本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料領(lǐng)域，具體涉及一種具有定向引導(dǎo)功能的雙層多孔神經(jīng)導(dǎo)管及其制備方法。

背景技術(shù)：

近年來，世界每年約超過100萬人會遭遇周圍神經(jīng)損傷，由于周圍神經(jīng)損傷后病理過程復(fù)雜，神經(jīng)再生速度緩慢等多種因素，損傷神經(jīng)的功能恢復(fù)受到制約。目前臨床上主要通過斷端吻合和神經(jīng)移植法來治療周圍神經(jīng)損傷，斷端吻合法難以實(shí)現(xiàn)神經(jīng)束的準(zhǔn)確吻合，影響神經(jīng)纖維的再生速度，縫合線的存在又會造成進(jìn)一步的損傷和神經(jīng)瘤的形成，而金標(biāo)準(zhǔn)—自體神經(jīng)移植卻又存在來源受限，供體神經(jīng)支配區(qū)永久性喪失、結(jié)締組織增生等不可克服的缺陷。

針對上述外周神經(jīng)損傷修復(fù)手段存在的各種缺陷，以及長期以來，臨床對粗大、長段神經(jīng)缺損和多發(fā)性神經(jīng)損傷無計(jì)可施的局面，組織工程神經(jīng)導(dǎo)管應(yīng)運(yùn)而生。研究采用組織工程學(xué)的方法和理論，利用外周神經(jīng)再生的生物機(jī)制，結(jié)合材料學(xué)、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等學(xué)科知識，制備具有良好生物相容性的生物材料來構(gòu)建修復(fù)周圍神經(jīng)損傷的神經(jīng)導(dǎo)管已是神經(jīng)修復(fù)領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。嚴(yán)瓊嬌等制備并評估了一種prgd/pdlla/β-tcp/ngf復(fù)合神經(jīng)導(dǎo)管，該復(fù)合神經(jīng)導(dǎo)管中rgd成分提高了復(fù)合材料對神經(jīng)細(xì)胞的粘附和增殖，β-tcp和ngf促進(jìn)了神經(jīng)生長并改善神經(jīng)再生的“微環(huán)境”，橋接大鼠坐骨神經(jīng)10mm缺損的實(shí)驗(yàn)表明，該復(fù)合神經(jīng)導(dǎo)管有良好的組織相容性，能夠有效促進(jìn)周圍神經(jīng)再生，效果接近自體神經(jīng)移植(嚴(yán)瓊姣.prgd/pdlla/β-tcp/ngf復(fù)合神經(jīng)導(dǎo)管的制備及其在周圍神經(jīng)修復(fù)中的應(yīng)用[d].武漢理工大學(xué),2008.)。

目前盡管有部分可生物降解類神經(jīng)導(dǎo)管已投入市場，但依然存在材料細(xì)胞親和性不佳，韌性較差，難有良好的導(dǎo)管構(gòu)型來引導(dǎo)神經(jīng)再生修復(fù)長段缺損等問題。理想的神經(jīng)導(dǎo)管，一方面應(yīng)該兼?zhèn)淞己玫牧W(xué)性能，良好的細(xì)胞親和性，可線性調(diào)控的降解性，使損傷的周圍神經(jīng)在一個(gè)適宜的“微環(huán)境”中自我修復(fù)和再生，另一方面可以防止纖維瘢痕組織的侵入，抑制神經(jīng)瘤形成，又可定向引導(dǎo)軸突準(zhǔn)確對接，從而達(dá)到修復(fù)長段和大范圍的周圍神經(jīng)損傷的效果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種具有定向引導(dǎo)功能的雙層多孔神經(jīng)導(dǎo)管及其制備方法。所述雙層多孔神經(jīng)導(dǎo)管具有較好的力學(xué)性能和良好的細(xì)胞親和性，能促進(jìn)神經(jīng)生長并改善神經(jīng)再生的“微環(huán)境”，通過雙層多孔和凹槽結(jié)構(gòu)保證營養(yǎng)物質(zhì)傳輸?shù)耐瑫r(shí)，能定向引導(dǎo)神經(jīng)再生，大幅提高周圍神經(jīng)損傷的修復(fù)效果，并可用于外周神經(jīng)損傷修復(fù)和取代自體神經(jīng)移植等領(lǐng)域。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種具有定向引導(dǎo)功能的雙層多孔神經(jīng)導(dǎo)管，其特征在于：所述雙層多孔神經(jīng)導(dǎo)管包括由可降解聚酯制備的外層薄膜和由rgd接枝改性的天然生物高分子并摻雜鈣磷納米粒子制備的內(nèi)層電紡納米纖維膜；所述外層薄膜具有多孔結(jié)構(gòu)，其孔徑大小為10μm～50μm；所述外層薄膜的內(nèi)壁具有縱向凹槽結(jié)構(gòu)，所述內(nèi)層電紡納米纖維膜是在所述外層薄膜的內(nèi)壁上通過電紡形成的。所述具有定向引導(dǎo)功能的雙層多孔神經(jīng)導(dǎo)管的模擬結(jié)構(gòu)圖如圖1所示。

本發(fā)明還提供上述具有定向引導(dǎo)功能的雙層多孔神經(jīng)導(dǎo)管的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)導(dǎo)管外層薄膜的制備：將可降解聚酯高分子完全溶解于有機(jī)溶劑中，再加入致孔劑顆粒，超聲分散倒入模具中，自然風(fēng)干成型，然后置于去離子水中除去致孔劑，并真空干燥除去有機(jī)溶劑即得外層薄膜；

2)導(dǎo)管內(nèi)層的制備：將接枝rgd的天然生物高分子溶解于溶劑中，并加入鈣磷納米粒子和促紡劑配置成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2％～5％的紡絲溶液，將步驟1)制得的外層薄膜固定在靜電紡絲裝置的接收板上，然后在一定的紡絲參數(shù)下，電紡形成導(dǎo)管內(nèi)層，得雙層薄膜；

3)導(dǎo)管的成型：通過不同內(nèi)徑的芯棒，將步驟2)制得的雙層薄膜卷制成管，再用有機(jī)溶劑溶解封口，即得所述的具有定向引導(dǎo)功能的雙層多孔神經(jīng)導(dǎo)管。

按上述方案，優(yōu)選地，步驟1)中所述可降解聚酯高分子為聚己內(nèi)酯(pcl)、聚乳酸(pdlla)、聚羥基乙酸(pga)、聚乳酸-羥基乙酸共聚物(plga)、聚己內(nèi)酯-乙二醇嵌段共聚物(pcl-mpeg)、聚乳酸-乙二醇嵌段共聚物(pdlla-mpeg)、聚乙丙交酯-乙二醇嵌段共聚物(plga-mpeg、plga-peg-plga)中的一種或兩種以上的混合物。

按上述方案，優(yōu)選地，步驟1)中所述有機(jī)溶劑為冰醋酸、二氯甲烷、二甲亞砜、乙酸乙酯、丙酮中的一種或兩種以上的混合溶劑。

按上述方案，優(yōu)選地，步驟1)中所述模具的材質(zhì)為聚四氟乙烯；所述模具呈凹槽狀，凹槽的凸面形狀為長方形、三角形或半圓柱形中任一種或幾種，凹槽深度為0.5mm，寬度為1mm～5mm。所述聚四氟乙烯凹槽模具的3d效果圖見圖2，示意圖的豎剖面圖和俯視圖分別見圖3和圖4。

按上述方案，優(yōu)選地，步驟1)中所述致孔劑為氯化鈉、蔗糖、果糖中的一種或兩種以上的混合物，所述致孔劑顆粒的粒徑大小為10μm～50μm。

按上述方案，優(yōu)選地，步驟2)中所述接枝rgd的天然生物高分子由下述方法制備而成：

將rgd多肽溶解于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的醋酸鈉-醋酸的緩沖溶液中，加入縮合活化劑，在4℃下活化12h，然后往溶液體系中緩慢滴加天然生物高分子溶液，在0℃～10℃下反應(yīng)6h～24h，最后將反應(yīng)完全的溶液透析3天，冷凍干燥即得接枝rgd的天然生物高分子。更優(yōu)選地，所述rgd多肽為包含rgd序列的生物短肽，如grgdy(甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-酪氨酸)、c-rgdyk(環(huán)-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-酪氨酸-賴氨酸)、grgdspc(甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-絲氨酸酸-脯氨酸-半胱氨酸)等。更優(yōu)選地，所述縮合活化劑為1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(edc)/n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)。更優(yōu)選地，所述edc、nhs與所述rgd多肽的摩爾比為20:20:1。更優(yōu)選地，所述天然生物高分子為殼聚糖、膠原、明膠、絲素蛋白中的一種或兩種以上的混合。更優(yōu)選地，所述rgd多肽與所述天然生物高分子的質(zhì)量比為1：2～20。

按上述方案，優(yōu)選地，步驟2)中所述溶劑為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70％～90％的醋酸水溶液或三氟乙酸。

按上述方案，優(yōu)選地，步驟2)中所述鈣磷納米粒子為納米羥基磷灰石(ha)、β-磷酸三鈣(β-tcp)、磷灰石、磷酸氫鈣、磷酸二氫鈣、磷酸八鈣、焦磷酸鈣、磷酸四鈣中的一種或兩種以上混合納米粒子。

按上述方案，優(yōu)選地，步驟2)中所述促紡劑為聚乙烯醇(pva)、聚氧化乙烯(peo)中的一種或兩種的混合。

按上述方案，優(yōu)選地，步驟2)中所述接枝rgd的天然生物高分子和促紡劑質(zhì)量比為1：0.1～2；所述鈣磷納米粒子的質(zhì)量為所述接枝rgd的天然生物高分子和促紡劑質(zhì)量之和的5％。

按上述方案，優(yōu)選地，步驟2)中所述紡絲參數(shù)為：紡絲電壓：12kv～20kv，接收距離：10cm～15cm，推速：0.01mm/min～0.1mm/min。

按上述方案，優(yōu)選地，步驟3)中所述有機(jī)溶劑與步驟1)中所述有機(jī)溶劑相同。

本發(fā)明的有益效果為：

1)本發(fā)明將溶劑流延/粒子瀝濾法與靜電紡絲技術(shù)相結(jié)合，既保證了神經(jīng)導(dǎo)管的力學(xué)性能，又使其具有良好的細(xì)胞親和性。

2)本發(fā)明提供的雙層多孔神經(jīng)導(dǎo)管，內(nèi)層為rgd接枝改性的天然生物高分子并摻雜鈣磷納米粒子的電訪納米纖維膜，利于神經(jīng)細(xì)胞的粘附、增殖、生長，具有良好的生物相容性，鈣磷納米粒子中鈣、磷離子的釋放能促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長并改善神經(jīng)再生的“微環(huán)境”，其縱向凹槽結(jié)構(gòu)能夠定向引導(dǎo)神經(jīng)再生，達(dá)到修復(fù)外周神經(jīng)長段缺損的效果。

3)本發(fā)明提供的雙層多孔神經(jīng)導(dǎo)管，外層具有可控孔徑的多孔結(jié)構(gòu)，既能有效防止纖維瘢痕組織的侵入，抑制神經(jīng)瘤形成，又能保證營養(yǎng)物質(zhì)的傳輸。

4)本發(fā)明提供的雙層多孔神經(jīng)導(dǎo)管，可大幅提高周圍神經(jīng)損傷的修復(fù)效果并有望取代自體神經(jīng)移植，可用于外周神經(jīng)損傷修復(fù)等領(lǐng)域。

附圖說明

圖1為具有定向引導(dǎo)功能的雙層多孔神經(jīng)導(dǎo)管的模擬結(jié)構(gòu)圖。

圖2為聚四氟乙烯凹槽模具3d效果圖。

圖3為聚四氟乙烯凹槽模具示意圖的豎剖面圖。

圖4為聚四氟乙烯凹槽模具示意圖的俯視圖。

圖5為實(shí)施例1、2、3制備所得的神經(jīng)導(dǎo)管與對照組mtt的細(xì)胞相容性評價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖6為實(shí)施例2中內(nèi)層電紡纖維膜的sem圖，左圖放大倍率為10kх，右圖為20kх。

圖7為實(shí)施例3中內(nèi)層電紡纖維膜的sem圖，左圖放大倍率為10kх，右圖為20kх。

圖8為實(shí)施例3和實(shí)施例4中殼聚糖和接枝不同多肽rgd改性殼聚糖的紅外圖譜。

具體實(shí)施方式

為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明不僅僅局限于下面的實(shí)施例。以下實(shí)施例如無具體說明，采用的試劑均為市售化學(xué)試劑或工業(yè)產(chǎn)品。

以下各實(shí)施例中所用的聚四氟乙烯凹槽模具的凹槽凸面形狀均為長方形，凹槽寬度為1mm，凹槽深度為0.5mm，由深圳宜美五金塑料制品廠按照上述形狀、尺寸和圖2-4所示的3d效果圖和示意圖加工制備而成。

以下各實(shí)施例中所用的納米β-磷酸三鈣(β-tcp)由申請人所在實(shí)驗(yàn)室參照“戴紅蓮,吳艷增,曲坤楠,康海飛.一種納米β-磷酸三鈣的制備方法[p].湖北：cn105883742a,2016-08-24.，”中實(shí)施例1所述的方法制備而成。

實(shí)施例1

一種具有定向引導(dǎo)功能的雙層多孔神經(jīng)導(dǎo)管，其制備方法包括以下步驟：

1)制備外層薄膜：將1g聚乳酸-羥基乙酸共聚物(plga)溶于15ml的二氯甲烷中，完全溶解后加入6g粒徑為10μm的氯化鈉顆粒，超聲分散完全后倒入聚四氟乙烯凹槽模具中，自然風(fēng)干5天成型，然后置于去離子水中浸泡2天除去氯化鈉，并真空干燥2天除去有機(jī)溶劑即得外層薄膜。

2)制備接枝rgd的殼聚糖(cs-rgd)：將0.1g(0.176mmol)生物多肽grgdy溶解于20ml醋酸鈉-醋酸的緩沖溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)1％)中，加入縮合活化劑0.677g(3.530mmol)1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(edc)和0.406g(3.530mmol)n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)，在4℃下活化12h；量取0.2g殼聚糖溶于20ml醋酸溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)1％)，待其完全溶解后滴加至上述反應(yīng)體系中，在0℃下反應(yīng)6h，最后將反應(yīng)完全的溶液透析3天，冷凍干燥即得接枝rgd的殼聚糖(cs-grgdy)。

3)稱量0.1g步驟2)中制得的cs-rggdy溶于15ml的70％的醋酸溶液中，完全溶解后加入0.2g聚乙烯醇，混合均勻再加入0.015g納米β-磷酸三鈣(β-tcp，實(shí)驗(yàn)室自制)，超聲分散后即得2％(溶質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù))的紡絲溶液。

4)以步驟1)制得的外層薄膜為接收裝置，將上述紡絲溶液在工藝參數(shù)：紡絲電壓：12kv，接收距離：10cm，推速：0.01mm/min的條件下進(jìn)行靜電紡絲，即得雙層薄膜。

5)導(dǎo)管的成型：最后通過芯棒，將雙層薄膜卷制成管，再用有機(jī)溶劑二氯甲烷溶解封口，即得所述具有定向引導(dǎo)功能的雙層多孔神經(jīng)導(dǎo)管。

對本實(shí)施例制備的具有定向引導(dǎo)功能的雙層多孔神經(jīng)導(dǎo)管進(jìn)行下述性能測試：

1、力學(xué)性能測試(按照國標(biāo)gbt1040-2006中薄膜樣品拉伸測試標(biāo)準(zhǔn))

具體步驟如下：將所述神經(jīng)導(dǎo)管的外層薄膜樣品制成標(biāo)準(zhǔn)試樣，然后采用美特斯e44.104型萬能試驗(yàn)機(jī)對標(biāo)準(zhǔn)試樣進(jìn)行拉伸力學(xué)測試，測定不同復(fù)合膜的斷裂拉伸強(qiáng)度和斷裂伸長率。測試條件為：拉伸速度為100mm/min，試驗(yàn)厚度0.5mm，標(biāo)距5cm，每個(gè)不同薄膜試樣測量5次，取其平均值。

經(jīng)測定，本實(shí)施例制得的具有定向引導(dǎo)功能的雙層多孔神經(jīng)導(dǎo)管的外層薄膜的拉伸強(qiáng)度和斷裂伸長率分別為9.876mpa、293.43％，具有良好的力學(xué)強(qiáng)度和韌性。

2、靜態(tài)水接觸角測試

具體步驟如下：分別將所述神經(jīng)導(dǎo)管的外層薄膜樣品和內(nèi)層電紡纖維膜樣品裁剪成載玻片大小，然后使用雙面膠平整地固定在載玻片表面，再采用faceca-xp150型水接觸角測定儀，通過液滴法測試復(fù)合膜的靜態(tài)水接觸角，每個(gè)復(fù)合膜樣品在膜的不同位置測量5次，取5次的平均值作為復(fù)合膜的接觸角。

經(jīng)測定，本實(shí)施例制得的具有定向引導(dǎo)功能的雙層多孔神經(jīng)導(dǎo)管的外層薄膜的水接觸角為75.65°，內(nèi)層電紡纖維膜的水接觸角為60.70°，顯示其具有較好的親水性。

3、細(xì)胞相容性評價(jià)

具體步驟如下：將所述神經(jīng)導(dǎo)管浸提液與雪旺細(xì)胞(rsc96)共培養(yǎng)，并以dmem培養(yǎng)液作為對照組，將實(shí)驗(yàn)組和對照組置于37℃，5％co2細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育1、3、5天后通過mtt實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，該實(shí)施例組與對照組od值無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，本實(shí)施例神經(jīng)導(dǎo)管材料具有良好細(xì)胞相容性。

實(shí)施例2

一種具有定向引導(dǎo)功能的雙層多孔神經(jīng)導(dǎo)管，其制備方法包括以下步驟：

1)制備外層薄膜：將1g聚乳酸-羥基乙酸共聚物(plga)溶于15ml的二氯甲烷中，完全溶解后加入6g粒徑為50μm的氯化鈉顆粒，超聲分散完全后倒入聚四氟乙烯凹槽模具中，自然風(fēng)干5天成型，然后置于去離子水中浸泡2天除去氯化鈉，并真空干燥2天除去有機(jī)溶劑即得外層薄膜。

2)制備接枝rgd的殼聚糖(cs-rgd)：將0.1g(0.176mmol)生物多肽grgdy溶解于20ml醋酸鈉-醋酸的緩沖溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)1％)中，加入縮合活化劑0.677g(3.530mmol)1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(edc)和0.406g(3.530mmol)n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)，在4℃下活化12h；量取0.2g殼聚糖溶于20ml醋酸溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)1％)，待其完全溶解后滴加至上述反應(yīng)體系中，在10℃下反應(yīng)24h，最后將反應(yīng)完全的溶液透析3天，冷凍干燥即得接枝rgd的殼聚糖(cs-grgdy)。

3)稱量0.1g步驟2)中制得的cs-grgdy溶于10ml的80％的醋酸溶液中，完全溶解后加入0.1g聚乙烯醇，混合均勻再加入0.01g納米β-磷酸三鈣(β-tcp，實(shí)驗(yàn)室自制)，超聲分散后即得2％(溶質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù))的紡絲溶液。

4)以步驟1)制得的外層薄膜為接收裝置，將上述紡絲溶液在工藝參數(shù)：紡絲電壓：20kv，接收距離：15cm，推速：0.05mm/min的條件下進(jìn)行靜電紡絲，即得雙層薄膜。

5)導(dǎo)管的成型：最后通過芯棒，將雙層薄膜卷制成管，再用有機(jī)溶劑二氯甲烷溶解封口，即得所述具有定向引導(dǎo)功能的雙層多孔神經(jīng)導(dǎo)管。

經(jīng)測定，本實(shí)施例制得的具有定向引導(dǎo)功能的雙層多孔神經(jīng)導(dǎo)管的外層薄膜的拉伸強(qiáng)度和斷裂伸長率分別為7.157mpa、278.34％，具有良好的力學(xué)強(qiáng)度和韌性。所述神經(jīng)導(dǎo)管的外層薄膜水接觸角為60.4°，顯示其具有較好的親水性；其內(nèi)層電紡纖維膜的水接觸角為50.42°，顯示其具有良好的親水性。

通過掃描電鏡(sem)在不同倍率下觀察本實(shí)施例制得的具有定向引導(dǎo)功能的雙層多孔神經(jīng)導(dǎo)管的內(nèi)層電紡纖維膜：將所述電紡纖維膜表面進(jìn)行噴金處理，然后用tescan生產(chǎn)的vega3lm型掃描電鏡(sem)在不同倍率下觀察電紡纖維膜的表面形貌，結(jié)果如圖6所示，顯示其具有良好的纖維形貌，纖維直徑為70nm～200nm。

對本實(shí)施例制得的具有定向引導(dǎo)功能的雙層多孔神經(jīng)導(dǎo)管進(jìn)行細(xì)胞相容性評價(jià)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，該實(shí)施例組與對照組od值無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，本實(shí)施例神經(jīng)導(dǎo)管材料具有良好細(xì)胞相容性。

實(shí)施例3

一種具有定向引導(dǎo)功能的雙層多孔神經(jīng)導(dǎo)管，其制備方法包括以下步驟：

1)制備外層薄膜：將1g聚乙丙交酯-乙二醇嵌段共聚物(plga-mpeg)溶于15ml的二氯甲烷中，完全溶解后加入6g粒徑為30μm的氯化鈉顆粒，超聲分散完全后倒入聚四氟乙烯凹槽模具中，自然風(fēng)干5天成型，然后置于去離子水中浸泡2天除去氯化鈉，并真空干燥2天除去有機(jī)溶劑即得外層薄膜。

2)制備接枝rgd的殼聚糖(cs-rgd)：將0.1g(0.161mmol)生物多肽c-rgdyk溶解于20ml醋酸鈉-醋酸的緩沖溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)1％)中，加入縮合活化劑0.618g(3.227mmol)1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(edc)和0.371g(3.227mmol)n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)，在4℃下活化12h；量取0.2g殼聚糖溶于20ml醋酸溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)1％)，待其完全溶解后滴加至上述反應(yīng)體系中，在0℃下反應(yīng)12h，最后將反應(yīng)完全的溶液透析3天，冷凍干燥即得接枝rgd的殼聚糖(cs-c-rgdyk)。

3)稱量0.1g步驟2)中制得的cs-rgdyk溶于7.5ml的80％的醋酸溶液中，完全溶解后加入0.05g聚氧化乙烯，混合均勻再加入0.0075g納米β-磷酸三鈣(β-tcp，實(shí)驗(yàn)室自制)，超聲分散后即得2％(溶質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù))的紡絲溶液。

4)以步驟1)制得的外層薄膜為接收裝置，將上述紡絲溶液在工藝參數(shù)：紡絲電壓：16kv，接收距離：13cm，推速：0.03mm/min的條件下進(jìn)行靜電紡絲，即得雙層薄膜。

5)導(dǎo)管的成型：最后通過芯棒，將雙層薄膜卷制成管，再用有機(jī)溶劑二氯甲烷溶解封口，即得所述具有定向引導(dǎo)功能的雙層多孔神經(jīng)導(dǎo)管。

對本實(shí)施例所得cs-c-rgdyk進(jìn)行紅外光譜測試：取適量干燥完全的cs-c-rgdyk研磨成粉，與kbr混合均勻后壓片，用brukervertex80v型傅里葉變換紅外光譜儀進(jìn)行測試，結(jié)果如圖8所示(見曲線1#)。將其譜圖與殼聚糖(cs)的紅外譜圖(見圖8中曲線3#)對比發(fā)現(xiàn)，在1561cm^-1處明顯出現(xiàn)新的吸收峰，此為cs-c-rgdyk仲酰胺ⅱ帶的特征吸收峰，表明cs-c-rgdyk成功合成。

經(jīng)測定，本實(shí)施例制得的具有定向引導(dǎo)功能的雙層多孔神經(jīng)導(dǎo)管的外層薄膜的拉伸強(qiáng)度和斷裂伸長率分別為6.405mpa、408.69％，具有良好的力學(xué)強(qiáng)度和韌性。所述神經(jīng)導(dǎo)管的外層薄膜水接觸角為74.8°，顯示其具有較好的親水性；其內(nèi)層電紡纖維膜水接觸角為45.46°顯示其具有優(yōu)良的親水性。

本實(shí)施例制得的具有定向引導(dǎo)功能的雙層多孔神經(jīng)導(dǎo)管的內(nèi)層電紡纖維膜在不同倍率下的sem圖如圖7所示，顯示其具有良好的纖維形貌，纖維直徑為50nm～270nm。

對本實(shí)施例制得的具有定向引導(dǎo)功能的雙層多孔神經(jīng)導(dǎo)管進(jìn)行細(xì)胞相容性評價(jià)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，該實(shí)施例組與對照組od值無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，本實(shí)施例神經(jīng)導(dǎo)管材料具有良好細(xì)胞相容性。

實(shí)施例4

一種具有定向引導(dǎo)功能的雙層多孔神經(jīng)導(dǎo)管，其制備方法包括以下步驟：

1)制備外層薄膜：將1g聚乙丙交酯-乙二醇嵌段共聚物(plga-mpeg)溶于15ml的乙酸乙酯中，完全溶解后加入6g粒徑為30μm的氯化鈉顆粒，超聲分散完全后倒入聚四氟乙烯凹槽模具中，自然風(fēng)干5天成型，然后置于去離子水中浸泡2天除去氯化鈉，并真空干燥2天除去有機(jī)溶劑即得外層薄膜。

2)制備接枝rgd的殼聚糖(cs-rgd)：將0.1g生物多肽grgdy(0.176mmol)溶解于20ml醋酸鈉-醋酸的緩沖溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)1％)中，加入縮合活化劑0.677g(3.530mmol)1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(edc)和0.406g(3.530mmol)n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)，在4℃下活化12h；量取0.2g殼聚糖溶于20ml醋酸溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)1％)，待其完全溶解后滴加至上述反應(yīng)體系中，在5℃下反應(yīng)24h，最后將反應(yīng)完全的溶液透析3天，冷凍干燥即得接枝rgd的殼聚糖(cs-grgdy)。

3)稱量0.1g步驟2)中制得的cs-rggdy溶于5.5ml的90％的醋酸溶液中，完全溶解后加入0.01g聚乙烯醇，混合均勻再加入0.0055g納米β-磷酸三鈣(β-tcp，實(shí)驗(yàn)室自制)，超聲分散后即得2％(溶質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù))的紡絲溶液。

4)以步驟1)制得的外層薄膜為接收裝置，將上述紡絲溶液在工藝參數(shù)：紡絲電壓：16kv，接收距離：13cm，推速：0.03mm/min的條件下進(jìn)行靜電紡絲，即得雙層薄膜。

5)導(dǎo)管的成型：最后通過芯棒，將雙層薄膜卷制成管，再用有機(jī)溶劑乙酸乙酯溶解封口，即得所述具有定向引導(dǎo)功能的雙層多孔神經(jīng)導(dǎo)管。

對本實(shí)施例所得cs-grgdy冷凍干燥后的粉末進(jìn)行紅外光譜測試，結(jié)果如圖8所示。將其譜圖(見曲線2#)與cs的譜圖對比發(fā)現(xiàn)，在1563cm^-1處明顯出現(xiàn)新的吸收峰，此為cs-grgdy仲酰胺ⅱ帶的特征吸收峰，表明cs-grgdy成功合成。

實(shí)施例5

一種具有定向引導(dǎo)功能的雙層多孔神經(jīng)導(dǎo)管，其制備方法包括以下步驟：

1)制備外層薄膜：將1g聚乙丙交酯-乙二醇嵌段共聚物(plga-mpeg)溶于15ml的乙酸乙酯中，完全溶解后加入6g粒徑為10μm的氯化鈉顆粒，超聲分散完全后倒入聚四氟乙烯凹槽模具中，自然風(fēng)干5天成型，然后置于去離子水中浸泡2天除去氯化鈉，并真空干燥2天除去有機(jī)溶劑即得外層薄膜。

2)制備接枝rgd的殼聚糖(cs-rgd)：將0.01g(0.0176mmol)生物多肽grgdy溶解于20ml醋酸鈉-醋酸的緩沖溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)1％)中，加入縮合活化劑0.0677g(0.353mmol)1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(edc)和0.0406g(0.353mmol)n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)，在4℃下活化12h；量取0.2g殼聚糖溶于20ml醋酸溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)1％)，待其完全溶解后滴加至上述反應(yīng)體系中，在5℃下反應(yīng)24h，最后將反應(yīng)完全的溶液透析3天，冷凍干燥即得接枝rgd的殼聚糖(cs-grgdy)。

3)稱量0.1g步驟2)中制得的cs-rggdy溶于5ml三氟乙酸中，完全溶解后加入0.2g聚氧化乙烯，混合均勻再加入0.015g納米β-磷酸三鈣(β-tcp，實(shí)驗(yàn)室自制)，超聲分散后即得4％(溶質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù))的紡絲溶液。

4)以步驟1)制得的外層薄膜為接收裝置，將上述紡絲溶液在工藝參數(shù)：紡絲電壓：16kv，接收距離：13cm，推速：0.1mm/min的條件下進(jìn)行靜電紡絲，即得雙層薄膜。

5)導(dǎo)管的成型：最后通過芯棒，將雙層薄膜卷制成管，再用有機(jī)溶劑乙酸乙酯溶解封口，即得所述具有定向引導(dǎo)功能的雙層多孔神經(jīng)導(dǎo)管。

實(shí)施例6

一種具有定向引導(dǎo)功能的雙層多孔神經(jīng)導(dǎo)管，其制備方法包括以下步驟：

1)制備外層薄膜：將1g聚乙丙交酯-乙二醇嵌段共聚物(plga-mpeg)溶于15ml的二氯甲烷中，完全溶解后加入6g粒徑為20μm的果糖顆粒，超聲分散完全后倒入聚四氟乙烯凹槽模具中，自然風(fēng)干5天成型，然后置于去離子水中浸泡2天除去氯化鈉，并真空干燥2天除去有機(jī)溶劑即得外層薄膜。

2)制備接枝rgd的殼聚糖(cs-rgd)：將0.1g(0.161mmol)生物多肽c-rgdyk溶解于20ml醋酸鈉-醋酸的緩沖溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)1％)中，加入縮合活化劑0.618g(3.227mmol)1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(edc)和0.371g(3.227mmol)n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)，在4℃下活化12h；量取1g殼聚糖溶于100ml醋酸溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)1％)，待其完全溶解后滴加至上述反應(yīng)體系中，在5℃下反應(yīng)24h，最后將反應(yīng)完全的溶液透析3天，冷凍干燥即得接枝rgd的殼聚糖(cs-c-rgdyk)。

3)稱量0.2g步驟2)中制得的cs-c-rgdyk溶于7.5ml的80％的醋酸溶液中，完全溶解后加入0.2g聚氧化乙烯，混合均勻再加入0.02g納米羥基磷灰石(ha)，超聲分散后即得5％(溶質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù))的紡絲溶液。

4)以步驟1)制得的外層薄膜為接收裝置，將上述紡絲溶液在工藝參數(shù)：紡絲電壓：15kv，接收距離：15cm，推速：0.05mm/min的條件下進(jìn)行靜電紡絲，即得雙層薄膜。

5)導(dǎo)管的成型：最后通過芯棒，將雙層薄膜卷制成管，再用有機(jī)溶劑二氯甲烷溶解封口，即得所述具有定向引導(dǎo)功能的雙層多孔神經(jīng)導(dǎo)管。

以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明創(chuàng)造構(gòu)思的前提下，做出若干改進(jìn)和變換，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。