本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域中g(shù)ma-miR166a及其相關(guān)生物材料在調(diào)控植物抗鹽性中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：土壤鹽漬化嚴(yán)重影響當(dāng)?shù)剞r(nóng)作物的產(chǎn)量、品質(zhì)及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和經(jīng)濟(jì)發(fā)展。通過研究植物耐鹽的生理和分子生物學(xué)機(jī)制，挖掘耐鹽基因資源，并運(yùn)用基因工程手段培育耐鹽作物，對于提高農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要的意義。miRNA(microRNA，微小RNA)是一類長度約為20-24個(gè)核苷酸的內(nèi)源單鏈非編碼小分子RNA，可通過調(diào)控細(xì)胞中與某信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)mRNA，指導(dǎo)靶基因的切割或降低靶基因的翻譯，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制植物基因表達(dá)，從而影響植物形態(tài)發(fā)生、發(fā)育過程、適應(yīng)環(huán)境的能力和激素信號傳導(dǎo)等，是一種新的基因調(diào)控模式。近年來大量研究表明，miRNA參與調(diào)控植物生長發(fā)育以及應(yīng)答生物和非生物脅迫等許多重要生物學(xué)過程。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何提高植物的抗鹽性。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了gma-miR166a在調(diào)控植物抗鹽性中的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的gma-miR166a在調(diào)控植物抗鹽性中的應(yīng)用中，所述gma-miR166a的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了與所述gma-miR166a相關(guān)的生物材料在調(diào)控植物抗鹽性中的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的與所述gma-miR166a相關(guān)的生物材料在調(diào)控植物抗鹽性中的應(yīng)用中，所述與所述gma-miR166a相關(guān)的生物材料為如下1)-7)中任一種生物材料：1)表達(dá)所述gma-miR166a的核酸分子；2)表達(dá)所述gma-miR166a的表達(dá)盒；3)表達(dá)所述gma-miR166a的表達(dá)載體；4)表達(dá)所述gma-miR166a的重組微生物細(xì)胞；5)表達(dá)所述gma-miR166a的重組植物細(xì)胞；6)表達(dá)所述gma-miR166a的重組植物組織；7)表達(dá)所述gma-miR166a的重組植物器官。上述應(yīng)用中，1)所述表達(dá)所述gma-miR166a的核酸分子的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。上述應(yīng)用中，所述植物可為雙子葉植物和/或單子葉植物；所述雙子葉植物可為十字花科植物；所述十字花科植物具體可為擬南芥。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了一種培育抗鹽性轉(zhuǎn)基因植物的方法1。本發(fā)明所提供的培育抗鹽性轉(zhuǎn)基因植物的方法1，包括向受體植物中導(dǎo)入與所述gma-miR166a相關(guān)的生物材料，得到抗鹽性高于所述受體植物的抗鹽性轉(zhuǎn)基因植物。上述方法1中，所述與所述gma-miR166a相關(guān)的生物材料為如下1)-3)中任一種生物材料：1)表達(dá)所述gma-miR166a的核酸分子；2)表達(dá)所述gma-miR166a的表達(dá)盒；3)表達(dá)所述gma-miR166a的表達(dá)載體。上述方法1中，1)所述表達(dá)所述gma-miR166a的核酸分子的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。上述方法1中，所述轉(zhuǎn)基因植物或所述受體植物為雙子葉植物或單子葉植物；所述雙子葉植物可為十字花科植物；所述十字花科植物具體可為擬南芥。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了與所述gma-miR166a相關(guān)的生物材料。本發(fā)明所提供的與所述gma-miR166a相關(guān)的生物材料，為如下1)-7)中任一種生物材料：1)表達(dá)所述gma-miR166a的核酸分子；2)表達(dá)所述gma-miR166a的表達(dá)盒；3)表達(dá)所述gma-miR166a的表達(dá)載體；4)表達(dá)所述gma-miR166a的重組微生物細(xì)胞；5)表達(dá)所述gma-miR166a的重組植物細(xì)胞；6)表達(dá)所述gma-miR166a的重組植物組織；7)表達(dá)所述gma-miR166a的重組植物器官。上述gma-miR166a在抑制AtPHB基因或其同源基因表達(dá)中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了一種培育抗鹽性轉(zhuǎn)基因植物的方法2。本發(fā)明所提供的一種培育抗鹽性轉(zhuǎn)基因植物的方法2，包括抑制受體植物中AtPHB基因或其同源基因表達(dá)，得到抗鹽性高于所述受體植物的抗鹽性轉(zhuǎn)基因植物。上述方法2中，所述轉(zhuǎn)基因植物或所述受體植物為雙子葉植物或單子葉植物；所述雙子葉植物可為十字花科植物；所述十字花科植物具體可為擬南芥。上文中，所述AtPHB基因的同源基因?yàn)镚mPHB基因，所述GmPHB基因的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示。實(shí)驗(yàn)證明，將含有表達(dá)gma-miR166a的核酸分子的重組載體p3300-miR166a導(dǎo)入野生型擬南芥中獲得的表達(dá)gma-miR166a的轉(zhuǎn)基因擬南芥在鹽脅迫培養(yǎng)下，gma-miR166a表達(dá)量上調(diào)，而gma-miR166a的靶基因GmPHB基因和AtPHB基因的表達(dá)量下調(diào)，提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗鹽性。在150mM鹽脅迫處理下，轉(zhuǎn)基因組1擬南芥的存活率為93％，是野生型組1擬南芥的存活率77％的1.21倍；在200mM鹽脅迫處理下，轉(zhuǎn)基因組2擬南芥的存活率為83％，是野生型組1擬南芥的存活率76％的1.09倍。本發(fā)明的gma-miR166a在調(diào)控植物生長發(fā)育以及應(yīng)答生物和非生物脅迫等許多重要生物學(xué)過程具有重要的意義。附圖說明圖1為不同品種的大豆在鹽脅迫條件培養(yǎng)下不同時(shí)間點(diǎn)的gma-miR166a表達(dá)量。圖2為在鹽脅迫條件下gma-miR166a與靶基因GmPHB基因的表達(dá)量關(guān)系。其中，a為gma-miR166a的不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量；b為靶基因GmPHB基因的不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量。圖3為重組載體p3300-miR166a的結(jié)構(gòu)示意圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中的大豆品種“中品95-5383”(鄭翠明，常汝鎮(zhèn)，邱麗娟.大豆對SMV3號株系的抗性遺傳分析及抗病基因的RAPD標(biāo)記研究.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)2001，34(1)：14-18。)公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用。下述實(shí)施例中的載體pBI121為Clontech公司產(chǎn)品。pCAMBIA3300載體為CAMBIA,Canberra,Australia的產(chǎn)品http://www.cambia.org/daisy/cambia/1208.html)。下述實(shí)施例中的測序載體pMD18-T為TaKaRa公司的產(chǎn)品。下述實(shí)施例中的TOP10感受態(tài)細(xì)胞為天根生化科技(北京)有限公司的產(chǎn)品。下述實(shí)施例中的RNAisoPlus、PrimeScriptTMReverseTranscriptase均為TaKaRa公司的產(chǎn)品；5’RLM-RACE試劑盒為Ambion公司的產(chǎn)品；DNA凝膠回收試劑盒為Axygen公司的產(chǎn)品；RQ1RNase-FreeDNase(RQ1無核酸酶的DNA酶)為Promega 公司的產(chǎn)品；miRcutemiRNAcDNA第一鏈合成試劑盒、miRcutemiRNA熒光定量檢測試劑盒(SYBRGreen)均為天根生化科技(北京)有限公司的產(chǎn)品；下述實(shí)施例中所用相關(guān)試劑的配制方法：轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基配方：10×MS大量元素100mL，100×MS微量元素10mL，Sucrose50g，MES0.6g，Silweet-77200μL。實(shí)施例1、gma-miR166a的發(fā)現(xiàn)一、處理1、取大豆品種“中品95-5383”種子，分別用濃度為8％(質(zhì)量百分含量)的次氯酸鈉水溶液和濃度為70％(體積比)的酒精水溶液處理4min，然后用無菌水反復(fù)沖洗3次，然后在人工氣候箱(RXZ智能型,寧波江南儀器廠)中培養(yǎng)3周(培養(yǎng)條件：溫度為25℃，光強(qiáng)為10000lux，光周期為16h光照和8h黑暗，濕度為65％)。2、完成步驟1后，選長勢一致的苗，輕柔的將根洗凈，移入1/2Hoagland營養(yǎng)液中穩(wěn)定培養(yǎng)3天(每天更換營養(yǎng)液，其它培養(yǎng)條件同步驟1)后進(jìn)行鹽脅迫處理。鹽脅迫處理：將幼苗移入含濃度為300mMNaCl的1/2Hoagland營養(yǎng)液中培養(yǎng)。在鹽脅迫處理培養(yǎng)的0、1、3、6、12和24h時(shí)分別對根、莖和葉進(jìn)行取樣，用錫箔紙包裹樣品后放入液氮中速凍，-80℃保存?zhèn)溆?。二、gma-miR166a的發(fā)現(xiàn)1、RNA提取取步驟一的在液氮中凍存的大豆樣品，在液氮中研磨，用RNAisoPlus提取總RNA，使用Ultrospec3000型紫外分光光度計(jì)(GEHealthcareBio-Sciences，China)分別測定總RNA在260nm和280nm波長處的OD值以確定總RNA的純度和濃度。質(zhì)量合格的RNA濃度應(yīng)在1μg/μL以上，OD260/OD280的比值在1.8-2.0之間，且經(jīng)電泳檢測條帶清晰，無明顯降解和DNA污染。2、miRNA文庫的構(gòu)建將質(zhì)量檢驗(yàn)合格的總RNA用于構(gòu)建小RNA文庫。取鹽脅迫處理的大豆樣品總RNA10μg用于構(gòu)建大豆幼苗小RNA文庫。大豆幼苗小RNA文庫中用Solexa技術(shù)高通量測序發(fā)現(xiàn)了一種miRNA，將其命名為gma-miR166a，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示；將gma-miR166a的RNA前體命名為pre-gma-miR166a，其核苷酸序列如SEQIDNo.3所示。實(shí)施例2、gma-miR166a靶基因預(yù)測及鑒定gma-miR66a靶基因預(yù)測采用psRNA(http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/)進(jìn)行。預(yù)測的gma-miR66a靶基因鑒 定采用5’RLM-RACE試劑盒，操作步驟略有改變：接頭用T4RNA連接酶直接與1μg實(shí)施例1制備的總RNA連接，然后用隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)預(yù)測靶基因序列設(shè)計(jì)巢式引物，PHB-R1與試劑盒提供的接頭引物5'OP一起進(jìn)行Touch-DownPCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序如下：94℃預(yù)變性4min；94℃變形30s，64-53℃退火30s，72℃延伸30s，12個(gè)循環(huán)(-1℃/循環(huán))；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸8min，得到第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。第二輪PCR的模板為第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的1/10濃度稀釋液，PHB-R2與試劑盒提供的接頭引物5'IP一起進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，第二輪PCR的程序與第一輪PCR相同，得到第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。將第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2％的瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到約250bp的目標(biāo)片段。將目標(biāo)片段采用DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收，回收得到的目標(biāo)片段與測序載體pMD18-T在16℃連接1h后轉(zhuǎn)入TOP10感受態(tài)細(xì)胞中，得到重組細(xì)胞，將重組細(xì)胞涂布在含氨芐青霉素(濃度為50μg/mL)的LB平板上，37℃培養(yǎng)12h-16h，挑取單克隆于含氨芐青霉素(濃度為50μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)6h，得到重組細(xì)胞菌液。取1μL重組細(xì)胞菌液作為模板進(jìn)行菌液PCR檢測并采用M13通用引物雙向測序，得到約250bp的目標(biāo)片段，確定gma-miR66a的靶基因?yàn)镚lyma09g02750(下文簡稱GmPHB)(表1)。gma-miR166a的靶基因GmPHB的切割引物和接頭引物如下；GmPHB-R2：5'-ATCTTAGTGTCCAGAAGTCCCGTG-3'GmPHB-R1:5'-CTAGAAAACCACTGGGAAGCATT-3'5'IP:5'-CGCGGATCCGAACACTGCGTTTGCTGGCTTTGATG-3'5'OP:5'-GCTGATGGCGATGAATGAACACTG-3靶基因GmPHB編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQIDNo.4所示；其核苷酸序列如SEQIDNo.5所示，編碼基因?yàn)镾EQIDNo.5的第389-2929位所示。表1、gma-miR166a的靶基因及功能實(shí)施例3、gma-miR166a及其靶基因GmPHB的表達(dá)分析為了進(jìn)一步驗(yàn)證大豆gma-miR166a具有應(yīng)答高鹽脅迫應(yīng)答的表達(dá)，采用miRNA定量PCR檢測gma-miR166a及其靶基因GmPHB的表達(dá)情況。1、鹽脅迫處理和取樣1)取大豆品種“鐵豐8”(耐鹽品種)和“85-140”(鹽敏感品種)的種子，分別用 濃度為8％(質(zhì)量百分含量)的次氯酸鈉水溶液和濃度為70％(體積比)的酒精水溶液處理4min，然后用無菌水反復(fù)沖洗3次，然后在人工氣候箱中培養(yǎng)3周(培養(yǎng)條件：溫度為25℃，光強(qiáng)為10000lux，光周期為16h光照和8h黑暗，濕度為65％)。2)完成步驟1后，選長勢一致的苗，輕柔的將根洗凈，移入1/2Hoagland營養(yǎng)液中培養(yǎng)3天(每天更換營養(yǎng)液，培養(yǎng)條件同步驟1)。3)完成步驟2后，將幼苗移入含濃度為300mMNaCl的1/2Hoagland營養(yǎng)液中進(jìn)行鹽脅迫處理，在鹽脅迫處理培養(yǎng)的0、1、3、6、12和24h時(shí)分別對根、莖和葉進(jìn)行取樣。2、gma-miR166a表達(dá)分析用RNAisoPlus提取步驟1獲得的樣品中的總RNA，用RQ1RNase-FreeDNase(RQ1無核酸酶的DNA酶)去除總RNA中的基因組DNA。cDNA合成使用miRcutemiRNAcDNA第一鏈合成試劑盒，gma-miR166a定量表達(dá)使用7300Real-TimePCR系統(tǒng)(AppliedBiosystems)和miRcutemiRNA熒光定量檢測試劑盒(SYBRGreen)進(jìn)行檢測，采用大豆miR1520d作為內(nèi)參，在熒光定量PCR中使用的引物如下：gma-miR166a:5'-TCGGACCAGGCTTCATTCCC-3'gma-miR1520d:5'-ATCAGAACATGACACGTGACAA-3'結(jié)果如圖1所示，在鹽脅迫處理下，耐鹽品種鐵豐8中g(shù)ma-miR166a在1h時(shí)表達(dá)量升高，隨后表達(dá)量開始下降,在12h和24h時(shí)幾乎不表達(dá)；在鹽敏感品種85-140中g(shù)ma-miR166a在3h和6h時(shí)的表達(dá)量最高，隨后開始下降，在12h和24h時(shí)幾乎不表達(dá)。3、gma-miR166a靶基因GmPHB的表達(dá)量分析用RNAisoPlus提取步驟1獲得的大豆品種“85-140”(鹽敏感品種)樣品中的總RNA，用RQ1RNase-FreeDNase(RQ1無核酸酶的DNA酶)去除總RNA中的基因組DNA。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMReverseTranscriptase將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。靶基因GmPHB的表達(dá)量分析使用7300Real-TimePCR系統(tǒng)(AppliedBiosystems)和miRcutemiRNA熒光定量檢測試劑盒(SYBRGreen)進(jìn)行檢測。熒光定量PCR反應(yīng)體系：2×ROXFastStartUniversalSYBRGreen10μL，正向引物(10μM)0.5μL，反向引物(10μM)0.5μL，cDNA1/10濃度稀釋液1μL，去離子水8μL。實(shí)時(shí)定量PCR程序：95℃預(yù)變性10min；95℃變性15s，60℃退火30s，72℃延伸15s,40個(gè)循環(huán)。以18SrDNA作為內(nèi)參，18SrDNA和靶基因GmPHB的檢測引物如下：GmPHB-F:5'-CAACAGCAAAACCCAACACCTC-3’GmPHB-R:5'-GTATCTCAGCAACCTTAGTGGGC-3’18SrDNA-F：5’-CCTTGCTTGTTGCTTTACTAAATAG-3’18SrDNA-R：5’-ATGCACCTTTTCGTTTGTTTCGGAG-3’結(jié)果如圖2所示，靶基因GmPHB在鹽脅迫處理下表達(dá)量發(fā)生了明顯的變化，通過與gma-miR166a的表達(dá)量進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)GmPHB的表達(dá)和gma-miR166a的表達(dá)呈現(xiàn)出明顯的負(fù)相關(guān)性，即鹽脅迫條件下gma-miR166a表達(dá)量上調(diào)的時(shí)候，GmPHB基因的表達(dá)就相應(yīng)下調(diào)，與miRNA對靶基因的負(fù)調(diào)控作用是完全一致的。實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果進(jìn)一步證明了GmPHB確實(shí)是gma-miR166a的靶基因。實(shí)施例4、培育抗鹽性植物一、gma-miR166a植物表達(dá)載體的構(gòu)建1、提取大豆品種“中品95-5383”葉片的基因組DNA。2、以步驟1得到的基因組DNA為模板，采用166a-F1和166a-R1組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物兩端分別為XbaI和SacI酶切識(shí)別序列，XbaI和SacI酶切識(shí)別序列之間的核苷酸如SEQIDNo.2所示。166a-F1:5’-GCTCTAGAACGGAAGCTTTGTCTTTTGAG-3’(下劃線為XbaI酶切位點(diǎn))；166a-R1:5’-CGAGCTCTTTGGAAGCATATAATTGG-3’(下劃線為SacI酶切位點(diǎn))。3、用限制性內(nèi)切酶XbaI和SacI雙酶切步驟2得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。4、用限制性內(nèi)切酶XbaI和SacI雙酶切pBI121載體，回收載體骨架。5、將步驟3的酶切產(chǎn)物和步驟4的載體骨架連接，得到重組載體p121-166a。經(jīng)測序，重組載體p121-166a是將載體pBI121中的XbaI和SacI酶切識(shí)別序列之間的序列(GUS基因)替換為SEQIDNo.2所示的DNA分子，保持其它序列不變得到的重組載體。6、用限制性內(nèi)切酶EcoRI和HindIII雙酶切重組載體步驟5得到的重組載體p121-166a，回收小片段(35S-pre-gma-miR166a的編碼DNA-NOS)。7、用限制性內(nèi)切酶EcoRI和HindIII雙酶切載體pCAMBIA3300，回收載體骨架。8、將步驟6的小片段和步驟7的載體骨架連接，得到重組載體p3300-miR166a(圖3)。重組載體p3300-miR166a為miR166a的表達(dá)載體，重組載體p3300-miR166a含有SEQIDNo.2所示的DNA分子，SEQIDNo.2所示的DNA分子為gma-miR166a的編碼DNA。二、轉(zhuǎn)gma-miR166a擬南芥植株的獲得及耐鹽性鑒定擬南芥轉(zhuǎn)化采用蘸花法，具體過程如下：1、轉(zhuǎn)化菌液的準(zhǔn)備：將步驟一的重組載體p3300-miR166a導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株C58C1得到重組菌p3300-miR166a/C58C1。從28℃培養(yǎng)的平板上挑取重組菌p3300-miR166a/C58C1單菌 落于10mLLB液體培養(yǎng)基中，在28℃、200rpm條件下?lián)u菌過夜，得到種子液。取2mL種子液接種于200mLLB液體培養(yǎng)基中，在28℃、200rpm條件下培養(yǎng)至OD600的值為0.6-0.8，在4℃、4000rpm條件下離心10min，收集菌體。用轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基重懸菌體，在4℃、4000rpm條件下離心10min，收集菌體，再用轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基重懸菌體，得到轉(zhuǎn)化菌液。2、轉(zhuǎn)化擬南芥：將擬南芥(ArabidopsisthalianaColumbia)花盆倒扣于裝有100mL步驟1獲得的轉(zhuǎn)化菌液中，將擬南芥的花序浸沒在轉(zhuǎn)化菌液中，浸染30S-3min。將浸染過的擬南芥植株用塑料袋罩住，三天后再浸染一次，待種子成熟后，收獲種子，命名為T0代轉(zhuǎn)基因種子。3、抗性篩選：將步驟2收獲的T0代轉(zhuǎn)基因種子分裝于1.5mL的離心管中；每管種子加1mL的70％(體積比)酒精水溶液，浸泡5-10min；然后離心棄上清，再用1mL的無水乙醇浸泡5-10min；再次離心棄上清，將種子置于無菌風(fēng)下吹干。將處理后的T0代轉(zhuǎn)基因種子播種于含有草銨膦(Phosphinothricin，PPT；濃度為25mg/mL)的MS篩選培養(yǎng)基上，置于4℃放置3d，然后將T0代轉(zhuǎn)基因種子移入培養(yǎng)室培養(yǎng)。待種子萌發(fā)后，能夠繼續(xù)生長并且保持綠色的即為初步篩選的轉(zhuǎn)基因陽性苗，非轉(zhuǎn)基因陽性苗則黃化死去；待在篩選培養(yǎng)基篩選出來的苗長出兩片真葉時(shí)，移栽到土壤進(jìn)一步生長，收獲T1代轉(zhuǎn)基因種子。4、耐鹽性鑒定：分別取適量干燥的T1代轉(zhuǎn)基因種子和野生型擬南芥種子于1.5mL離心管中，加入1mL70％(體積比)酒精水溶液消毒5-10min后，然后離心棄上清，無菌風(fēng)下吹干，分別獲得消毒后的T1代轉(zhuǎn)基因種子和野生型擬南芥種子。將消毒的T1代轉(zhuǎn)基因種子和野生型擬南芥種子均勻播在MS固體培養(yǎng)基上，用封口膜密封，4℃放置3天后，分別移入培養(yǎng)室中培養(yǎng)(培養(yǎng)條件：溫度為23℃，光照條件為12h光照和8h黑暗，相對濕度為60％)。培養(yǎng)室中培養(yǎng)7天后，挑選大小一致的幼苗分別轉(zhuǎn)移至含有濃度為150mM和200mMNaCl的MS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行鹽脅迫處理培養(yǎng)，將T1代轉(zhuǎn)基因種子經(jīng)上述處理分別命名為150mM鹽脅迫處理轉(zhuǎn)基因組(簡稱為轉(zhuǎn)基因組1)和200mM鹽脅迫處理轉(zhuǎn)基因組(簡稱為轉(zhuǎn)基因組2)；將野生型擬南芥種子經(jīng)上述處理分別命名為150mM鹽脅迫處理野生型組(簡稱為野生型組1)、200mM鹽脅迫處理野生型組(簡稱為野生型組2)；每個(gè)處理組三個(gè)重復(fù)。鹽脅迫處理培養(yǎng)的第7天測量各處理組的擬南芥主根長度及擬南芥植株的存活率。采用miRNA定量PCR檢測上述各鹽脅迫處理組植株培養(yǎng)7天后的gma-miR166a和AtPHB基因的表達(dá)情況(GmPHB擬南芥的同源基因AtPHB)。存活率＝(存活的植株數(shù)/植株總數(shù))×100％。上述鹽脅迫處理培養(yǎng)的第7天測量各處理組的擬南芥主根長度及擬南芥植株的存 活率的結(jié)果見表2，經(jīng)鹽脅迫處理的轉(zhuǎn)基因組的擬南芥的主根長度及存活率均高于相應(yīng)鹽脅迫處理組的野生型擬南芥的主根長度及存活率。在150mM鹽脅迫處理下，轉(zhuǎn)基因組1擬南芥的存活率為93％，是野生型組1擬南芥的存活率77％的1.21倍；在200mM鹽脅迫處理下，轉(zhuǎn)基因組2擬南芥的存活率為83％，是野生型組1擬南芥的存活率76％的1.09倍。鹽脅迫條件下轉(zhuǎn)基因組擬南芥中g(shù)ma-miR166a表達(dá)量上調(diào)的時(shí)候，AtPHB基因的表達(dá)就相應(yīng)下調(diào)，gma-miR166a對AtPHB基因表達(dá)起負(fù)調(diào)控作用。上述結(jié)果表明，gma-miR166a表達(dá)量提高能夠降低其靶基因AtPHB基因的表達(dá)量，提高擬南芥的抗鹽性。表2、各處理組的擬南芥主根長度及其存活率組別主根長度(cm)存活率(％)轉(zhuǎn)基因組11.293轉(zhuǎn)基因組21.083野生型組10.977野生型組20.976表3、各處理組的擬南芥中g(shù)ma-miR166a與AtPHB基因的相對表達(dá)量組別gma-miR166aAtPHB的相對表達(dá)量)轉(zhuǎn)基因組11.8130.583轉(zhuǎn)基因組26.9950.120野生型組11.0001.000野生型組21.0001.000當(dāng)前第1頁1 2 3