技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高免疫蛋黃抗體，具體地說(shuō)，涉及一種鴨病毒性肝炎的蛋黃抗體。
背景技術(shù)：
：鴨病毒性肝炎(DuckVirusHepatitis，DVH)是由小RNA病毒科腸病毒屬的鴨肝炎病毒(DuckHepatitisVirus，DHV)引起雛鴨的一種急性、高度致死性、烈性傳染病。本病常年發(fā)生，自然狀態(tài)下只感染3周齡內(nèi)的雛鴨，常造成重大的經(jīng)濟(jì)損失，威脅著養(yǎng)鴨業(yè)的健康發(fā)展。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將鴨病毒性肝炎劃歸為B類(lèi)動(dòng)物疾病。鴨肝炎病毒有歷史上分為血清型Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型，三者間沒(méi)有抗原相關(guān)性。其中I型鴨病毒性肝炎呈世界性分布。II型鴨病毒性肝炎是1965年發(fā)現(xiàn)于英國(guó)，且自20世紀(jì)80年代中期暴發(fā)后，該地區(qū)也再未見(jiàn)該病的發(fā)生。III型1969年發(fā)現(xiàn)于美國(guó)紐約長(zhǎng)島地區(qū)。II型、III型目前已被重新分類(lèi)為鴨星狀病毒屬成員，分別稱為鴨星狀病毒1型(duckastrovirus1，DAstV-1)、鴨星狀病毒2型(DAstV-2)。2009年，國(guó)際病毒分類(lèi)委員會(huì)(TheInternationalCommitteeonTaxonomyofViruses，ICTV)在小RNA病毒科中新成立禽肝病毒屬(Avihepatovirus)，傳統(tǒng)的血清I型鴨肝炎病毒屬于其中的鴨甲型肝炎病毒(DHAV)，被稱為DHAV-1，DHAV還包括另外兩個(gè)血清型即DHAV-2、DHAV-3，DHAV-2和DHAV-3分別與DHAV-1無(wú)血清交叉中和作用。WangL等(2008)則按基因分型稱之為A型(DHAV-A)、B型(DHAV-B)、C型(DHAV-C)。研究表明，根據(jù)衣殼蛋白編碼序列所區(qū)分的基因型與采用中和試驗(yàn)所區(qū)分的血清型存在對(duì)應(yīng)關(guān)系。國(guó)內(nèi)外學(xué)者就DHV血清型的流行狀況開(kāi)展了研究。2007年，Tseng從1989-1990年臺(tái)灣地區(qū)暴發(fā)鴨病毒性肝炎的病鴨體內(nèi)分離病原，通過(guò)中和試驗(yàn)證明是一株新型鴨肝炎病毒，N-DHV(可稱作DHAV-2)，目前僅發(fā)現(xiàn)于臺(tái)灣地區(qū)。2007年，韓國(guó)Kim等從2003年和2004年暴發(fā)鴨病毒性肝炎的病鴨體內(nèi)分離到一株病毒，與DHV-Ⅰ的血清型不同，稱為DHV-AP(又稱作DHAV-3)。以往在我國(guó)流行的主要是I型鴨肝炎病毒，采用傳統(tǒng)的弱毒疫苗和高免蛋黃抗體進(jìn)行I型DHV的預(yù)防和治療。但近幾年來(lái)，不斷有使用I型鴨肝炎弱毒疫苗或高免蛋黃抗體進(jìn)行預(yù)防或治療無(wú)效的鴨群爆發(fā)疑似鴨肝炎，懷疑為新型鴨肝炎。而近年來(lái)，韓國(guó)新型(DHAV-3)在我國(guó)的地區(qū)分布已較為廣泛。蘇敬良等(新型DHV的分離及初步鑒定，中國(guó)獸醫(yī)科技，2002，32(1)：15～16)經(jīng)過(guò)病原分離鑒定和鴨胚血清中和試驗(yàn)，分離到與DHV-I、DHV-III無(wú)血清學(xué)交叉免疫反應(yīng)的小RNA病毒，稱為新型鴨肝炎病毒；黃安國(guó)等(新型鴨肝炎病毒的分離與初步鑒定，廣西畜牧獸醫(yī)，2003，19(5)：198～199)也從以I型鴨病毒性肝炎高免蛋黃抗體或I型鴨肝炎弱毒疫苗不能治愈或預(yù)防的類(lèi)似I型鴨病毒性肝炎的發(fā)病鴨群中分離到新型鴨肝炎病毒。隨后劉建等(新型DHV流行病學(xué)調(diào)查及免疫防治試驗(yàn)，中國(guó)獸醫(yī)雜志，2006，42(2)：3～6)從北京、河北、山東和廣西等地送檢并具有明顯的肝臟出血病變特征的雛鴨肝臟中分離到9株病毒株，通過(guò)對(duì)其進(jìn)行血清學(xué)鑒定，發(fā)現(xiàn)其中7株為新型鴨肝炎病毒，2株為I型鴨肝炎病毒。這些研究結(jié)果就可以揭示近年來(lái)不少地區(qū)雛鴨在發(fā)生鴨病毒性肝炎后注射高免血清或高免蛋黃抗體治療無(wú)效的原因。研究結(jié)果已顯示我國(guó)多個(gè)地區(qū)同時(shí)流行DHAV-1和DHAV-3，且兩者間缺乏交叉保護(hù)，對(duì)DHAV-3所引起的DVH還缺乏有效的控制措施。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了滿足生產(chǎn)上對(duì)DVH有效防治技術(shù)的迫切需求，及時(shí)控制國(guó)內(nèi)DVH的發(fā)生，本發(fā)明利用傳統(tǒng)的I型(DHAV-1)鴨肝炎病毒與新型(DHAV-3)鴨肝炎病毒制備了二價(jià)蛋黃抗體。為此，本發(fā)明提供了一種鴨病毒性肝炎病毒株，所述病毒株VP1基因編碼氨基酸的序列包含如圖六所示的具有49-T、196-N、207-E三個(gè)氨基酸取代位點(diǎn)和197-Q、198-S、199-D三個(gè)共有位點(diǎn)。優(yōu)選地，所述鴨病毒性肝炎病毒株為鴨病毒性肝炎病毒SD1株，所述SD1株保藏地址為中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCCNO.V201225，保藏地址為中國(guó)武漢·武漢大學(xué)。本發(fā)明提供了一種DNA序列，它實(shí)質(zhì)上含有seqNo.1的核苷酸序列，本發(fā)明中的術(shù)語(yǔ)“實(shí)質(zhì)上含有”是指本發(fā)明的核苷酸序列在保持其功能的范圍內(nèi)，序列號(hào)1堿基序列可以發(fā)生置換、插入或缺失等變異。本發(fā)明提供了一種VP1抗原蛋白，所述的VP1抗原蛋白包含如圖六所示的具有49-T、196-N、207-E三個(gè)氨基酸取代位點(diǎn)和197-Q、198-S、199-D三個(gè)共有位點(diǎn)的鴨病毒性肝炎病毒VP1共有序列。本發(fā)明的主要目的在于提供一種鴨病毒性肝炎二價(jià)蛋黃抗體，所述二價(jià)蛋黃抗體包含鴨病毒性肝炎DHAV-1型和鴨病毒性肝炎DHAV-3型蛋黃抗體。所述抗體效價(jià)高且成本較低，能夠有效控制目前國(guó)內(nèi)流行的不同血清型的鴨病毒性肝炎。本發(fā)明另一目的在于提供一種鴨病毒性肝炎二價(jià)蛋黃抗體的制備方法，所述方法安全、易于使用，所述制備方法包括：(1)采用鴨病毒性肝炎DHAV-1型毒株和DHAV-3型毒株分別接種9日齡SPF雞胚和10日齡易感鴨胚，然后收獲尿囊液，將所述收獲的病毒液按比例混合，甲醛滅活并制備疫苗；(2)使用所述制備的疫苗免疫產(chǎn)蛋雞，免疫后抽樣測(cè)定雞高免蛋黃中抗DHAV-1型、DHAV-3型抗原抗體中和效價(jià)≥1∶8192，之后收集所述雞的高免蛋；(3)將所述高免蛋蛋殼消毒，收集蛋黃，所述蛋黃加入等體積蒸餾水，攪拌混勻，低溫巴氏滅活；酸化蒸餾水法提純、辛酸法提純；微濾，超濾。優(yōu)選地，所述鴨病毒性肝炎DHAV-1型毒株為DRL-62株、所述DHAV-3型毒株為SD1。優(yōu)選地，所述免疫程序?yàn)椋核霎a(chǎn)蛋雞120日齡時(shí)肌肉注射1ml/只，14日后等劑量肌肉注射，所述二免10日后再用等劑量肌肉注射進(jìn)行三免，所述三免后10日再用等劑量肌肉注射進(jìn)行第四次強(qiáng)化免疫。優(yōu)選地，所述低溫巴氏滅活條件為62.5℃加熱滅活30min；優(yōu)選地，所述酸化蒸餾水法提純步驟為：先在隔層反應(yīng)罐中加入相當(dāng)于所述蛋黃6倍體積的滅菌蒸餾水，所述蒸餾水pH值為4.2，并降溫至4℃，然后，將滅活的所述蛋黃液加入，攪拌，4℃靜置4h，離心分離上清液；所述辛酸法提純步驟為：按所述上清液總量的0.2％體積加入辛酸，攪拌，室溫放置4h，過(guò)濾至澄清，再按所述濾液總量的0.1％加入飽和甲醛溶液，攪拌，室溫放置24h。優(yōu)選地，所述微濾使用0.22μm微孔濾芯過(guò)濾除菌，所述超濾用截留分子量為1000KDa的超濾膜過(guò)濾除病毒。本發(fā)明再一目的在于提供了鴨病毒性肝炎二價(jià)蛋黃抗體在制備預(yù)防和治療鴨病毒性肝炎的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的還一目的在于提供了一種預(yù)防和治療鴨病毒性肝炎的疫苗組合物，所述疫苗組合物包括免疫量的由VP1基因編碼氨基酸基因序列包含如圖六所示的具有49-T、196-N、207-E三個(gè)氨基酸取代位點(diǎn)和197-Q、198-S、199-D三個(gè)共有位點(diǎn)的鴨病毒性肝炎毒株所制備抗原以及藥學(xué)上可接受的載體。優(yōu)選地，所述鴨病毒性肝炎病毒為SD1株。所述預(yù)防和治療鴨病毒性肝炎的疫苗組合物使用本領(lǐng)域常規(guī)方法制備。本發(fā)明還提供了所述的疫苗組合物在制備預(yù)防和治療鴨病毒性肝炎的藥物中的應(yīng)用。技術(shù)效果1.本發(fā)明采用了物理、化學(xué)等多重滅活技術(shù)，使用酸化水稀釋法結(jié)合辛酸法、高速離心、超濾等現(xiàn)代生物技術(shù)，將蛋黃中的免疫球蛋白進(jìn)行有效的分離純化，蛋黃抗體中不含任何有害物質(zhì)和外源性污染，安全性高，注射免疫鴨群時(shí)對(duì)胴體品質(zhì)無(wú)影響，可工業(yè)化生產(chǎn)。2.本發(fā)明所獲得的鴨病毒性肝炎毒株，具有良好的免疫原性，制備的滅活疫苗，抗體產(chǎn)生速度快，抗體效價(jià)高，安全性好，以此制備的蛋黃抗體能有效地防治DHAV-3型病毒的侵染，保存、運(yùn)輸(2～8℃)和使用方便，使用效果穩(wěn)定，有效地防控鴨病毒性肝炎的發(fā)生。3.發(fā)明人在研究所獲得的鴨病毒性肝炎毒株SD1株的VP1基因序列時(shí)，意外發(fā)現(xiàn)其中VP1基因編碼氨基酸基因序列包含的如圖六所示的具有49-T、196-N、207-E三個(gè)氨基酸取代位點(diǎn)和197-Q、198-S、199-D三個(gè)共有位點(diǎn)對(duì)其免疫原性具有重要作用。在后續(xù)實(shí)施例證明，其他鴨病毒性肝炎毒株VP1基因序列突變了相應(yīng)相同的位點(diǎn)，也具有同樣的作用。4.本發(fā)明提供的二價(jià)蛋黃抗體，成本低，效價(jià)高，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明可以對(duì)DHAV-1和DHAV-3引起的鴨病毒性肝炎做到有效的控制，可獲得顯著的社會(huì)效益。附圖說(shuō)明圖1為利用DHVI型標(biāo)準(zhǔn)株引物RT-PCR檢測(cè)DRL-62株和SD1株VP1結(jié)果；圖2為利用DHV韓國(guó)新型毒株引物RT-PCR檢測(cè)DRL-62株和SD1株VP1結(jié)果；圖3為SD1VP1基因與DHV參考毒株核苷酸序列同源性分析；圖4為SD1VP1基因與DHV參考毒株氨基酸序列同源性分析；圖5為SD1VP1基因與DHV參考毒株核苷酸序列進(jìn)化樹(shù)；圖6為SD1VP1基因與DHV參考毒株氨基酸序列比對(duì)分析；圖7為SD1VP1蛋白親水性、抗原指數(shù)、表面可及性分析。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。鴨病毒性肝炎二價(jià)蛋黃抗體的制備方法采用如下的步驟：鴨肝炎病毒DHAV-1、DHAV-3種毒的繁育、免疫用疫苗的制備、產(chǎn)蛋雞的免疫、蛋黃抗體的提取。本發(fā)明實(shí)施例中所選用的DHAV-1毒株為DRL-62株，DHAV-3毒株為SD1株，其具體方法為：1.毒種的來(lái)源鴨肝炎病毒DRL-62株(ATCC保藏，保藏號(hào)VR-1313)；SD1株由普萊柯生物工程股份有限公司分離，(CCTCC保藏，保藏號(hào)：CCTCCNO.V201225)。2.毒種繁殖將鴨肝炎病毒DRL-62株毒種用滅菌PBS溶液作1∶100稀釋?zhuān)?jīng)尿囊腔接種9～11日齡SPF雞胚，每胚0.1ml。置37℃繼續(xù)孵育，棄去48小時(shí)內(nèi)的死胚，收獲48～96小時(shí)死亡雞胚，置2～8℃冷卻12～24小時(shí)。將檢驗(yàn)無(wú)菌的胚液混合后，定量分裝，冷凍保存。注明收獲日期、毒種代次等。將鴨肝炎病毒SD1株毒種用滅菌PBS溶液作1∶100稀釋?zhuān)?jīng)尿囊腔接種10～12日齡易感鴨胚，每胚0.2ml。置37℃繼續(xù)孵育，棄去48小時(shí)內(nèi)的死胚，收獲48～96小時(shí)死亡鴨胚，置2～8℃冷卻12～24小時(shí)。將檢驗(yàn)無(wú)菌的鴨胚液混合后，定量分裝，冷凍保存。注明收獲日期、毒種代次等。3.免疫用滅活苗的制備：3.1病毒液的收獲將收獲的病毒液3500轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘，吸取上清液于滅菌容器，加入10％甲醛溶液，隨加隨搖，使其充分混合，甲醛溶液的終濃度為0.15％，密閉后置37℃溫箱中作用24小時(shí)(期間振搖3～4次)。3.2免疫用滅活苗的制備油相配制：取注射用白油94份，司本-806份混合后，加入硬脂酸鋁2份，邊加熱邊攪拌至透明后高壓滅菌備用，即為油相。水相配制：將DRL-62株抗原與SD1株抗原以1:1的比例混合均勻，按抗原的4％加入滅菌吐溫-80，充分振搖，使吐溫-80完全溶解，即為水相。乳化：取油相2份置油相罐內(nèi)，開(kāi)動(dòng)電機(jī)攪拌，徐徐加入1份水相，再以3400轉(zhuǎn)/分鐘乳化10分鐘即可。在乳化終止前加入1％硫柳汞，使其終濃度為0.01％。取樣3000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，應(yīng)不分層。分裝：定量分裝，加蓋密封。4.免疫4.1免疫程序蛋雞120日齡左右用滅活油苗肌肉注射1ml/只，14日后用滅活苗肌肉注射1ml/只，二免10日后再用滅活苗肌肉注射1ml/只進(jìn)行三免，三免后10日再用滅活苗肌肉注射1ml/只進(jìn)行第四次強(qiáng)化免疫。4.2采蛋從四免后每隔10日抽樣測(cè)定雞高免蛋黃中DRL-62抗體、SD1抗體中和效價(jià)≥1∶8192為合格，之后即可收集高免蛋，置4℃貯存?zhèn)溆谩?.蛋黃抗體的制備5.1蛋黃的收獲及滅活將蛋殼消毒，采取手工或機(jī)械打蛋。充分除去蛋清(白)、胚盤(pán)和系帶，收集蛋黃。充分?jǐn)嚢枋沟包S呈均勻膏狀，加入等體積經(jīng)121℃30min滅菌并冷卻的蒸餾水，攪拌混勻，62.5℃加熱滅活30min。5.2抗體的酸化蒸餾水法提純先在隔層反應(yīng)罐中加入相當(dāng)于原蛋黃6倍體積的pH值為4.2的滅菌蒸餾水，并降溫至4℃。然后，將滅活的蛋黃液加入，邊加邊攪拌，4℃靜置4h。管式低溫連續(xù)離心機(jī)14000rpm離心分離上清液并轉(zhuǎn)入另一反應(yīng)罐中。5.3抗體的辛酸法提純按總量的0.2％(體積比)加入辛酸，攪拌均勻，室溫放置4h。用濾布過(guò)濾后，再用K型多層板框過(guò)濾至澄清，再按總量的0.1％加入飽和甲醛溶液于上述濾液中，充分?jǐn)嚢杌靹颍覝胤胖?4h，期間振搖數(shù)次。5.4過(guò)濾除菌用0.22μm微孔濾芯過(guò)濾除菌。用截留分子量為1000KDa的超濾膜過(guò)濾除病毒。5.5抗體效價(jià)測(cè)定中和試驗(yàn)將DHVDRL-62株稀釋成每0.1ml含200ELD50，與等量2倍系列稀釋的待檢抗體混合，37℃作用1小時(shí)，期間搖晃數(shù)次。每個(gè)稀釋度接種5枚9日齡SPF雞胚，每胚0.2ml，另設(shè)病毒液與等量滅菌PBS混合的病毒對(duì)照組和PBS空白對(duì)照組各5枚，置37℃培養(yǎng)168小時(shí)，記錄48～168小時(shí)的雞胚死亡數(shù)，判定結(jié)果?？瞻讓?duì)照組應(yīng)全部健活，病毒對(duì)照組應(yīng)全部死亡。將DHVSD1株稀釋成每0.1ml含200ELD50，與等量2倍系列稀釋的待檢抗體混合，37℃作用1小時(shí)，期間搖晃數(shù)次。每個(gè)稀釋度接種5枚10日齡易感鴨胚，每胚0.2ml，另設(shè)病毒液與等量滅菌PBS混合的病毒對(duì)照組和PBS空白對(duì)照組各5枚，置37℃培養(yǎng)168小時(shí)，記錄48～168小時(shí)的鴨胚死亡數(shù)，判定結(jié)果。空白對(duì)照組應(yīng)全部健活，病毒對(duì)照組應(yīng)全部死亡。能使50％雞(鴨)胚不發(fā)生死亡的最高抗體稀釋倍數(shù)即為該抗體的中和效價(jià)。5.6提純的蛋黃抗體凍干向提純并經(jīng)檢驗(yàn)合格的蛋黃抗體液加入凍干保護(hù)劑分裝于西林瓶入凍干箱，凍干過(guò)程中溫度最低降至－40℃，在此溫度下保持4h，制品以1.0℃/h升溫18～20h，至基本干燥，再以4～6℃/h升溫至25℃干燥至完全凍干，壓塞出箱，貯存于2～8℃。實(shí)施例1DHVSD1分離株分子生物學(xué)鑒定1.鴨肝炎病毒SD1株病毒為新分離鑒定的病毒，其具有以下特征：1.1DHAV-3和DHAV-1引起的臨床癥狀極為相似，主要表現(xiàn)為：雛鴨發(fā)病突然，很快出現(xiàn)明顯的神經(jīng)癥狀，抽搐，并很快死亡，死后雛鴨呈角弓反張姿勢(shì)。病理變化表現(xiàn)為肝臟腫大，肝表面有大量的出血點(diǎn)及出血斑，并且隨著死亡時(shí)間的延長(zhǎng)，出血表現(xiàn)越為明顯。1.2根據(jù)GenBank已發(fā)表的DHV基因組序列設(shè)計(jì)多對(duì)特異的引物，按常規(guī)RT-PCR方法擴(kuò)增VP1基因，對(duì)分離株SD1的VP1基因進(jìn)行了序列測(cè)定分析。結(jié)果表明，SD1的VP1基因與中國(guó)及韓國(guó)DHAV-3的VP1序列相似性最高，與DHAV-1和臺(tái)灣DHAV-2的相似性均較低。核苷酸序列及進(jìn)化關(guān)系分析結(jié)果表明分離毒與中國(guó)及韓國(guó)DHAV-3之間的遺傳距離最近，而與DHAV-1和臺(tái)灣DHAV-2之間存在較大差異。1.3VP1氨基酸序列的比對(duì)分析及親水性、抗原指數(shù)和表面可及性分析顯示，DHVSD1分離株與其它國(guó)內(nèi)DHAV-3間氨基酸位點(diǎn)的變化均位于親水性區(qū)域和可及性區(qū)域，加之與DHAV-1的差異共同提示DHVSD1分離株VPl蛋白上可能存在完全不同的抗原表位，同時(shí)也將體現(xiàn)在免疫保護(hù)性上。1.4血清交叉中和試驗(yàn)表明DHVSD1分離株與DHAV-1間無(wú)交叉保護(hù)作用，二者分屬不同的血清型。SD1分離株與國(guó)內(nèi)分離DHAV-3毒株間有交叉保護(hù)作用，且相互間的中和保護(hù)作用SD1株優(yōu)于對(duì)比毒株。1.5理化特性鑒定結(jié)果顯示，該毒株可抵抗氯仿、乙醚、熱、胰酶、酸的處理。該病毒株免疫原性良好，四免后10日抽樣測(cè)定雞高免蛋黃中DRL-62抗體中和效價(jià)1:17620、SD1抗體中和效價(jià)1:13932；治療試驗(yàn)表明二價(jià)蛋黃抗體能有效控制目前國(guó)內(nèi)流行的不同血清型的鴨病毒性肝炎的發(fā)生，保護(hù)率達(dá)到80％～100％。本發(fā)明所述的鴨病毒性肝炎SD1株于2012年06月08日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。保藏單位簡(jiǎn)稱：CCTCC，保藏編號(hào)：CCTCCNO.V201225，分類(lèi)命名：鴨病毒性肝炎病毒，英文名稱為DuckhepatitisvirusSD1Strain，拉丁文名稱為T(mén)arpeiapulli，保藏單位地址：中國(guó)武漢·武漢大學(xué)。2.RT-PCR從病鴨肝臟中分離病毒提取RNA，根據(jù)GenBank公布的DHAV-1毒株DRL-62株、韓國(guó)DHAV-3毒株N-DHV株基因組全序列，使用下列引物對(duì)VP1序列進(jìn)行RT-PCR(參照大連寶生物工程有限公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)的方法)：①DHAV-1型上游引物：5’-GGTGATTCTAACCAGTTGG-3’，下游引物：5’-TTCAATTTCCAGATTGAGT-3’；②DHAV-3型上游引物：5’-CAGATGGCCGCCAATGATCAG-3’，下游引物：5’-GTCTCTGACATTTCGAAATTGGTATGA-3’。陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物送英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司進(jìn)行測(cè)序。3.基因序列分析使用DNAStar7.1分析軟件將分離毒株VP1基因核苷酸序列與I型DHV標(biāo)準(zhǔn)株DRL-62及GenBank中登陸的其它DHV毒株(見(jiàn)表1)核苷酸序列進(jìn)行同源性比較分析，并使用Megalign中的方法繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。表1參考毒株及其GenBank登錄號(hào)4.分子生物學(xué)鑒定結(jié)果4.1RT-PCR結(jié)果結(jié)果參見(jiàn)圖1、圖2，利用DHVVP1特異性引物對(duì)DRL-62株及分離株進(jìn)行RT-PCR，圖1中，M泳道為DL2000Marker，泳道1為DRL-62株利用DHAV-1型標(biāo)準(zhǔn)株引物RT-PCR結(jié)果，泳道2為SD1分離株利用DHAV-1型標(biāo)準(zhǔn)株引物RT-PCR結(jié)果，泳道3為陰性對(duì)照；圖2中，M泳道為DL2000Marker，泳道1為SD1分離株用DHAV-3型引物RT-PCR結(jié)果，泳道2為DRL-62株用DHAV-3型引物RT-PCR結(jié)果，泳道3為陰性對(duì)照。結(jié)果分析：利用DHAV-1型標(biāo)準(zhǔn)株引物，DRL-62株可擴(kuò)增出約700bp大小特異性條帶；利用DHAV-3型引物擴(kuò)增，可見(jiàn)分離株在約750bp處出現(xiàn)特異性條帶。4.2VP1序列分析結(jié)果4.2.1DHVSD1VP1基因的測(cè)序結(jié)果參見(jiàn)序列SEQ1：4.2.2DHVSD1株VP1基因核苷酸及其編碼的氨基酸序列同源性分析參見(jiàn)圖3、圖4，序列分析發(fā)現(xiàn)，DHVSD1分離株與DHVI型標(biāo)準(zhǔn)毒株DRL-62株、中國(guó)分離DHVI型MY株(DHAV-1)核苷酸相似性僅約為69％，氨基酸相似性分別為77.3％、76.5％；而與DHVFS株、C-YDF株等中國(guó)分離DHAV-3型毒株的核苷酸相似性分別在93.1％～97.9％之間，氨基酸相似性達(dá)到97.5～99.2％；與韓國(guó)新型DHV(DHAV-3)之間的核苷酸序列相似性為93.1％，氨基酸相似性則分別為92.5％、92.9％；與臺(tái)灣新型DHV(DHAV-2)之間的核苷酸序列相似性則僅為72.7％，氨基酸相似性分別為80.5％、80.1％。參見(jiàn)圖5，進(jìn)化關(guān)系分析結(jié)果進(jìn)一步表明，DHVSD1分離株與DHAV-3中國(guó)、韓國(guó)毒株在一個(gè)分支中，遺傳距離最近，而與DHAV-1及DHAV-2毒株間存在較大差異。同時(shí)顯示DHVSD1分離株和國(guó)內(nèi)DHAV-3與韓國(guó)DHAV-3分別在兩個(gè)小分支上，本研究的DHVSD1分離株與其它GenBank登陸的國(guó)內(nèi)DHAV-3又分別在兩個(gè)分支當(dāng)中。4.2.3VP1氨基酸序列的比對(duì)分析及親水性、抗原指數(shù)和表面可及性分析VP1是小RNA病毒主要的抗原性基因，蛋白大部分暴露在病毒的表面，是主要結(jié)構(gòu)蛋白，含有可誘導(dǎo)T、B淋巴細(xì)胞反應(yīng)的多個(gè)抗原表位，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性的中和抗體。由于VP1位于表面，選擇壓力大，變異率高，某些氨基酸的也將導(dǎo)致抗原位點(diǎn)的改變，從而對(duì)毒株抗原性的變化產(chǎn)生影響。在小RNA病毒科中，結(jié)構(gòu)蛋白VP1有保守的氨基酸序列RGD，它履行著吸附細(xì)胞與細(xì)胞受體結(jié)合的重要功能，還能誘導(dǎo)病毒產(chǎn)生中和抗體。從推導(dǎo)的氨基酸序列中可以看出DHAV-1型毒株的VP1序列中不具有RGD序列，而是SGD，對(duì)應(yīng)的DHAV-3則均是QSD。這一變化表明新型DHV與細(xì)胞受體的結(jié)合可能同F(xiàn)MDV等不同。參見(jiàn)圖6，DHVSD1分離株與DHAV-1比較顯示，分離株在143、144位有2個(gè)氨基酸GG插入，變異區(qū)域主要在140～146、180～200、212～219位。DHVSD1分離株與韓國(guó)新型DHV(NC-009750)比較顯示，共有18位氨基酸發(fā)生變異，高變區(qū)主要在178～196位。與臺(tái)灣DHAV-2比較顯示，在51、52位分離株缺失2個(gè)氨基酸DG，在143～145位有GGG3個(gè)氨基酸插入，185位有1個(gè)氨基酸插入L。DHVSD1分離株與中國(guó)其它DHAV-3毒株(10株)比較顯示，主要存在為點(diǎn)突變，其中SD1株第49位氨基酸為T(mén)，其它各株均為G或S。196位氨基酸為N，對(duì)比毒株中7株為D。207位氨基酸為E，對(duì)比毒株中有4株為K。參見(jiàn)圖7，用Protean程序?qū)P1基因進(jìn)行分析。分別以Kyte-Doolittle方法進(jìn)行親水性區(qū)域分析，以Emini方案進(jìn)行氨基酸位于分子表面可能性分析，以Jameson-Wolf法進(jìn)行抗原指數(shù)分析。結(jié)果顯示，VP1蛋白親水性高的區(qū)域分布廣泛，與抗原指數(shù)高的區(qū)域相似，其中131～141、195～205、210～224三個(gè)區(qū)段抗原指數(shù)、親水性峰值、表面可及性值高，且與主要柔性區(qū)域分布一致，推測(cè)該段區(qū)域可能是VP1的主要抗原性肽段。DHVSD1分離株與其它國(guó)內(nèi)DHAV-3間氨基酸位點(diǎn)的變化均位于親水性區(qū)域和可及性區(qū)域，加之與DHAV-1的差異共同提示DHVSD1分離株VPl蛋白上可能存在完全不同的抗原表位，同時(shí)也將體現(xiàn)在免疫保護(hù)性上。本研究發(fā)現(xiàn)，具有49-T、196-N、207-E三個(gè)氨基酸取代位點(diǎn)和197-Q、198-S、199-D三個(gè)共有位點(diǎn)的毒株對(duì)鴨病毒性肝炎具有良好的免疫原性。實(shí)施例2血清交叉中和試驗(yàn)固定病毒稀釋血清，將DHVDRL-62株、SD1分離株陽(yáng)性血清分別用生理鹽水做2倍系列稀釋。將含200ELD50/0.2ml的DRL-62株、SD1分離株病毒液各取1.0ml分別與各毒株不同稀釋度的陽(yáng)性血清等量混合，37℃作用1h。同時(shí)，設(shè)病毒和生理鹽水對(duì)照。將各中和組和對(duì)照組經(jīng)尿囊腔接種5枚鴨胚，0.2m1/胚，37℃培養(yǎng)，觀察7日，記錄各組死胚數(shù)。以50％鴨胚保護(hù)的最高血清稀釋度為血清的中和效價(jià)。中和試驗(yàn)結(jié)果顯示分離株可以被分離株陽(yáng)性血清完全中和，不能被DHV標(biāo)準(zhǔn)Ⅰ型鴨肝炎陽(yáng)性血清中和保護(hù)，試驗(yàn)組全部死亡；DRL-62陽(yáng)性血清與分離株作用后，中和效價(jià)為1:16；SD1陽(yáng)性血清與DRL-62毒株作用后，中和效價(jià)<1:8，表明分離株與DRL-62株無(wú)血清交叉保護(hù)作用，結(jié)果見(jiàn)表2。計(jì)算不同毒株間的親緣值R(其中R1為血清1對(duì)病毒2的中和效價(jià)與血清l對(duì)病毒1的中和效價(jià)之比；R2為血清2對(duì)病毒l的中和效價(jià)與血清2對(duì)病毒2的中和效價(jià)之比。)參照口蹄疫病毒根據(jù)親緣值(R)，區(qū)分血清型和亞型的區(qū)分標(biāo)準(zhǔn)(R值70％以上時(shí)，兩毒株亞型相同；R值在32～70％時(shí),兩毒株為不同的亞型；R值10％以下,毒株為不同的型)，DRL-62株與分離株之間的R值在10％以下(<0.74％)，不屬于同一血清型，為一種新的血清型。表2血清交叉中和試驗(yàn)結(jié)果實(shí)施例3血清被動(dòng)免疫保護(hù)試驗(yàn)1將230只5日齡易感雛鴨隨機(jī)分為5組，1、2、3、4組每組50只，5、6、7組每組10只。將SD1、GD株(國(guó)家獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心保藏號(hào)：CVCCAV321)陽(yáng)性血清(自制)分別稀釋至中和效價(jià)為：1:32、1:64、1:128、1:256、1:512。1、2組雛鴨每只肌肉注射SD1陽(yáng)性血清1.0m1，每個(gè)效價(jià)注射10只；3、4組雛鴨每只肌肉注射GD株陽(yáng)性血清1.0m1，每個(gè)效價(jià)注射10只。24小時(shí)后，1、3、5組雛鴨每只皮下注射100LD50SD1株0.2ml，2、4、6組雛鴨每只肌肉注射100LD50GD株0.2ml，第7組雛鴨不作任何注射為空白對(duì)照。分別隔離飼養(yǎng)，觀察10日，記錄各組死亡數(shù)。結(jié)果表明，SD1株、GD株均可以被各自血清保護(hù)；當(dāng)SD1陽(yáng)性血清抗體效價(jià)為1:128時(shí)被動(dòng)免疫雛鴨后，對(duì)GD株的攻擊能產(chǎn)生7/10保護(hù)，當(dāng)SD1效價(jià)為1:256時(shí)，可產(chǎn)生10/10保護(hù)；當(dāng)GD陽(yáng)性血清抗體效價(jià)為1:256時(shí)被動(dòng)免疫雛鴨后，對(duì)SD1株的攻擊能產(chǎn)生5/10保護(hù)，當(dāng)SD1效價(jià)為1:512時(shí)，可產(chǎn)生9/10保護(hù)?？梢?jiàn)SD1血清對(duì)GD株的保護(hù)效果優(yōu)于GD血清對(duì)SD1株的保護(hù)，結(jié)果見(jiàn)表3。表3被動(dòng)免疫保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果1注：表中比值為雛鴨存活比例，試驗(yàn)動(dòng)物不足10只組為發(fā)生非特異性死亡造成。實(shí)施例4血清被動(dòng)免疫保護(hù)試驗(yàn)2根據(jù)DHAV-3GD株全基因組序列設(shè)計(jì)并合成5對(duì)特異引物，應(yīng)用RT-PCR方法分5段擴(kuò)增DHV全基因組cDNA。將擴(kuò)增的cDNA重疊片段分別定向克隆到載體pBluescriptⅡKS(+)中，獲得DHAV-3GD全長(zhǎng)基因組cDNA質(zhì)粒。質(zhì)粒測(cè)序并送上海生物工程公司，設(shè)計(jì)突變引物，利用PCR介導(dǎo)的重疊延伸誘變法對(duì)VP1第49位密碼子GGT→ACT，196位密碼子GAT→AAT，207位密碼子AAG→GAG進(jìn)行定點(diǎn)突變。經(jīng)測(cè)序鑒定，定點(diǎn)突變準(zhǔn)確，未改變其他序列。將各片段連接獲得DHAV-3GD全長(zhǎng)基因組cDNA克隆。利用NruⅠ將全長(zhǎng)cDNA質(zhì)粒線性化，利用SP6RNA聚合酶系統(tǒng)在體外進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，獲得病毒RNA。利用酚/氯仿抽提，異丙醇沉淀的方法，將反轉(zhuǎn)錄體系中的酶等雜質(zhì)除去，從而提高轉(zhuǎn)染的效率。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)板中BHK-21細(xì)胞密度為80％時(shí)，根據(jù)DMRI-C轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。72h后將轉(zhuǎn)染病毒RNA細(xì)胞凍溶1次后接種BHK-21細(xì)胞，拯救出病毒GD-BHK。拯救病毒接種10日齡鴨胚后，可使其致死。血清中和試驗(yàn)表明拯救病毒可以被GD陽(yáng)性血清中和。測(cè)序結(jié)果表明拯救病毒與親本毒共有8個(gè)氨基酸的差異，未見(jiàn)此8個(gè)氨基酸與病毒毒力有關(guān)的報(bào)道。利用拯救病毒免疫SPF雞制備陽(yáng)性血清，將中和效價(jià)分別稀釋至：1:32、1:64、1:128、1:256、1:512。1、2組雛鴨每只肌肉注射GD拯救毒陽(yáng)性血清1.0m1，每個(gè)效價(jià)注射10只。24小時(shí)后，1、2組雛鴨分別用100LD50SD1株、GD株攻擊，0.2ml/只。另設(shè)SD1株、DG株攻毒對(duì)照和不作任何注射的空白對(duì)照組。各組隔離飼養(yǎng)，觀察10日，記錄雛鴨死亡情況。結(jié)果顯示，當(dāng)GD拯救株血清中和效價(jià)≥1:64時(shí)可對(duì)SD1產(chǎn)生9/10以上的保護(hù)，當(dāng)中和效價(jià)≥1:256時(shí)可對(duì)GD產(chǎn)生9/10以上的保護(hù)，此結(jié)果與被動(dòng)免疫保護(hù)試驗(yàn)1中SD1陽(yáng)性血清的保護(hù)效果相近，說(shuō)明GD拯救株的突變一定程度上改變了其免疫原性，使其獲得了與SD1株相近的攻毒保護(hù)效果，具有與SD1株相當(dāng)?shù)拿庖咴裕捎贕D拯救株的突變與SD1株一樣，是在結(jié)構(gòu)蛋白VP1的49-T、196-N、207-E三個(gè)氨基酸取代位點(diǎn)和197-Q、198-S、199-D三個(gè)共有位點(diǎn)發(fā)生了相同的變化。由此可見(jiàn)該突變位點(diǎn)對(duì)鴨病毒性肝炎病毒免疫原性有著重要的影響，不僅SD1株因突變相應(yīng)位點(diǎn)，免疫原性增強(qiáng)，而且在突變了GD株相應(yīng)位點(diǎn)后，其免疫原性也相應(yīng)發(fā)生了改變。從而說(shuō)明了具有49-T、196-N、207-E三個(gè)氨基酸取代位點(diǎn)和197-Q、198-S、199-D三個(gè)共有位點(diǎn)的毒株具有良好的免疫原性。表4被動(dòng)免疫保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果2注：表中比值為雛鴨存活比例，試驗(yàn)動(dòng)物不足10只組為發(fā)生非特異性死亡造成。實(shí)施例5DHVSD1株的理化特性鑒定1.乙醚敏感性試驗(yàn)取收獲的鴨胚液，3000轉(zhuǎn)/分鐘離心15min，去除較大顆粒。吸取上清液1.6ml，分別移入2個(gè)滅菌小瓶中，每瓶0.8ml，并于其中一瓶?jī)?nèi)加入麻醉用乙醚0.2ml，另一瓶中不加乙醚作為對(duì)照。兩瓶均用橡皮塞塞緊后置4℃24小時(shí)，期間不時(shí)振蕩。加入乙醚的小瓶，此時(shí)分為清晰的兩層：上層為乙醚，下層為病毒液。然后用毛細(xì)吸管吸取病毒液，移入另一小瓶?jī)?nèi)，適當(dāng)吹打，使殘余乙醚揮發(fā)殆盡。最后取上述兩份病毒液分別作10倍系列稀釋?zhuān)總€(gè)稀釋度接種10枚10日齡非免鴨胚，觀察168小時(shí)，記錄鴨胚死亡情況。比較乙醚處理的病毒液和對(duì)照病毒液的病毒含量。2.氯仿敏感性試驗(yàn)取收獲的鴨胚液，3000轉(zhuǎn)/分鐘離心15min，去除較大顆粒。向病毒液內(nèi)加入氯仿(分析純)，使其終濃度為4.8％，置4℃振蕩混合10分鐘，隨后500轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，吸取上層液體，測(cè)定病毒含量。對(duì)照病毒液加入等同于氯仿量的滅菌生理鹽水，同樣處理后測(cè)定病毒含量。比較氯仿處理的病毒液和對(duì)照病毒液的病毒含量。3.耐酸性試驗(yàn)取收獲的鴨胚液，3000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，去除較大顆粒。取上清等量分裝于2個(gè)小瓶中。用0.1mol/L的HCl將1個(gè)小瓶中的病毒液調(diào)pH值為3.0，并在另1個(gè)小瓶中的病毒液內(nèi)加入等同于酸量的滅菌生理鹽水作為對(duì)照，置37℃感作2小時(shí)后，再用5.6％NaHCO3溶液將pH值調(diào)至7.2左右。對(duì)照加入等同于堿量的滅菌生理鹽水。將兩瓶病毒液作10倍系列稀釋?zhuān)總€(gè)稀釋度接種10枚10日齡非免鴨胚，觀察168小時(shí)，記錄鴨胚死亡情況。比較酸處理的病毒液和對(duì)照病毒液的病毒含量。4.耐熱性試驗(yàn)取收獲的鴨胚液，3000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，去除較大顆粒。取上清等量分裝于2個(gè)小瓶中，1瓶置于50℃水浴作用30分鐘，另1瓶不作處理作為對(duì)照。將兩瓶病毒液作10倍系列稀釋?zhuān)總€(gè)稀釋度接種10枚10日齡非免鴨胚，觀察168小時(shí)，記錄鴨胚死亡情況。比較熱處理的病毒液和對(duì)照病毒液的病毒含量。5.胰蛋白酶敏感性試驗(yàn)取收獲的鴨胚液，3000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，去除較大顆粒。取上清等量分裝于2個(gè)小瓶中，每瓶1.0ml，在其中1瓶加入1.0ml1％的胰蛋白酶，使終濃度為0.5％，另一瓶加入1.0ml1640培養(yǎng)基，用橡皮塞塞緊瓶口，將小瓶倒轉(zhuǎn)幾次，使其充分混合，置37℃作用1小時(shí)，隨即加入滅活胎牛血清8.0ml，充分混合，終止胰酶的作用。將兩瓶病毒液作10倍系列稀釋?zhuān)總€(gè)稀釋度接種10枚10日齡非免鴨胚，觀察168小時(shí)，記錄鴨胚死亡情況。比較胰蛋白酶處理的病毒液和對(duì)照病毒液的病毒含量。理化特性鑒定結(jié)果：參照以上試驗(yàn)方法進(jìn)行，可見(jiàn)DHVSD1分離株經(jīng)乙醚、氯仿、酸、熱、胰酶處理后，毒價(jià)無(wú)明顯降低，結(jié)果參見(jiàn)表5、表6、表7、表8。表5脂溶劑敏感試驗(yàn)結(jié)果表6耐酸性試驗(yàn)結(jié)果表7耐熱性試驗(yàn)結(jié)果表8胰蛋白酶敏感性試驗(yàn)結(jié)果實(shí)施例6：鴨病毒性肝炎二價(jià)蛋黃抗體的制備用DRL-62、SD1毒株制備的二聯(lián)滅活油苗肌肉注射120日齡蛋雞1ml/只，兩周后二免，10日后三免，三免后10日進(jìn)行第四次強(qiáng)化免疫，每次免疫劑量同首免。四免后10日抽樣測(cè)定雞高免蛋黃中DRL-62抗體中和效價(jià)1:17620、SD1抗體中和效價(jià)1:13932，集蛋，置4℃貯存?zhèn)溆?。無(wú)菌打蛋收集蛋黃。加入等體積經(jīng)121℃30min滅菌并冷卻的蒸餾水，攪拌混勻，62.5℃加熱滅活30min。在隔層反應(yīng)罐中加入6體積滅菌蒸餾水(pH值為4.2)，降溫至4℃后，緩慢加入滅活的蛋黃液，邊加邊攪拌，4℃靜置4h。管式低溫連續(xù)離心機(jī)14000rpm離心分離上清液并轉(zhuǎn)入另一反應(yīng)罐中。按總量的0.2％(體積比)加入辛酸，攪拌均勻，室溫放置4h。濾布過(guò)濾后，再用K型多層板框過(guò)濾至澄清，按總量的0.1％加入飽和甲醛溶液，充分?jǐn)嚢杌靹颍覝胤胖?4h，期間振搖數(shù)次。用0.22μm微孔濾芯過(guò)濾除菌。用截留分子量為1000KDa的超濾膜過(guò)濾除病毒。實(shí)施例7鴨病毒性肝二價(jià)蛋黃抗體預(yù)防性試驗(yàn)鴨肝二價(jià)蛋黃抗體(A組)、DHAV-1抗體(B組)和DHAV-3抗體(C組)分別肌肉注射1日齡、6日齡、12日齡、18日齡雛鴨，每組每日齡10只。1日齡雛鴨注射抗體0.5ml/只，6日齡、12日齡、18日齡雛鴨注射抗體1.0ml/只。注射抗體后24小時(shí)每只雛鴨用100LD50的DRL-62、SD1強(qiáng)毒攻擊。攻毒同時(shí)設(shè)病毒對(duì)照和空白對(duì)照各10只。各試驗(yàn)組分開(kāi)飼養(yǎng)，觀察10日，記錄雛鴨死亡數(shù)。結(jié)果顯示，鴨肝二價(jià)蛋黃抗體可保護(hù)各日齡雛鴨全部健活，而單獨(dú)使用DHAV-1抗體和DHAV-3抗體則明顯不能抵抗DHAV-1、DHAV-3的攻擊。結(jié)果見(jiàn)表9。表9預(yù)防性試驗(yàn)結(jié)果注：表中比值為雛鴨存活比例，試驗(yàn)動(dòng)物不足10只組為發(fā)生非特異性死亡造成。實(shí)施例8鴨病毒性肝炎二價(jià)蛋黃抗體治療試驗(yàn)8.1：試驗(yàn)分為A、B、C3組，每組隨機(jī)選擇60只4日齡雛鴨實(shí)驗(yàn)室條件下人工感染DHAV-1和DHAV-3。A組雛鴨分為3組，每組20只，分別于感染后24小時(shí)、36小時(shí)、48小時(shí)肌肉注射鴨病毒性肝炎二價(jià)蛋黃抗體，1.0ml/只；B組、C組操作同A組，分別使用DHAV-1和DHAV-3鴨病毒性肝炎抗體進(jìn)行治療。試驗(yàn)設(shè)10只雛鴨不作注射為空白對(duì)照。每組設(shè)10只感染后不治療對(duì)照。各組分開(kāi)飼養(yǎng)，觀察10日，觀察并記錄雛鴨死亡情況。結(jié)果顯示，感染后24小時(shí)用抗體進(jìn)行治療，所有雛鴨在觀察期內(nèi)未再出現(xiàn)死亡，而攻毒后48小時(shí)使用抗體治療組，雛鴨治愈率明顯降低。可見(jiàn)雛鴨感染后越早使用抗體，可大大提高保護(hù)效果。結(jié)果同時(shí)顯示，僅用DHAV-1或DHAV-3鴨肝抗體無(wú)法產(chǎn)生有效保護(hù)力?？瞻讓?duì)照全活，未治療組10日后全部死亡，結(jié)果見(jiàn)表10。表10人工感染治療試驗(yàn)結(jié)果注：表中比值為雛鴨存活比例，試驗(yàn)動(dòng)物不足10只組為發(fā)生非特異性死亡造成。8.2：河南信陽(yáng)鴨場(chǎng)6日齡雛鴨發(fā)病，表現(xiàn)精神不振，食欲減退，縮頸、臥地，于7日齡開(kāi)始出現(xiàn)死亡，死亡前雙腿痙攣，角弓反張，送信陽(yáng)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心檢驗(yàn)，剖檢發(fā)現(xiàn)肝臟腫大、出血，腎臟腫大、充血，脾臟腫大，采集肝臟組織進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果為DHAV-1、DHAV-3鴨病毒性肝炎陽(yáng)性。8日齡使用二價(jià)蛋黃抗體皮下注射，同時(shí)分別使用DHAV-1和DHAV-3鴨肝抗體作為對(duì)照治療組1、2，觀察10日。結(jié)果顯示，治療組1622只雛鴨從治療后第5日開(kāi)始不出現(xiàn)死亡，共存活1339只，保護(hù)率為81.6％，而對(duì)照治療組1、2保護(hù)率分別僅為6.3％、57.8％，結(jié)果見(jiàn)表11。可見(jiàn)二價(jià)抗體可對(duì)目前臨床多發(fā)的DHAV-1、DHAV-3鴨病毒性肝炎起到較為理想的保護(hù)效果，而單獨(dú)使用DHAV-1或DHAV-3抗體無(wú)法有效控制不同血清型鴨病毒性肝炎的發(fā)生。表11自然發(fā)病治療試驗(yàn)結(jié)果實(shí)施例9DHAV-3SD1蛋黃抗體的制備及保護(hù)效果試驗(yàn)1.DHAV-3SD1蛋黃抗體的制備1.1抗原的制備將鴨肝炎病毒SD1株毒種用滅菌PBS溶液作1∶100稀釋?zhuān)?jīng)尿囊腔接種10日齡易感鴨胚，每胚0.2ml。置37℃繼續(xù)孵育，棄去48小時(shí)內(nèi)的死胚，收獲48～96小時(shí)死亡鴨胚，將檢驗(yàn)無(wú)菌的鴨胚液混合后3500轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘，吸取上清液于滅菌容器，加入10％甲醛溶液，隨加隨搖，使其充分混合，甲醛溶液的終濃度為0.15％，密閉后置37℃溫箱中作用24小時(shí)(期間振搖3～4次)。1.2免疫用滅活苗的制備油相配制：取注射用白油94份，司本-806份混合后，加入硬脂酸鋁2份，邊加熱邊攪拌至透明后高壓滅菌備用，即為油相。水相配制：按抗原的4％加入滅菌吐溫-80，充分振搖，使吐溫-80完全溶解，即為水相。乳化：取油相2份置油相罐內(nèi)，開(kāi)動(dòng)電機(jī)攪拌，徐徐加入1份水相，再以3400轉(zhuǎn)/分鐘乳化10分鐘即可。在乳化終止前加入1％硫柳汞，使其終濃度為0.01％。取樣3000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，應(yīng)不分層。分裝：定量分裝，加蓋密封。1.3免疫蛋雞120日齡左右用滅活油苗肌肉注射1ml/只，14日后用滅活苗肌肉注射1ml/只，二免10日后及三免10日后分別用滅活苗肌肉注射1ml/只。當(dāng)?shù)包S中SD1抗體中和效價(jià)≥1∶8192集蛋，置4℃貯存?zhèn)溆谩?.4蛋黃抗體的制備將蛋殼消毒，收集蛋黃。充分?jǐn)嚢枋沟包S呈均勻膏狀，加入等體積經(jīng)121℃30min滅菌并冷卻的蒸餾水，攪拌混勻，62.5℃加熱滅活30min。先在隔層反應(yīng)罐中加入相當(dāng)于原蛋黃6倍體積的pH值為4.2的滅菌蒸餾水，并降溫至4℃。然后，將滅活的蛋黃液加入，邊加邊攪拌，4℃靜置4h。管式低溫連續(xù)離心機(jī)14000rpm離心分離上清液并轉(zhuǎn)入另一反應(yīng)罐中。按總量的0.2％(體積比)加入辛酸，攪拌均勻，室溫放置4h。用濾布過(guò)濾后，再用K型多層板框過(guò)濾至澄清，再按總量的0.1％加入飽和甲醛溶液于上述濾液中，充分?jǐn)嚢杌靹?，室溫放?4h，期間振搖數(shù)次。用0.22μm微孔濾芯過(guò)濾除菌。用截留分子量為1000KDa的超濾膜過(guò)濾除病毒。即得SD1蛋黃抗體。2.DHVSD1蛋黃抗體攻毒保護(hù)效果將4日齡雛鴨分為1、2、3組，1、2組每組10只，3組5只。1組注射抗體0.5ml/只，注射抗體后24小時(shí)1、2組每只雛鴨用100LD50的SD1強(qiáng)毒攻擊。3組為空白對(duì)照組。各試驗(yàn)組分開(kāi)飼養(yǎng)，觀察10日，記錄雛鴨死亡數(shù)。結(jié)果顯示，SD1抗體可保護(hù)免疫組攻毒后雛鴨全部存活，病毒對(duì)照組全部死亡，空白對(duì)照組全部存活。結(jié)果見(jiàn)表12。表12SD1抗體攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果組別免疫組病毒對(duì)照組空白對(duì)照組雛鴨存活比例10/100/105/5實(shí)施例10DHAV-3SD1VP1蛋白免疫效果試驗(yàn)按Trizol病毒RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)從鴨胚收獲的病毒液中提取病毒RNA。RT-PCR擴(kuò)增DHAV-3SD1VP1基因序列。將VP1基因克隆到表達(dá)載體pET-32a(+)中，篩選原核表達(dá)載體pET-32a-VP1，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21細(xì)胞進(jìn)行大量表達(dá)，包涵體蛋白經(jīng)裂解、洗滌、純化、復(fù)性、濃縮即獲得DHAV-3SD1VP1蛋白。紫外吸收法定量蛋白濃度，將所獲得的蛋白稀釋為850微克/ml按實(shí)施例9中1.2的方法制苗，免疫SPF雞10只，皮下注射1.0ml/只。三免后10天采血分離血清，56℃滅活。將4日齡雛鴨分為4組，每組10只。1組注射重組蛋白(VP1)抗血清，0.5ml/只；2組注射SD1抗血清，0.5ml/只；3組為未免疫組不注射任何血清；次日1、2、3組雛鴨用SD1強(qiáng)毒攻擊，4組作為空白對(duì)照組。各組隔離飼養(yǎng)觀察10日。攻毒結(jié)果表明，SD1抗血清組雛鴨存活10/10；重組蛋白抗血清組雛鴨存活5/10；而未免疫組雛鴨則全部死亡。本發(fā)明DHVSD1重組VP1蛋白抗血清免疫雛鴨，可以部分抵御SD1強(qiáng)毒的致死攻擊，可見(jiàn)DHVSD1重組VP1蛋白有相當(dāng)?shù)拿庖咴裕闺r鴨獲得免疫保護(hù)力。表13DHAV-3SD1VP1蛋白免疫效果以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。SEQUENCELISTING<110>普萊柯生物工程股份有限公司<120>鴨病毒性肝炎二價(jià)蛋黃抗體及其制備方法和應(yīng)用<160>1<170>PatentInversion3.3<210>1<211>745<212>DNA<213>鴨肝炎病毒<400>1caatgatcagggtgattccaatcagcttggtgatgatgaaccagtgtgttttctcaattt60tgagactgcaaatgtgccaatacaaggggagtcgcacaccttggtgaaacatctttttgg120ccgtcaatggctggttcgtactgttcaacatactactgaggtacaagagttggatttgcc180agtacctgaccagggtcatgcatctctgttgcgcttctttgcctatttctctggggaagt240gattctgaccattgttaataatggaacaacaccctgcatggttgcacactcttatacaat300ggacaatctcacttctgaatatgctgtcactgccatggggggtattcttatcccagcaaa360ctctgccaagaatattaatatcccattttattctgttacacctttacgccccacacgacc420catgccagcatctcaggggggtggcttgacttttggcaggttgtatatttggacacaatc480aggaagtgtttctgtttttatgggcctccataagccagctttgtttttcccactacctgc540accaacctacacaacacacacgctgttgaataagattgaaaccatgaatctgcataatca600atcagatcagccagattgccatctgtgtgagatttgtaggaaaatgaaaaaatggtctcg660caaccatcgcccatttcgcttctgtttgagactcaaaacacttgcctttgagctccattt720ggaaattgaatcataccaatttcga745當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3