本發(fā)明屬于干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別一種通過體外培養(yǎng)處理提高脂肪MSC抗肝臟纖維化能力的方法。

發(fā)明背景

肝纖維化是所有慢病肝損傷的最終歸途，也是影響人類健康的全球性問題。生活中的許多化合物或者病毒感染均可能引起的肝損傷常并導(dǎo)致肝纖維化，最終可能導(dǎo)致肝功能損傷甚至肝衰。肝移植是有效治療肝衰的方法，然而由于器官短缺、移植后的疾病復(fù)發(fā)以及伴隨肝移植的并發(fā)癥等，使得這一治療方法難以滿足臨床需要，且往往費(fèi)用驚人。

研究表明，MSC移植能夠有效減緩肝纖維化的進(jìn)展，改善肝臟功能。脂肪組織作為MSC的來源，具有來源豐富、獲取容易、創(chuàng)傷小等優(yōu)勢，較骨髓MSC具有更好的臨床優(yōu)勢。以往的研究已證實，通過經(jīng)脈移植MSC能夠有效抑制肝纖維化的進(jìn)展，且發(fā)現(xiàn)旁分泌效應(yīng)是MSC發(fā)揮作用的主要途徑之一。然而，正常情況下的MSC旁分泌能力相對有限，加之MSC移植后的大量死亡，導(dǎo)致治療效果并不理想。如何提高M(jìn)SC的抗纖維化能力，使肝臟再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域廣泛關(guān)注熱點(diǎn)問題。

為提高M(jìn)SC的治療潛能，研究人員發(fā)展了不同的方法，如通過與支架材料共移植，通過基因轉(zhuǎn)染對MSC進(jìn)行修飾等。然而，這些引入外源支架或基因的方法雖然對MSC治療潛能具有一定的改善作用，但同時增加了MSC移植后的風(fēng)險問題。發(fā)展一種不依賴于外來支架材料或基因的方法，以提高脂肪MSC抗肝臟纖維化的能力，在干細(xì)胞與肝臟再生醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域具有意義與應(yīng)用價值。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種不依賴于外來支架材料與基因的方法，提高M(jìn)SC抗肝臟纖維化的能力，用于干細(xì)胞與肝臟再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

一種提高脂肪MSC抗肝臟纖維化能力的方法，包括以下步驟；

(1)將脂肪MSC配制成細(xì)胞懸液，滴加于組織培養(yǎng)皿的內(nèi)側(cè)蓋上；

(2)將皿蓋正常放置于培養(yǎng)皿上，使液滴倒置形成懸滴；

(3)培養(yǎng)皿中加入PBS或培養(yǎng)液，放置于37攝氏度，5％CO₂孵箱培養(yǎng)；

(4)收集懸滴中的球狀細(xì)胞體，使用0.05％胰酶/EDTA消化液分散獲取單細(xì)胞；

步驟(1)中所述的脂肪MSC，細(xì)胞來源可以是人、大鼠、小鼠等物種，細(xì)胞來源不是關(guān)鍵因素；

步驟(2)中所述細(xì)胞懸滴培養(yǎng)方法，其特征在于每滴含有MSC為2.5-5×10⁴細(xì)胞，細(xì)胞密度是影響本發(fā)明的關(guān)鍵因素；

步驟(3)中所述的懸滴培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為2-4天。

本發(fā)明的有益效果是，通過移植前3D培養(yǎng)處理，脂肪MSC的旁分泌功能被活化，抗纖維化相關(guān)細(xì)胞因子分泌水平將顯著提高，從而獲得增強(qiáng)的抗肝臟纖維化能力。相對于現(xiàn)有的方法而言，本發(fā)明僅僅通過簡單的改變細(xì)胞培養(yǎng)方式來實現(xiàn)，不涉及外源支架材料、基因修飾以及任何可能有毒副作用的試劑，操作簡單且安全性好。

附圖說明

圖13D培養(yǎng)脂肪MSC形成的球狀體細(xì)胞(Bar＝100μm)；

圖23D培養(yǎng)MSC與常規(guī)培養(yǎng)MSC抗纖維化相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平比較；其中，圖2左為PCR產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果，圖右為目的基因標(biāo)準(zhǔn)化對相應(yīng)內(nèi)參表達(dá)的相對水平。

圖3小鼠肝臟纖維化模型中，組織學(xué)染色比較3D培養(yǎng)MSC與常規(guī)2D培養(yǎng)MSC抗臟纖維化能力。其中，正常的小鼠以及接受PBS注射的小鼠作為對照，上圖為H&E染色，下圖為Sirius red染色；

圖4小鼠肝臟纖維化模型中，通過Western Blotting檢測比較3D培養(yǎng)MSC與常規(guī)2D培養(yǎng)MSC抗臟纖維化能力。其中，正常的小鼠以及接受PBS注射的 小鼠作為對照($$表示與正常組相比P＜0.01；**表示與PBS注射組相比P＜0.01：##表示與2D培養(yǎng)MSC相比P＜0.01)。

具體實施方式

下面通過以下實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述，以便本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不對本發(fā)明構(gòu)成任何限制。

實施例1：人脂肪MSC的3D培養(yǎng)

(1)人脂肪MSC的分離與培養(yǎng)

脂肪組織來自于臨床抽脂術(shù)。經(jīng)PBS充分洗滌去除血污，隨后使用0.1％collagen IV+0.1％胰酶消化30min，以等體積的含血清培養(yǎng)基終止消化后，使用80μm孔徑的濾網(wǎng)過率去除組織碎片，1500轉(zhuǎn)/分離心10分鐘收集細(xì)胞，接種于組織培養(yǎng)皿中，以含血清(Gibco)10％的α-MEM培養(yǎng)基(Gibco)進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞長至?xí)虾?，胰酶消化收集?xì)胞，以1∶3進(jìn)行傳代。

(2)MSC的3D懸滴培養(yǎng)

生長狀態(tài)良好、培養(yǎng)至第三代的MSC，胰酶消化收集細(xì)胞。使用新鮮培養(yǎng)基將細(xì)胞配制成7.5x10⁵/毫升的細(xì)胞懸液，隨后以35uL制備成一個懸滴，滴于組織培養(yǎng)皿蓋的內(nèi)側(cè)面，其中含約25k細(xì)胞，將皿蓋正常蓋于組織培養(yǎng)皿上，使液滴倒置形成懸滴，皿中添加PBS防止液體揮發(fā)，放于37攝氏度5％CO2孵箱培養(yǎng)3天。如圖1所示，為懸滴培養(yǎng)三天形成的脂肪MSC球狀體細(xì)胞。

(3)3D培養(yǎng)MSC的分散與抗纖維化相關(guān)因子水平檢測

為獲得來源的細(xì)胞，使用0.05％胰酶/EDTA消化液消化球狀體5-10min，同時使用移液槍不斷吹打。隨后以等體積的含血清培養(yǎng)基終止消化，離心收集細(xì)胞。使用天根RNAprep pure Cell/Bacteria Kit(TianGen)試劑盒，按照廠商說明書進(jìn)行操作提取細(xì)胞總mRNA，隨后使用標(biāo)準(zhǔn)的反轉(zhuǎn)錄程序進(jìn)行cDNA合成，相關(guān)試劑購自(TianGen)，通過基因特異性的引物分別檢測IL-6，IGF-1，HGF以及內(nèi)參GAPDH基因表達(dá)水平，PCR產(chǎn)物使用2％的瓊脂糖進(jìn)行電泳檢測，信號強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)化為相對應(yīng)的內(nèi)參信號強(qiáng)度，SPSS17.0軟件用于所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。如圖2所示，為2D常規(guī)培養(yǎng)的MSC與3D球狀體培養(yǎng)MSC抗纖維化相關(guān)細(xì)胞 因子基因必到水平。其中，圖2左為PCR產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果，圖右為目的基因標(biāo)準(zhǔn)化對相應(yīng)內(nèi)參表達(dá)的相對水平。

實施例2：3D培養(yǎng)MSC在小鼠模型中的抗纖維化能力檢測

(1)小鼠肝臟纖維化模型制備

成年雌性C57BL/6小鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。將CCL4(Merck，Germany)與橄欖油以1∶1混合用于小鼠注射，以1mL/千克體重進(jìn)行腹腔注射誘導(dǎo)肝纖維化，隔天注射一次，連續(xù)注射4周，建立小鼠肝臟纖維化模型。

(2)3D球狀體MSC的獲取與移植

為獲得來源的細(xì)胞，使用0.05％胰酶/EDTA消化液消化球狀體5-10min，同時使用移液槍不斷吹打。隨后以等體積的含血清培養(yǎng)基終止消化，離心收集細(xì)胞。將1×10⁶二維培養(yǎng)的MSC以及3D球狀體來源的MSC重懸于0.5mLPBS中，通過尾靜脈注射移植。

(3)組織學(xué)檢測肝臟纖維化水平

移植后4周，處死動物，4％多聚甲醛固定肝組織，制備石蠟標(biāo)本。制備4um的石蠟切片，使用常規(guī)的方法進(jìn)行H&E染色和Sirius red染色，用于評價肝纖維化水平。如圖3所示，分比為正常小鼠、PBS注射的肝纖維化小鼠、2D培養(yǎng)的MSC移植的肝纖維化小鼠以及3D培養(yǎng)的MSC移植的肝纖維化小鼠，肝臟纖維化水平的組織學(xué)染色比較，其中上圖為H&E染色結(jié)果，下圖為Sirius red染色結(jié)果。

(4)Western Blotting檢測肝臟纖維化水平

移植后4周，處死動物取部分肝臟組織，以組織裂解液(Bio-Rad)進(jìn)行裂解。使用手持式組織勻漿儀充分破碎組織，以12000轉(zhuǎn)/分速度、4攝氏度離心去除沉淀，收集上清，并通過BCA^TM蛋白分析試劑盒對蛋白進(jìn)行定量。隨后通過15％的SDS聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，上樣蛋白量80μg，電泳后將蛋白電轉(zhuǎn)到PVDF膜(Roche)上。5％脫脂牛奶封閉2小時，隨后與一抗4在攝氏度孵育過夜(抗體購自Cell signaling Technology)，洗去未結(jié)合的一抗后，以HRP-標(biāo)記的相應(yīng)二抗室溫孵育2小時。通過化學(xué)發(fā)光試劑對蛋白條帶進(jìn)行檢測。蛋白條帶表達(dá)強(qiáng)度表示標(biāo)準(zhǔn)化為內(nèi)參GAPDH的百分比，SPSS17.0軟件用于所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。 如圖4所示，分比為正常小鼠、PBS注射的肝纖維化小鼠、2D培養(yǎng)的MSC移植的肝纖維化小鼠以及3D培養(yǎng)的MSC移植的肝纖維化小鼠，Western Blotting檢測肝臟組織中I型膠原與III型膠原的積累情況，其中膠原的積累水平反映了纖維化的程度。