本發(fā)明涉及一種金黃色葡萄球菌腸毒素C2的核酸適配體C204及其篩選方法和應用。

背景技術(shù)：

金黃色葡萄球菌腸毒素是由金黃色葡萄球菌分泌的具有超抗原活性的外毒素。金黃色葡萄球菌腸毒素可不經(jīng)抗原提呈細胞加工，直接與MHCⅡ類分子非限制性的結(jié)合，形成的復合物與T淋巴細胞抗原受體的β鏈V區(qū)結(jié)合，大量激活T淋巴細胞，使其活化、增殖，并釋放大量的炎性細胞因子引起強烈的免疫應答，最終導致炎癥失控和多器官的損害，引起毒素休克等疾病。此外，由于金黃色葡萄球菌腸毒素較能抗消化，耐熱以及只需很小劑量就可引發(fā)T細胞應答，金黃色葡萄球菌腸毒素也被作為腫瘤治療的超抗原藥物。

金黃色葡萄球菌腸毒素有多個血清型，分別是A型、B型、C1型、C2型、C3型、D型、E型、G型、H型、I型、M型、N型、O型和毒性休克綜合癥1型毒素、毒性休克綜合癥2型毒素等，其中金黃色葡萄球菌腸毒素C2不僅與金黃色葡萄球菌相關(guān)感染有關(guān)，同時也是金黃色葡萄球菌腸毒素中應用最多的超抗原藥物。

檢測金黃色葡萄球菌腸毒素C2主要采用免疫學方法，包括沉淀反應、凝集反應、ELISA、固相RIA、生物傳感器等，這些方法使用抗體作為金黃色葡萄球菌腸毒素C2檢測的識別元件，而抗體的制備存在周期長，步驟繁瑣，成本高等不足之處。近年來，以檢測金黃色葡萄球菌腸毒素C2基因為目標的分子生物學方法發(fā)展較快，但PCR等分子生物學方法仍存在假陽性、假陰性等技術(shù)難題。因此，研制具有更高靈敏度、經(jīng)濟、簡便的金黃色葡萄球菌腸毒素C2檢測新技術(shù)，對于食品衛(wèi)生監(jiān)督、臨床金黃色葡萄球菌感染的診療等都有重要意義。

治療金黃色葡萄球菌腸毒素C2引起的毒素休克，臨床常采用抗炎、補液等對癥支持療法。最新研究發(fā)現(xiàn)，抑制金黃色葡萄球菌腸毒素C2的超抗原活性，在初始階段阻斷炎癥級聯(lián)反應的發(fā)生，是治療金黃色葡萄球菌腸毒素C2相關(guān)疾病的有效策略?；诖瞬呗?，研制各種多肽藥物、抗體藥物、疫苗等，已成為的金黃色葡萄球菌腸毒素C2生物技術(shù)新藥研究的熱點。

金黃色葡萄球菌腸毒素C2超抗原藥物的獲得，常采用基因克隆的方法，將金黃色葡萄球菌腸毒素C2基因片段克隆至原核表達載體中，在大腸桿菌中表達并純化。但這種方法中純化步驟常采用離子交換方法或帶標簽的親和純化方法，前者吸附選擇特異性差，后者試劑成本較高。

適配體又被稱為“合成抗體”、“化學抗體”，其化學本質(zhì)是一條單鏈寡核酸分子(ssDNA或RNA)折疊成特定三維結(jié)構(gòu)與靶物質(zhì)高親和力和高特異性結(jié)合。適配體的獲得通過指數(shù)富集配體的系統(tǒng)進化技術(shù)(Systematic evolution of ligands by exponentialenrichment,SELEX)的體外篩選過程。核酸適配體具有高親和力、高特異性、可體外合成、可通過修飾改變其功能及藥代動力學特性、無免疫原性、經(jīng)濟等特點?；谏鲜鰞?yōu)勢開發(fā)的核酸適配體藥物可特異性阻斷靶標功能；將核酸適配體作為識別元件，還可開發(fā)簡便、精準的檢測新技術(shù)以及高效、經(jīng)濟的親和純化系統(tǒng)。因此，篩選出高特異性、高親和力結(jié)合金黃色葡萄球菌腸毒素C2的核酸適配體具有重要的科研、臨床和市場價值。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種具有高特異性和高親和力的金黃色葡萄球菌腸毒素C2的核酸適配體C204及其篩選方法和應用。

本發(fā)明的目的通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)：一種金黃色葡萄球菌腸毒素C2的核酸適配體C204，它的序列如下：

AGGGCCGAGCTCACTTGTCTTAGTCCGACATGGTGCCTCC 40

CTGCCCCAGAGCTCCGCCGGCACAATTGTGC 71

所述的金黃色葡萄球菌腸毒素C2的核酸適配體C204的篩選方法，基于核酸適配體的體外SELEX篩選技術(shù)，利用羧基磁珠作為固相介質(zhì)，以金黃色葡萄球菌腸毒素C2為靶標，通過金黃色葡萄球菌腸毒素C2磁珠從ssDNA文庫中篩選得到與金黃色葡萄球菌腸毒素C2特異性結(jié)合的核酸適配體。

所述的金黃色葡萄球菌腸毒素C2的核酸適配體C204的應用，在分離、純化金黃色葡萄球菌腸毒素C2中的應用。

所述的金黃色葡萄球菌腸毒素C2的核酸適配體C204的應用，在分析檢測金黃色葡萄球菌腸毒素C2中的非疾病診斷和治療方法應用。

所述的金黃色葡萄球菌腸毒素C2的核酸適配體C204的應用，在金黃色葡萄球菌腸毒素C2為效應分子的靶向治療中的應用。

所述的金黃色葡萄球菌腸毒素C2的核酸適配體C204的應用，在治療金黃色葡萄球菌感染中以及在治療金黃色葡萄球菌腸毒素C2引起相關(guān)綜合癥中的應用。

較之現(xiàn)有技術(shù)而言，本發(fā)明的優(yōu)點在于：

1.該核酸適配體C204無毒性，分子量小，滲透性好，易于合成與標記。

2.該核酸適配體C204的合成成本較抗體制備的成本低，且周期短，重現(xiàn)性好。

3.該核酸適配體C204能高親和力、高特異性地與金黃色葡萄球菌腸毒素C2結(jié)合，解離常數(shù)為5.7±0.26nM，且它對其他同源蛋白不具有識別功能。

4.該核酸適配體C204在金黃色葡萄球菌腸毒素C2的分離、純化，金黃色葡萄球菌腸毒素C2相關(guān)的食品安全檢測，金黃色葡萄球菌腸毒素C2相關(guān)疾病的診斷和治療，金黃色葡萄球菌感染的診斷和治療，金黃色葡萄球菌腸毒素C2介導的靶向治療等領域方面具有廣闊的應用前景和重要的科學、社會、經(jīng)濟價值。

附圖說明

圖1為核酸適配體C204二級結(jié)構(gòu)的生物學信息學模擬圖。

圖2為熒光結(jié)合率實驗分析核酸適配體C204的特異性圖。在圖2中，橫坐標為分析的蛋白，縱坐標為熒光結(jié)合率。

圖3為熒光結(jié)合率實驗分析核酸適配體C204結(jié)合金黃色葡萄球菌腸毒素C2的解離常數(shù)繪制曲線。解離常數(shù)(Kd)為5.7±0.26nM。在圖3中，橫坐標為DNA濃度(pM)，縱坐標為熒光結(jié)合率。

圖4為CCK-8法測定核酸適配體C204對金黃色葡萄球菌腸毒素C2誘導的PBMC增殖活性的作用。

具體實施方式

下面結(jié)合說明書附圖和實施例對本發(fā)明內(nèi)容進行詳細說明：

一種金黃色葡萄球菌腸毒素C2的核酸適配體C204，它的序列如下：

AGGGCCGAGCTCACTTGTCTTAGTCCGACATGGTGCCTCC 40

CTGCCCCAGAGCTCCGCCGGCACAATTGTGC 71

所述的金黃色葡萄球菌腸毒素C2的核酸適配體C204，在25℃，100mM Na⁺，1mM Mg²⁺的條件下，其空間結(jié)構(gòu)如下：

所述的金黃色葡萄球菌腸毒素C2的核酸適配體C204，對所述核酸適配體C204的5’端或3’端進行FITC、氨基、生物素、地高辛化學修飾。

所述的金黃色葡萄球菌腸毒素C2的核酸適配體C204，對所述核酸適配體C204做截短或延長或部分堿基替換的結(jié)構(gòu)改造所得到的產(chǎn)物進行FITC、氨基、生物素、地高辛化學修飾。

所述的金黃色葡萄球菌腸毒素C2的核酸適配體C204的篩選方法，基于核酸適配體的體外SELEX篩選技術(shù)，利用羧基磁珠作為固相介質(zhì)，以金黃色葡萄球菌腸毒素C2為靶標，通過金黃色葡萄球菌腸毒素C2磁珠從ssDNA文庫中篩選得到與金黃色葡萄球菌腸毒素C2特異性結(jié)合的核酸適配體。

所述的金黃色葡萄球菌腸毒素C2的核酸適配體C204的篩選方法，它包括以下步驟：

(1)篩選文庫的準備：準備以下序列所示的隨機ssDNA文庫：

5’-AGGGCCGAGCTCACTTGT-N₃₅-CCGCCGGCACAATTGTGC-3’；

(2)將金黃色葡萄球菌腸毒素C2與羧基磁珠偶聯(lián)制備金黃色葡萄球菌腸毒素C2磁珠；

(3)將ssDNA文庫進行熱激活處理；

(4)將經(jīng)步驟(3)后的ssDNA文庫與步驟(2)所得的金黃色葡萄球菌腸毒素C2磁珠進行孵育；

(5)磁性分離經(jīng)步驟(4)后的金黃色葡萄球菌腸毒素C2磁珠，洗去金黃色葡萄球菌腸毒素C2磁珠表面未結(jié)合、弱結(jié)合及非特異性結(jié)合的ssDNA；加熱金黃色葡萄球菌腸毒素C2磁珠，收集與金黃色葡萄球菌腸毒素C2磁珠特異性結(jié)合的ssDNA，即ssDNA富集文庫；

(6)PCR擴增：將步驟(5)所得的ssDNA富集文庫進行PCR擴增，其中PCR擴增所用的引物為：

引物P1：5’-FAM-AGGGCCGAGCTCACTTGT-3’

引物P2：5’-Biotin-GCACAATTGTGCCGGCGG-3’；

(7)PCR產(chǎn)物的純化：利用小片段純化試劑盒對PCR產(chǎn)物進行純化；將純化后的dsDNA與鏈霉親和素磁珠進行孵育，結(jié)合dsDNA的鏈霉親和素磁珠經(jīng)洗滌、dsDNA解鏈后，用磁力架分離，收集上清；上清經(jīng)乙醇沉淀后獲得用于下一輪篩選的次級ssDNA文庫；

(8)循環(huán)篩選：將步驟(7)所得的FAM標記的次級ssDNA文庫，作為下一輪篩選的次級文庫，并重復步驟(3)～(7)的篩選過程。

實施例一：核酸適配體C204的篩選

所述的金黃色葡萄球菌腸毒素C2的核酸適配體C204的篩選方法，它包括以下步驟：

(1)篩選文庫的準備：設計兩端固定區(qū)域為18個核苷酸、中間隨機區(qū)域為35個核苷酸的隨機ssDNA文庫(5’-AGGGCCGAGCTCACTTGT-N₃₅-CCGCCGGCACAATTGTGC-3’)，并委托生工生物工程股份有限公司合成。

(2)金黃色葡萄球菌腸毒素C2與羧基磁珠偶聯(lián)：所述金黃色葡萄球菌腸毒素C2蛋白購自美國Toxin Technology公司，所述羧基磁珠及其偶聯(lián)試劑購自美國Bangs Laboratories公司，操作參照制造商提供的說明書；通過BCA法蛋白濃度測定耦聯(lián)前后金黃色葡萄球菌腸毒素C2溶液中蛋白濃度的變化，經(jīng)計算磁珠的耦聯(lián)效率為85％；將金黃色葡萄球菌腸毒素C2磁珠分散于PBS緩沖液中，4℃保存。

(3)取2nmol隨機ssDNA文庫溶于500μL選擇緩沖液(50mM Tris-HCl，100mM NaCl，1mM MgCl₂，5mM KCl，pH7.4)，然后經(jīng)熱激活處理。其中，熱激活處理的方法為：95℃變性5min后，立即置于冰水浴中冰浴10min，隨后置于室溫10min。

(4)將經(jīng)步驟(3)后的ssDNA文庫與步驟(2)所得的金黃色葡萄球菌腸毒素C2磁珠(金黃色葡萄球菌腸毒素C2載量為100ng)以及酵母tRNA(摩爾量為ssDNA文庫的5倍)混合并于室溫孵育1h。

(5)磁性分離經(jīng)步驟(4)后的金黃色葡萄球菌腸毒素C2磁珠，用含0.2％BSA的選擇緩沖液洗去金黃色葡萄球菌腸毒素C2磁珠表面未結(jié)合、弱結(jié)合及非特異性結(jié)合的ssDNA；然后將金黃色葡萄球菌腸毒素C2磁珠用200μL ddH₂O重懸，100℃熱水浴5min后，置于磁力架1-2min，收集上清，獲得與金黃色葡萄球菌腸毒素C2磁珠特異性結(jié)合的ssDNA，即ssDNA富集文庫。

(6)PCR擴增：將步驟(5)所得的ssDNA富集文庫加入到1mL PCRmix中；漩渦振蕩混勻后，按每管50μL分裝進行PCR擴增，擴增條件為：94℃預變性5min后；94℃變性30S，58℃退火30S，72℃延伸30S，15-25個循環(huán)。

其中1mL PCRmix中含有：10×PCR緩沖液100μL；pfu酶3μL；dNTP 20μL；引物P1：5’-FAM-AGGGCCGAGCTCACTTGT-3’和引物P2：5’-Biotin-GCACAATTGTGCCGGCGG-3’各3μL；所述引物P1和引物P2均委托生工生物工程股份有限公司合成。

(7)PCR產(chǎn)物的純化：兩端分別標有生物素和熒光基團FAM的PCR產(chǎn)物，使用小片段純化試劑盒純化(所述的小片段純化試劑盒購自生工生物工程股份有限公司)，將純化后的dsDNA與鏈霉親和素磁珠(購自Invitrogen-Dynal公司)在37℃孵育20min，用洗滌緩沖液(5mM Tris-HCl，pH7.5，1M NaCl，500μMEDTA)洗滌結(jié)合dsDNA的鏈霉親和素磁珠三次后，用50μL NaOH溶液(0.1M)在37℃孵育30min使dsDNA解鏈；用磁力架分離，收集上清，上清經(jīng)乙醇沉淀獲得FAM標記的次級ssDNA文庫，并溶解于選擇緩沖液中，作為下一輪篩選的次級文庫。

(8)篩選過程共進行9輪。從第二輪開始，次級文庫的用量均為50pmol。

實施例二：核酸適配體C204序列的分析：

(1)經(jīng)過9輪篩選后，收集富集的ssDNA文庫，并委托上海派森諾生物科技股份有限公司利用高通量測序技術(shù)對文庫序列進行分析，分析過程為：PCR擴增富集文庫，并加上測序接頭和Index部分；通過凝膠電泳選擇純化文庫；利用Agilent 2100Bioanalyzer通過Agilent High Sensitivity DNA Kit對文庫質(zhì)控；利用Quant-iT PicogGreen dsDNA Assay Kit對文庫進行定量；利用IlluminateNextSeq 500平臺，以單鏈文庫為模板進行橋式PCR擴增、測序引物退火、邊合成邊測序；并對測序結(jié)果進行比對和富集分析。

(2)利用UNAFold網(wǎng)絡平臺分析在25℃，100mM Na⁺，1mM Mg²⁺的條件下，核酸適配體C204序列的二級結(jié)構(gòu)。分析出核酸適配體C204序列的二級結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示。

實施例三：核酸適配體C204的特異性分析：

(1)體外化學合成FAM標記的核酸適配體C204，并將其溶于選擇緩沖液。

(2)參照實施例一中步驟(2)，將BSA、金黃色葡萄球菌腸毒素A、金黃色葡萄球菌腸毒素B以及金黃色葡萄球菌腸毒素C1分別與羧基磁珠耦聯(lián)制備BSA磁珠、金黃色葡萄球菌腸毒素A磁珠、金黃色葡萄球菌腸毒素B磁珠、金黃色葡萄球菌腸毒素C1磁珠以及金黃色葡萄球菌腸毒素C2磁珠。其中，所述BSA購自Sigma公司，所述金黃色葡萄球菌腸毒素A、金黃色葡萄球菌腸毒素B以及金黃色葡萄球菌腸毒素C1均購自美國Toxin Technology公司。

(3)取200μL步驟(1)所得的核酸適配體C204溶液分別與步驟(2)制得的BSA磁珠、金黃色葡萄球菌腸毒素A磁珠、金黃色葡萄球菌腸毒素B磁珠、金黃色葡萄球菌腸毒素C1磁珠以及金黃色葡萄球菌腸毒素C2磁珠混合，在暗盒中室溫孵育1h，設空白磁珠為對照。

(4)用0.1％PBST洗滌經(jīng)步驟(3)的上述磁珠3遍，與上述磁珠結(jié)合的核酸適配體，用200μL選擇緩沖液100℃煮沸5min洗脫。

(5)利用熒光定量儀分別測定初始溶液和洗脫液的熒光強度，計算熒光結(jié)合率＝(初始熒光強度-洗脫熒光強度)/初始熒光強度×100％，用計算值初步代表核酸適配體C204與靶分子的結(jié)合率。

如圖2所示，核酸適配體C204與金黃色葡萄球菌腸毒素C2的結(jié)合率均顯著高于其與BSA、金黃色葡萄球菌腸毒素A、金黃色葡萄球菌腸毒素B、金黃色葡萄球菌腸毒素C1的結(jié)合率，表明核酸適配體C204與金黃色葡萄球菌腸毒素C2的結(jié)合具有較好的特異性。

實施例四：核酸適配體C204的親和力分析

(1)取不同濃度的FAM標記核酸適配體C204溶液分別與金黃色葡萄球菌腸毒素C2磁珠混合，在暗盒中室溫孵育1h。

(2)參照實施例三中的步驟(4)和步驟(5)，實驗獲得并計算不同濃度核酸適配體C204溶液與金黃色葡萄球菌腸毒素C2磁珠的熒光結(jié)合率。

(3)利用熒光結(jié)合率的計算值，繪制核酸適配體C204結(jié)合金黃色葡萄球菌腸毒素C2的飽和結(jié)合曲線，通過非線性回歸分析計算核酸適配體C204結(jié)合金黃色葡萄球菌腸毒素C2的解離常數(shù)。

如圖3所示，我們獲得了核酸適配體C204的飽和結(jié)合曲線，經(jīng)計算核酸適配體C204的解離常數(shù)為5.7±0.26nM，表明核酸適配體C204與金黃色葡萄球菌腸毒素C2結(jié)合的結(jié)合能力強，解離常數(shù)在納摩爾級別。

實施例五：核酸適配體C204抑制金黃色葡萄球菌腸毒素C2的超抗原活性

(1)無菌抽取健康成年志愿者外周血，肝素抗凝后用等量RPMI1640培養(yǎng)液稀釋，置于淋巴細胞分離液上，采用常規(guī)密度梯度離心法(2000rmp，20min)分離獲取人外周血單個核細胞(PBMCs)。

(2)用含5％新生牛血清(NBS)和5％人自體血清的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為1～2×10⁶/mL，鋪96孔板，每孔100μL。

(3)各組加入核酸適配體C204的濃度分別依次為0μM、10μM，每孔加入終濃度為250ng/mL的金黃色葡萄球菌腸毒素C2，設置即不加金黃色葡萄球菌腸毒素C2，也不加核酸適配體C204的空白對照組。

(4)將細胞置于37℃、5％CO₂的CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)24h后，每孔加入10μL的CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)4h。

(5)分光光度計檢測每孔在450nm的吸光度(OD)。

如圖4所示，橫坐標為核酸適配體C204的濃度，縱坐標為450nm處的OD值。當核酸適配體C204為10μM時，金黃色葡萄球菌腸毒素C2刺激PBMCs的增殖水平明顯降低(P＜0.05)，上述結(jié)果表明核酸適配體C204在體外實驗中對金黃色葡萄球菌腸毒素C2的超抗原活性具有明顯地抑制作用，是一種潛在的金黃色葡萄球菌腸毒素C2抑制劑。

SEQUENCE LISTING

<110> 中國人民解放軍南京軍區(qū)福州總醫(yī)院

<120> 金黃色葡萄球菌腸毒素C2的核酸適配體C204及其篩選方法和應用

<160> 3

<210> 1

<211> 71

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agggccgagc tcacttgtct tagtccgaca tggtgcctcc 40

ctgccccaga gctccgccgg cacaattgtg c 71

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agggccgagc tcacttgt 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcacaattgt gccggcgg 18