pH5.0的BMMY培養(yǎng)基，誘導(dǎo)72小時，在此過程中，每24小時補(bǔ)充一次100％的甲醇，使BMMY培養(yǎng)基中甲醇濃度維持在0.5％。誘導(dǎo)結(jié)束之后，12000g離心，收集上清，SDS-PAGE檢測A鏈蛋白是否表達(dá)，篩選出表達(dá)A鏈的單克隆。

將此表達(dá)A鏈蛋白的GS115單克隆在MD板劃線。兩天后，將長出的單克隆挑到MGY液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。兩天后，酵母生長為乳白色，將此一級種接入YPD液體培養(yǎng)基中，此為二級種。使用此二級種制備酵母感受態(tài)，向其中電轉(zhuǎn)化入已經(jīng)用Spe1酶線性化的pUCZ-B質(zhì)粒，涂添加抗生素Zeocin的MD平板。48-72小時后，將平板上長出的單克隆挑入添加抗生素Zeocin的MGY液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，兩天后，將該培養(yǎng)物1500g離心，棄上清，向其中加入pH5.0的BMMY培養(yǎng)基，誘導(dǎo)72小時，在此過程中，每24小時補(bǔ)充一次100％的甲醇，使BMMY培養(yǎng)基中甲醇濃度維持在0.5％。誘導(dǎo)結(jié)束之后，12000g離心，收集上清，使用抗Agkisacutacin單克隆抗體進(jìn)行Western Blot檢測雙鏈蛋白是否表達(dá)，篩選出表達(dá)雙鏈的單克隆畢赤酵母GS115，其保藏編號為CCTCC No.M2016358，于2016年6月30日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，分類命名為巴斯德畢赤酵母GS115(Pichia pastoris GS115)。

2.4重組Agkisacutacin的發(fā)酵表達(dá)

(1)一級種：從凍存的工作菌種庫接種到4ml加入Zeocin的MGY培養(yǎng)基(MGY+Z)，30℃，250rpm培養(yǎng)36-48h至OD₆₀₀＝2-6，此為發(fā)酵一級種；

(2)二級種：接1ml從1級種到200ml pH5.0BMGY中,30℃，250rpm培養(yǎng)12-18h，至OD₆₀₀＝2-6，此為發(fā)酵二級種；

(3)發(fā)酵準(zhǔn)備：發(fā)酵罐組裝及相關(guān)試劑準(zhǔn)備、滅菌等工作；

(4)Batch階段：將二級種接入含4L pH5.0的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基的14L發(fā)酵罐中，使用含有4％甘油的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基(pH 5.0)在batch階段擴(kuò)增菌體，培養(yǎng)溫度30℃。等到DO急劇上升時，batch階段結(jié)束。

(5)轉(zhuǎn)化期：當(dāng)DO開始急速上升時意味著原有培養(yǎng)基中甘油耗盡，需要持續(xù)補(bǔ)充含有12ml/L PTM1的50％甘油溶液，流速為12ml/h/L，這個過程維持4h至濕重在190g/L附近；

(6)甲醇誘導(dǎo)階段：當(dāng)濕重達(dá)到190g/L附近時，停止甘油流加，溶解氧會迅速上升，隨后開始按恒定甲醇流速限制性流加含有12ml/L PTM1的甲醇溶液。溫度控制在30℃；攪拌速度1000rpm左右，總共發(fā)酵80小時左右，濕重達(dá)500g/L左右。

2.5重組Agkisacutacin的純化

(1)固液分離：發(fā)酵結(jié)束之后，使用NaOH緩緩地將發(fā)酵液pH調(diào)節(jié)到8.0，10000g,20min離心，收集上清液；

(2)樣品的澄清：使用Flex Stand system0.22μm過濾澄清。

(3)蛋白捕獲：離子交換柱捕獲發(fā)酵液中的重組Agkisacutacin。使用Flexstand超濾/過濾系統(tǒng)將發(fā)酵液透析除鹽，除鹽后的樣品流過CM FF柱，使用30％的buffer B洗脫樣品。

(4)精細(xì)純化：將30％Elution中的部分樣品，通過Q HP進(jìn)一步純化，梯度洗脫，連續(xù)收集各峰樣品，通過SDS-PAGE檢測重組Agkisacutacin純度。

(5)保存：用PBS凍存蛋白備用。

2.6重組Agkisacutacin的活性檢測

(1)天然提取的Agkisacutacin可以結(jié)合GP1b位點(diǎn)，我們進(jìn)行了重組Agkisacutacin與重組GPⅠb結(jié)合能力的檢測實(shí)驗(yàn)。

(2)天然提取的Agkisacutacin可以抗血小板凝集，我們進(jìn)行了重組Agkisacutacin抑制血小板凝集的實(shí)驗(yàn)。

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1Agkisacutacin表達(dá)載體的構(gòu)建，如圖1、圖2所示。

Agkisacutacin A鏈全長132個氨基酸，我們將A鏈的編碼序列連接到畢赤酵母α-Factor信號肽3’末端，克隆到pPIC9K酵母表達(dá)載體中。這樣通過甲醇誘導(dǎo)AOXⅠ啟動子驅(qū)動其下游蛋白的表達(dá)。

Agkisacutacin B鏈全長127個氨基酸，我們將B鏈的編碼序列連接到畢赤酵母α-Factor信號肽3’末端，克隆到pUCZ酵母表達(dá)載體中。這樣通過甲醇誘導(dǎo)AOXⅠ啟動子驅(qū)動其下游蛋白的表達(dá)。

3.2Agkisacutacin表達(dá)菌株的篩選

經(jīng)過多次篩選之后，得到表達(dá)Agkisacutacin的克隆，Western Blot檢測結(jié)果如圖3所示。

對其中的1號克隆進(jìn)行復(fù)篩，得到7個表達(dá)克隆，使用Western Blotting檢測這些克隆中Agkisacutacin表達(dá)情況，均有效地表達(dá)出重組Agkisacutacin，見圖4。

3.3重組Agkisacutacin中試規(guī)模的發(fā)酵表達(dá)

恒定甲醇流速限制性流加甲醇進(jìn)行表達(dá)菌分批補(bǔ)料培養(yǎng)(fed-batch cultivation)。首先使用含有4％甘油的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基(pH 5.0)在batch階段擴(kuò)增菌體，培養(yǎng)溫度30℃。等到DO急劇上升時，batch階段結(jié)束，菌體濕重達(dá)到134.7g/L。隨后進(jìn)入轉(zhuǎn)換期即甘油流加期，經(jīng)過約4個小時的生長菌體濕重進(jìn)一步增加，達(dá)到193.6g/L。此時停止流加甘油，菌體呼吸活力下降，DO迅速上升；隨后開始進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)，菌體呼吸活力恢復(fù)，DO開始逐漸下降。在甲醇誘導(dǎo)階段，因?yàn)榫w對甲醇有一個適應(yīng)階段(2-4小時)，因此需要在這段時間內(nèi)逐步提高甲醇濃度，避免甲醇過量積累對菌體產(chǎn)生毒性。整個發(fā)酵過程非常穩(wěn)定，各個參數(shù)都穩(wěn)定在設(shè)定范圍之內(nèi)。發(fā)酵結(jié)束之后，OD₆₀₀超過300，菌體濕重達(dá)到511.5g/L。檢測結(jié)果表明整個發(fā)酵過程中，菌體的死亡率一直維持較低的水平，甲醇濃度也穩(wěn)定在極低水平，維持菌體的限制性生長，見圖5、圖6。盡管菌體濕重在誘導(dǎo)過程中一直在增加，但是蛋白的表達(dá)量在培養(yǎng)80小時(或誘導(dǎo)60小時)就基本達(dá)到平衡，不再累計(jì)。因此在此時結(jié)束發(fā)酵比較適合。

3.4Agkisacutacin純化與鑒定

發(fā)酵結(jié)束之后，調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH至8.0，經(jīng)過高速離心和Flexstand0.22um過濾澄清，用BCA測定發(fā)酵液中總蛋白含量為1.6g/L，并通過SDS-PAGE估算rAgkisacutacin的濃度超過100mg/L。由于本工程中心目前尚無rAgkisacutacin檢測的ELISA試劑盒，因此暫時無法準(zhǔn)確定量。

由于rAgkisacutacin沒有攜帶任何tag，且我們工程中心沒有rAgkisacutacin抗體親和層析柱，因此我們嘗試使用離子交換柱捕獲發(fā)酵液中的rAgkisacutacin。使用Flexstand超濾/過濾系統(tǒng)將發(fā)酵液透析除鹽，除鹽后的樣品流過CM FF柱，使用10％和30％的buffer B洗脫樣品(前期已使用1ml小型離子交換柱初步摸索過純化條件)，從檢測結(jié)果可知，rAgkisacutacin主要在30％的Elution中(通過還原條件下+DTT的SDS-PAGE中15kDa位置是否有兩條緊密相連的條帶，來確定該樣品中是否含有rAgkisacutacin，通過非還原條件下SDS-PAGE看蛋白純度)。10％的Elution也含有少量rAgkisacutacin，且A鏈含量比B鏈高，因此10％的Elution中應(yīng)該有少量AA同源二聚體(圖7A)。將30％Elution中的部分樣品，通過Q HP進(jìn)一步純化，梯度洗脫出現(xiàn)5個峰，其中兩個峰連續(xù)收集了2-3管樣品(P1和P2)，通過觀察還原條件下SDS-PAGE中15kDa位置的兩條帶發(fā)現(xiàn)，rAgkisacutacin主要在P2峰中，特別是P2-2樣品，雜質(zhì)最少；P3峰中A鏈含量比B鏈高，因此會有AA同源二聚體污染；P1、P4、P5不含A、B鏈(圖7B)。

由于P2-2樣品主要含有兩條帶，且位置相差較大，因此我們采用分子篩進(jìn)行純化。與預(yù)期一致，這兩條帶可以很好的分離開來，經(jīng)檢測確認(rèn)分子篩中P2為我們所需的目的蛋白rAgkisacutacin，非還原條件一下為一條均勻的帶，還原條件下為兩條含量基本一致的帶(圖8，P1’和P2’分別表示P1和P2的峰尖)。目前尚未對上述分子篩中P2和P2’進(jìn)行純度鑒定，目測應(yīng)該可以達(dá)到90％的純度。經(jīng)初步估算，從1L發(fā)酵液中，大約可以獲得純化樣品10mg。

3.5Agkisacutacin活性測定

對純化產(chǎn)物進(jìn)行了GPⅠb結(jié)合活性檢測和抗血小板凝集活性檢測兩個方面的實(shí)驗(yàn)。GPⅠb結(jié)合活性檢測結(jié)果表明，重組Agkisacutacin可以與重組GPⅠb很好的結(jié)合，估算相對親和力常數(shù)為10^-7M(如圖9)?？寡“迥钚杂烧卓乒具M(jìn)行檢測，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)?shù)鞍琢窟_(dá)到2ug時，在檢測系統(tǒng)中可以100％抑制血小板聚集；當(dāng)?shù)鞍琢繛?ug時無抑制活性。上述實(shí)驗(yàn)均定性地表明，酵母來源的重組Agkisacutacin具有生物學(xué)活性和生理功能。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。