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可溶性i型鴨肝炎病毒3d蛋白在制備elisa試劑中的應用及其elisa試劑盒的制作方法

文檔序號:6246590閱讀:373來源:國知局
可溶性i型鴨肝炎病毒3d蛋白在制備elisa試劑中的應用及其elisa試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了可溶性I型鴨肝炎病毒3D蛋白在制備ELISA試劑中的應用及其ELISA試劑盒,ELISA試劑盒含有可溶性I型鴨肝炎病毒3D蛋白包被的反應板、酶標抗體、顯色液和終止液,將該試劑盒用于檢測I型鴨病毒性肝炎抗體具有特異性強、重現(xiàn)性好、敏感度高,與用全病毒作包被抗原的ELISA試劑盒檢測的符合率高,可用于臨床樣品的檢測。
【專利說明】可溶性I型鴨肝炎病毒3D蛋白在制備EL ISA試劑中的應用 及其ELISA試劑盒

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物化學領域,具體涉及可溶性I型鴨肝炎病毒3D蛋白在制備ELISA 試劑中的應用和檢測I型鴨病毒性肝炎血清抗體的ELISA試劑盒。

【背景技術】
[0002] 我國是世界上養(yǎng)鴨數(shù)量最多的國家,鴨的飼養(yǎng)量約占世界的70%,養(yǎng)鴨業(yè)在我國 農(nóng)業(yè)經(jīng)濟中占有重要地位。鴨肝炎病毒(Duck Η印atitis Virus,DHV)可引起雛鴨的鴨病 毒性肝炎(Duck Viral Η印atitis,DVH)。DVH是一種高度致死性傳染病,以發(fā)病急、病程 短、發(fā)病率和死亡率高為特點。
[0003] 鴨肝炎病毒屬于小RNA病毒科(Picornaviridae)禽肝炎病毒屬 (Avih印atovirus),本病毒有三個血清型,分別為DHAV-UDHAV-2和DHAV-3,無免疫交叉反 應。在我國,主要流行1型鴨病毒性肝炎,給我國養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失,威脅著養(yǎng) 鴨業(yè)的健康發(fā)展。因此對DHAV等鴨源病毒進行研究具有重要的社會和經(jīng)濟意義。
[0004] 對鴨肝炎及鴨肝炎病毒進行研究,離不開鴨肝炎病毒及其抗體的檢測試劑及檢測 方法??捎糜贒HV及其抗體檢測的試劑及方法雖很多,如血凝實驗、協(xié)同凝集實驗、中和實 驗、瓊脂擴散、ELISA、熒光抗體、免疫組化、膠體金等。而目前最常用且可靠的方法仍是中和 試驗,但因其操作復雜、費時、成本高,不能用于快速檢測因而不適于基層推廣應用。ELISA 法具有操作簡便快速、特異性強、敏感性高、重復性好等優(yōu)點。早在1991年,Zhao等運用中 和實驗、瓊脂擴散試驗、ELISA法對DHV抗體進行檢測,陽性檢出率分別為18. 8%、68. 8%和 68. 8% ;楊萍萍等以氯仿去脂、0. 22 μ m孔徑濾膜過濾、凝膠柱濃縮層析方法純化得到的病 毒作為包被抗原,也建立了檢測DHV血清抗體的間接ELISA方法。但該方法在具體使用中 受到限制,一致未能推廣,其主要原因之一是檢測DHV血清抗體的間接ELISA方法對抗原純 度要求很高,但由于病毒必須依靠宿主細胞才能增殖,因此進行全病毒抗原純化時難于與 宿主蛋白分離。
[0005] 隨著對DHAV-1分子生物學研究的不斷深入,將重組表達蛋白(特別是大腸桿菌原 核表達蛋白)抗原運用到鴨肝炎病毒抗體的檢測中成為可能。大腸桿菌表達的重組蛋白抗 原易于制備和純化,且表達重組蛋白抗原的宿主細胞大腸桿菌比制備DHV抗原的宿主細胞 (如鴨胚及鴨源細胞、雞胚等)與DHV的宿主(鴨)親緣關系更遠,檢測時由于抗原純度而 產(chǎn)生非特異性的可能性也減少。但重組表達的蛋白抗原運用到鴨肝炎病毒抗體的檢測還有 一個困難,就是大腸桿菌表達易形成不溶性的包涵體,包涵體由于雜蛋白含量較低、可避免 蛋白酶降解、難溶于水等特點而使其易于分離純化。包涵體中的目標蛋白雖然其肽鏈是完 整的,但卻是非天然形式、無生物學活性的表達蛋白,包涵體的溶解非常困難,需要用強變 性劑高濃度尿素、SDS等來打斷分子內和分子間的非共價鍵、離子鍵等,為獲得有活性的蛋 白,繼而需要進行蛋白復性,而包涵體蛋白溶解后的復性不僅費時、費力,且復性率低。
[0006] DHAV具有微RNA病毒科成員相似的特點,為單股正鏈RNA,完整基因組長度約為 7. 7kb,由5'非翻譯區(qū)、一個大的開放閱讀框(ORF)、3'非翻譯區(qū)組成,ORF含有6750nt,編 碼2249AA的多聚蛋白,隨后被病毒編碼的蛋白酶切割,首先分解成PI、P2和P3產(chǎn)物,然后 PI、P2和P3(P1編碼結構蛋白、P2和P3編碼非結構蛋白)又進一步分別分解為VP0/VP1/ VP3、2A1/2A2/2A3/2B/2C和3A/3B/3C/3D蛋白,產(chǎn)生12個成熟的病毒蛋白。3D是DHAV的 一種非結構蛋白,雖然不是病毒粒子的組成成分,但在病毒生命循環(huán)中扮演著重要角色,在 合成負鏈RNA、合成復制酶過程中占有主導的作用,加之其本身的酶催化活性,使得3D蛋白 在病毒的生存過程中必不可少,因此,在病毒感染機體內可能產(chǎn)生3D抗體,但目前未見3D 蛋白是否可以作為抗原檢測DHAV抗體的ELISA方法報道;同時,獲得高純度有活性的抗原 并應用于制備ELISA檢測試劑盒,對于鴨病毒性肝炎抗體的檢測的有重要的意義和推動作 用。


【發(fā)明內容】

[0007] 有鑒于此,本發(fā)明的目的之一在于提供可溶性I型鴨肝炎病毒3D蛋白在制備檢測 I型鴨病毒性肝炎抗體ELISA試劑中的應用;本發(fā)明的目的之二在于提供檢測I型鴨病毒 性肝炎抗體ELISA試劑盒。
[0008] 為實現(xiàn)上述發(fā)明目的,本發(fā)明提供如下技術方案:
[0009] 1、可溶性I型鴨肝炎病毒3D蛋白在制備檢測I型鴨病毒性肝炎抗體的ELISA試 劑中的應用,所述可溶性蛋白的制備步驟如下:將SEQ ID N0. 3所示序列的第9?1376 位核苷酸連接于pET-32 (a) +載體的多克隆酶切位點處,然后以大腸桿菌Rosetta、BL21 或BL21 (DE3)PLYS為宿主菌,在Amp抗性的LB培養(yǎng)基中活化后,在IPTG終濃度為0. 2? 1. Ommol/L、溫度為20?39°C條件下誘導表達4?12小時,收集菌液,離心后收集菌體,將 收集的菌體用20mmol/L、pH為8. 0的Tris-HCl懸浮,然后在冰浴下超聲,破碎后進行離心, 上清用Ni2+-NTA瓊脂糖凝膠柱純化,透析,超濾得可溶性I型鴨肝炎病毒3D蛋白。
[0010] 優(yōu)選的,所述宿主菌為大腸桿菌BL21 (DE3) PLYS。
[0011] 優(yōu)選的,所述誘導表達為加入IPTG至終濃度為0. 8mmol/L,在溫度為25°C條件下 誘導表達6小時。
[0012] 優(yōu)選的,所述活化的具體步驟為:將表達菌株接種于Amp抗性的LB培養(yǎng)基中,在 37°C、120r/min條件下過夜培養(yǎng),然后將培養(yǎng)液與Amp抗性的LB培養(yǎng)基按體積比為1 :100 擴大培養(yǎng)至〇D6(?為0. 6即可。
[0013] 更優(yōu)選的,所述冰浴下超聲為在冰浴條件下超聲破碎6次,3〇SeC/次,每次間隔 30sec〇
[0014] 2、檢測I型鴨病毒性肝炎抗體的ELISA試劑盒,所述試劑盒含有可溶性I型鴨肝 炎病毒3D蛋白包被的反應板。
[0015] 優(yōu)選的,所述反應板的制備方法為將1 μ g/mL的可溶性I型鴨肝炎病毒3D蛋白按 每孔100 μ L加入反應板中,4°C過夜包被,次日PBST洗板5次,拍干即可。
[0016] 優(yōu)選的,所述試劑盒還含有酶標抗體、顯色液和終止液。
[0017] 更優(yōu)選的,所述酶標抗體為HRP標記羊抗鴨IgG或HRP標記兔抗鴨IgG,所述顯色 液為TMB,所述終止液為濃度為2mol/L的H 2S04。
[0018] 本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明公開了可溶性I型鴨肝炎病毒3D蛋白在制備檢測 I型鴨病毒性肝炎抗體ELISA試劑中的應用,且將其構建為檢測試劑盒,獲得的試劑盒具有 特異性強、重現(xiàn)性好、敏感度高,與用全病毒作包被抗原的ELISA試劑盒檢測的符合率高, 對I型鴨病毒性肝炎的診斷具有重要意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019] 為了使本發(fā)明的目的、技術方案和有益效果更加清楚,本發(fā)明提供如下附圖:
[0020] 圖1為I型鴨肝炎病毒株DHAV-H的3D基因 PCR擴增產(chǎn)物電泳結果(M :DL 2000Marker,1 :3D 基因 PCR 擴增產(chǎn)物)。
[0021] 圖2為I型鴨肝炎病毒株DHAV-H的3D基因載體構建過程中PCR鑒定和酶切 鑒定結果(A :pJET-l. 2+/DHAV-H-3D 質粒 PCR 鑒定,M :DL2000Marker,1 :PCR 產(chǎn)物;B : pJET-1. 2+/DHAV-H-3D 質粒酶切鑒定,M :DL15000Marker,1 :Kpn I /Xho I 雙酶切條帶,2 : Xho I 單酶切條帶;C :pET-32(a)+/DHAV-H-3D 質粒的 PCR 鑒定,M :DL2000Marker,1 :PCR產(chǎn) 物;D :pET32a+/DHAV-H-3D質粒的酶切鑒定,1 :Kpn I /Xho I雙酶切結果,2 :Xho I單酶 切條帶)。
[0022] 圖3為可溶性3D蛋白表達條件的優(yōu)化(Μ為低分子量蛋白質標準品;A:表達菌 的篩選,1為pET-32 (a) +空載體表達產(chǎn)物,2-4分別為pET-32 (a) +/DHAV-H-3D重組質粒轉 化Rosetta、BL21和BL21 (DE3)PLYS三種不同表達宿主菌的表達產(chǎn)物;B :誘導表達時間的 優(yōu)化,1-5依次為誘導12h、10h、8h、6h和4h的BL21 (DE3) PLYS宿主菌表達產(chǎn)物;C :誘導表 達溫度的優(yōu)化,1-6 分別為 39°C、37°C、35°C、30°C、25°C和 20°C 的 BL21 (DE3)PLYS 宿主菌 表達產(chǎn)物;D :IPTG 濃度優(yōu)化,1-5 分別為 0. 2mmol/L、0. 4mmol/L、0. 6mmol/L、0. 8mmol/L 和 1. Ommol/L的IPTG誘導的表達產(chǎn)物。
[0023] 圖4為3D蛋白Western-blot檢測及純化蛋白電泳(A為3D蛋白的免疫印跡檢測 結果,Μ為蛋白質Marker,1為3D蛋白印跡。B為SDS-PAGE檢測純化的3D蛋白,Μ為低分 子量蛋白質Marker, 1為純化的3D蛋白)。

【具體實施方式】
[0024] 下面將結合附圖,對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。實施例中未注明具體 條件的實驗方法,通常按照常規(guī)條件,例如分子克隆實驗指南(第三版,J.薩姆布魯克等 著)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。
[0025] 實施例1、克隆I型鴨肝炎病毒株DHAV-H的3D基因
[0026] I 型鴨肝炎病毒株 H(DHAV-H) (GenBank JQ301467)、E. coli DH5 α 菌種和 pET-32(a) +載體均由四川農(nóng)業(yè)大學禽病防治研究中心保存并提供。各種分子生物學試劑購 于生物試劑公司。
[0027] 根據(jù)DHAV-H的基因組序列(GenBank JQ301467)設計擴增3D基因的引物,具體引 物如下:
[0028] PI :5, -gg£gtaccgatcaagggaaagtagtgagcaag-3, (SEQ ID Ν0· 1),下劃線表示 Κρη I酶切位點;
[0029] P2 :5' -acgcctcgagtcagatcatcatgcaagctgt-3' (SEQ ID Ν0· 2),下劃線表不 Xho I酶切位點;然后將設計的引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。
[0030] 取保存的DHAV-H病毒液以滅菌PBS作5倍稀釋,添加1/100體積的雙抗(青霉 素、鏈霉素的終濃度分別為l〇〇IU/mL和100yg/mL)后于37°C溫育lh,然后接種9日齡發(fā) 育良好、無母源抗體的鴨胚,棄去24h內死亡胚,收集24?72h死亡胚的尿囊液及胚體,按 照Trizol試劑盒說明書提取病毒RNA。
[0031] 將提取的病毒RNA反轉錄合成cDNA,然后以cDNA為模板進行PCR擴增,反轉錄和 PCR擴增體系如表1所示。
[0032] 表1反轉錄和PCR反應體系
[0033]

【權利要求】
1. 可溶性I型鴨肝炎病毒3D蛋白在制備檢測I型鴨病毒性肝炎抗體的ELISA試劑中 的應用,其特征在于,所述可溶性蛋白的制備步驟如下:將SEQ ID NO. 3所示序列的第9? 1376位核苷酸連接于pET-32 (a) +載體的多克隆酶切位點處,然后以大腸桿菌Rosetta、 BL21或BL21 (DE3)PLYS為宿主菌,在Amp抗性的LB培養(yǎng)基中活化后,在IPTG終濃度為 0. 2?1. Ommol/L、溫度為20?39°C條件下誘導表達4?12小時,收集菌液,離心后收集菌 體,將收集的菌體用20mmol/L、pH為8. 0的Tris-HCl懸浮,然后在冰浴下超聲,破碎后進行 離心,上清用Ni2+-NTA瓊脂糖凝膠柱純化,透析,超濾得可溶性I型鴨肝炎病毒3D蛋白。
2. 根據(jù)權利要求1所述的應用,其特征在于:所述宿主菌為大腸桿菌BL21 (DE3)PLYS。
3. 根據(jù)權利要求1所述的應用,其特征在于:所述誘導表達為加入IPTG至終濃度為 0. 8mmol/L,在溫度為25°C條件下誘導表達6小時。
4. 根據(jù)權利要求1所述的應用,其特征在于,所述活化的具體步驟為:將表達菌株接種 于Amp抗性的LB培養(yǎng)基中,在37°C、120r/min條件下過夜培養(yǎng),然后將培養(yǎng)液與Amp抗性 的LB培養(yǎng)基按體積比為1 :100擴大培養(yǎng)至0D_為0. 6即可。
5. 根據(jù)權利要求1所述的應用,其特征在于:所述冰浴下超聲為在冰浴條件下超聲破 碎6次,30sec/次,每次間隔30sec。
6. 檢測I型鴨病毒性肝炎抗體的ELISA試劑盒,其特征在于:所述試劑盒含有可溶性I 型鴨肝炎病毒3D蛋白包被的反應板。
7. 根據(jù)權利要求6所述的ELISA試劑盒,其特征在于:所述反應板的制備方法為將 1 μ g/mL的可溶性I型鴨肝炎病毒3D蛋白按每孔100 μ L加入反應板中,4°C過夜包被,次日 PBST洗板5次,拍干即可。
8. 根據(jù)權利要求6所述的ELISA試劑盒,其特征在于:所述試劑盒還含有酶標抗體、顯 色液和終止液。
9. 根據(jù)權利要求6所述的ELISA試劑盒,其特征在于:所述酶標抗體為HRP標記羊抗 鴨IgG或HRP標記兔抗鴨IgG,所述顯色液為TMB,所述終止液為濃度為2mol/L的H 2S04。
【文檔編號】G01N33/68GK104297493SQ201410606977
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年10月31日 優(yōu)先權日:2014年10月31日
【發(fā)明者】汪銘書, 程安春, 曹乾大, 陳孝躍 申請人:四川農(nóng)業(yè)大學
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